一种不基于GC夹板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法

摘要

本发明提供了一种不基于GC夹板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，所述特定18SrDNA片段是指包含18SrDNA远离ITS序列的末端区域的片段，以Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC505的18SrDNA序列为参照，所述18SrDNA远离ITS序列的末端区域相当于其起于第1到第30位点范围内任一核苷酸止于第291位点核苷酸的片段。本发明采用特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析无需GC夹板，就可以在相同条件下获得同带有GC夹板一致的结果，因此可以节约实验成本、减少实验操作步骤。

权利要求

1.一种不基于GC 夹板策略的特定18S rDNA 片段的DGGE/TGGE 分析方法，其特征在于：所述特定18S rDNA 片段是指包含18S rDNA 远离ITS 序列的末端区域的片段，以Saccharomyces cerevisiae 标准菌株NCYC 505 的18S rDNA 序列为参照，所述18S rDNA 远离ITS 序列的末端区域相当于其起于第1 到第30 位点范围内任一核苷酸止于第291 位点核苷酸的片段；所述方法包含如下步骤：a、提取所研究样品的基因组DNA ；

b、扩增特定18S rDNA 片段；扩增引物为NS1 和fung，序列分别如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示；

c、将步骤b 扩增获得的特定18S rDNA 片段进行DGGE 或TGGE 分析；

d、割胶回收目的条带并采用同样的引物对片段进行重新扩增；所述同样的引物即步骤b 中用于扩增特定18S rDNA 片段的引物NS1 和fung；

e、对重扩增的片段进行序列测定，测定的序列提交到NCBI 上，利用Blast 在GenBank数据库中进行相似性搜索，并根据结果判定序列所对应菌株的种属；

所述的Saccharomyces cerevisiae 标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列，其NCBI登陆号为Z75578。

说明书

一种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE

分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，尤其是指一种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法。

背景技术

[0002] DGGE（变性梯度凝胶电泳）和TGGE（温度梯度凝胶电泳）是两种基于DNA片段序列差异的电泳技术，早期常用于基因突变的有效检测，目前已经成为微生物菌群多样性研究的重要手段。采用这两项技术可以分离长度相同但序列不同的DNA片段，片段的分离是依靠双链DNA在含有化学变性剂梯度（DGGE）或者温度梯度（TGGE）的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为来实现的。为了尽可能有效地检测序列当中的所有突变，通常在目标片段的一端加上一段30bp-50bp的高GC片段——由人工合成加在引物的5’端，则经过PCR扩增其产物末端就含有该片段；在进行DGGE或者TGGE分析时，该高GC区域将使得目标片段在变性梯度环境中不至于完全解链，就可以实现对所有可能的单碱基突变进行检测，此即GC夹板策略。对于菌群结构研究而言，序列各种单碱基差异的有效识别，将有助于菌群多样性的准确解析。

[0003] 相关研究表明，对于50-1000bp范围内的片段如果采用天然序列，DGGE只能检测所有可能的单碱基突变的50%[V.C. Sheffield, D.R. Cox, L.S. Lerman, R.M. Myers. Attachment of a 40-base-pair G + C-rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes[J]. Proc.Natl.Acad. Sci.USA .1989,86: 232-236.]； 而采用GC夹板策略，则可以大大提高DGGE/TGGE的突变检出率，几乎可以检测任何可能的单碱 基突变[R.M. Myers, S.G. Fischer, T. Maniatis,et al. Nearly all single base substitutions in DNA fragnents joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis [J].Nucleic Acids Res.1985,13(9):3131-3145.]，因此目前该策略已被几乎所有的DGGE或TGGE相关研究（包括菌群结构研究）所采用。然而在进行菌群结构研究时，需要同时合成包括含有GC夹板的长引物和不含GC夹板的普通引物两套引物，尤其是含有GC夹板的长引物通常在60bp以上需要较高的成本，此外有时会出现GC长引物扩增效率降低的情况。事实上，在采用某些特定的DNA片段进行DGGE或TGGE分析时，GC夹板的有无并不会影响到实验结果。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，凡采用特定18S rDNA片段进行的DGGE/TGGE分析无需GC夹板，就可以获得同带有GC夹板一致的结果，可以节约实验成本、减少实验操作步骤。

[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

[0006] 一种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，所述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA远离ITS序列的末端区域的片段，以Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列为参照，所述18S rDNA远离ITS序列的末端区域相当于其起于第1到第30位点范围内任一核苷酸止于第291位点核苷酸的片段。

[0007] 所述DGGE/TGGE分析方法包含如下步骤：

[0008] a、提取所研究样品的基因组DNA；

[0009] b、扩增特定18S rDNA片段；

[0010] c、将步骤b扩增获得的特定18S rDNA片段进行DGGE或TGGE分析；

[0011] d、割胶回收目的条带并采用同样的引物对片段进行重新扩增；所述同样的引物即步骤b中用于扩增特定18S rDNA片段的引物；

[0012] e、对重扩增的片段进行序列测定，测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GenBank数据库中进行相似性搜索并根据结果判定序列所对应菌株的种属。

[0013] 本发明采用特定18S rDNA片段进行DGGE分析时，变性剂梯度上限小于40%。

[0014] 本发明的显著优点：本发明提供了一种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，凡采用特定18S rDNA片段进行的DGGE/TGGE分析无需GC夹板，就可以获得同带有GC夹板一致的结果，可以节约实验成本、减少实验操作步骤。

附图说明

[0015] 图1是18S rDNA远离ITS序列的末端区域示意图；图中只展示出18S rDNA片段及与其相邻的ITS片段，其中黑色区带部分表示的是18S rDNA片段，白色区带部分表示的是ITS片段，双箭头区域表示的是18S rDNA远离ITS序列的末端区域。

[0016] 图2是16种真菌的18S rDNA末端区域的序列比对图谱；图中1-16表示16种菌的编号，所代表的种属详见表1，图中NS1表示引物；图中ruler标识的1-160区域为低GC含量片段，而160-280区域含有三个高GC含量片段，分别用三个方框大致标出。引物NS1的靶向位点位于18S rDNA远离ITS序列的末端区域中。虽然收集到的各真菌的18S rDNA序列在远离ITS序列的末端起始情况不一，但至少起始于第20位点，为了分析方便，部分真菌的18S rDNA序列末端以引物NS1序列补齐，这样并不会影响到其低GC含量的序列特性。

[0017] 图3是引物对NS1-fung和NS1-GCfung扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱。

[0018] 图4是引物对NS1-fung和NS1-GCfung扩增片段的DGGE分析图谱。

[0019] 图5是引物对NS1-fung重扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱；重扩增模板为图4中的20条DGGE条带的割胶回收液，图中的字母代表模板在图4中的标识。

具体实施方式

[0020] 一、本发明基于特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析原理：

[0021] 经过对目前已知的各主要真菌种属的18S rDNA序列进行分析发现，18S rDNA远离ITS序列的末端区域（参见图1）具有特殊的序列特性：其一端含有180bp左右的低GC区域，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列（Accession Number为Z75578）的1-183位点，其平均GC含量只有35%左右，并且具有极高的可变性；紧邻低GC区域的另一端含有三个排列紧凑的高GC区域，分别相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列（Accession Number为Z75578）的184-202位点、223-244位点和268-291位点，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。这样就导致18S rDNA远离ITS序列的末端区域拥有低熔解区和高熔解区，并且两者之间的熔解性质差异将十分悬殊。因此包含该末端区域的片段可以在低变性梯度的条件下利用低熔解区差异进行分离，剩下的部分相当于高熔解区则不会发生解链可以充当GC夹板。

[0022] 所述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA远离ITS序列的末端区域的片段，以Saccharomyces cerevisiae 标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列为参照，所述18S rDNA远离ITS序列的末端区域相当于其第1到第291核苷酸位点范围的片段。（基于现有的真菌18S rDNA引物，如引物对NS1-fung或引物对NS1m-NS2+10的扩增片段即属所述特定18S rDNA片段，引物序列如下：

[0023] NS1（SEQ ID NO.1）：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'；

[0024] fung（SEQ ID NO.2）：5'-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3'；

[0025] GCfung（SEQ ID NO.3）：5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3'；

[0026] NS1m（SEQ ID NO.4）：5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTC-3'；

[0027] NS2+10（SEQ ID NO.5）：5'-GAATTACCGCGGCTGCTGGC-3'）。

[0028] 所述18S rDNA远离ITS序列的末端区域的一端含有的低GC区域，其全长约180个核苷酸，需要说明的是特定18S rDNA片段并不一定要包含该低GC区域全长，以Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列为参照，所述低GC区域可以起于相当于其第1到第30位点范围内任一核苷酸。

[0029] 所述低GC区域具有极高的可变性是指对于大多数真菌种属而言，该区域片段序列是不一样的。所述三个高GC区域具有良好的保守性是指对于大多数真菌种属而言，在对应的区域均存在这样三个高GC含量的片段。

[0030] 其中对于特定的18S rDNA片段，其在DGGE/TGGE中的分离主要取决于低GC区域，因此可以采用低的变性剂梯度范围。鉴于低GC区域平均GC含量只有35%左右，因此变性剂梯度上限小于40%即可。

[0031] 其中对于特定的18S rDNA片段，与其低熔解区末端相对的的另外一末端的引物对应区域GC含量不能低于40%，以保证该末端能在低变性梯度条件下不发生解链。这一点十分容易达成。（如引物对NS1-fung或引物对NS1m-NS2+10的扩增片段即满足这一点）。

[0032] 二、本发明不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析步骤：

[0033] a、提取所研究样品的基因组DNA；

[0034] b、扩增特定18S rDNA片段；

[0035] c、将步骤b扩增获得的特定18S rDNA片段进行DGGE或TGGE分析；

[0036] d、割胶回收目的条带并采用同样的引物对片段进行重新扩增；所述同样的引物即步骤b中用于扩增特定18S rDNA片段的引物；

[0037] e、对重扩增的片段进行序列测定，测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GenBank数据库中进行相似性搜索并根据结果判定序列所对应菌株的种属。

[0038] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。

[0039] 在本实施例进行之前，以福建红曲黄酒酿造用曲中的真菌菌群的18S rDNA序列为例，对其远离ITS序列的末端区域的序列特性进行分析。实验室前期从四种典型福建红曲黄酒酿造用曲中分离出23株真菌纯菌株，经鉴定共有16种。在Silva数据库中收集这些真菌种属的18S rDNA序列，利用clustalx软件（clustalx 1.8）进行比对，截取引物NS1对应末端区域的比对结果如图2所示；对引物NS1对应末端区域的序列熔解特性进行统计分析，结果如表1所示。结合图2和表1可知，所收集到的18S rDNA序列一端含有160bp左右的低GC区域，相当于Saccharomyces cerevisiae 标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列（Accession Number为Z75578）的20-183位点，其平均GC含量只有35%左右，并且具有极高的可变性；紧邻低GC区域的另一端含有三个排列紧凑的高GC区域（图2方框部分），分别相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列（Accession Number为Z75578）的184-202位点、223-244位点和268-291位点，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。这样就导致18S rDNA远离ITS序列的末端区域拥有低熔解区和高熔解区，并且两者之间的熔解性质差异将十分悬殊。因此包含该末端区域的片段可以在低变性梯度的条件下利用低熔解区差异进行分离，剩下的部分相当于高熔解区则不会发生解链可以充当GC夹板。经过分析，目前已知的各主要真菌种属的18S rDNA序列也具有相同的特性。

[0040] 以Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列为参照，引物fung的靶向位点为351-368，也就是说引物对NS1-fung的扩增片段长度约为350bp，包含18S rDNA远离ITS序列的末端区域，因此属于所述特定18S rDNA片段。

[0041] 表1 16种真菌的18S rDNA末端区域的序列特性信息

[0042]

[0043] 注：高GC区1、2、3分别对应于图2中从左到右的三个方框区域。其中8和12两种真菌其18S rDNA序列来自GenBank数据库，其余14种真菌的18S rDNA序列均来源于Silva数据库。

[0044] 实施例1：本实施例以购于永春地区和尤溪地区的红曲为研究对象，同时采用引物对NS1-fung和NS1-GCfung（引物NS1、fung和GCfung的序列详见序列表）的扩增片段进行DGGE用以分析酒曲中的真菌菌群。

[0045] 本实施例具体步骤如下：

[0046] 1、 基因组DNA的提取

[0047] 参照文献（Heng Zhu, Feng Qu and Li-Huang Zhu. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride. Nucleic Acids Research.1993,21（2）:5279-5280.）采用氯化苄法提取酒曲中微生物的总基因组DNA。

[0048] 2、 特定18S rDNA片段的扩增

[0049] 以步骤1中提取的基因组DNA为模板，分别采用引物对NS1-fung和引物对NS1-GCfung进行特定18S rDNA片段的扩增，PCR条件均为：95℃预变性7min；94℃变性
1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环36次；72℃终延伸10min。扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，图谱如图3所示。图3中用M表示DNA Marker在第1个泳道当中；用I表示永春红曲样品，包括第2和第3泳道分别是引物对NS1-GCfung和NS1-fung的扩增产物；
用II表示尤溪红曲样品，包括第4和第5泳道分别是引物对NS1-GCfung和NS1-fung的扩增产物。由图3可知，所扩增片段条带单一，扩增效果良好。参照DNA Marker可知，图中条带分别约为350bp和390bp，分别符合NS1-fung和NS1-GCfung扩增片段的长度范围。

[0050] 3、扩增片段的DGGE分析

[0051] DGGE分析步骤参照文献（Muyzer G,Waal EC,Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl.Environ.Microbiol,1993,59: 695-700.）进行。电泳条件有经过前期的优化，最佳条件为：胶浓度为8%，变性剂梯度为20%-40%，控温为60℃，电压为75V，时间为12h。DGGE图谱如图
4所示，用I表示永春红曲样品，包括第1和第2泳道分别是引物对NS1-GCfung和NS1-fung的扩增产物；用II表示尤溪红曲样品，包括第3和第4泳道分别是引物对NS1-GCfung和NS1-fung的扩增产物。

[0052] 对于永春红曲，从图4中可知引物对NS1-GCfung和NS1-fung扩增片段的DGGE带型（泳道1和泳道2）是一致的，均有六条分明的可识别条带且位置基本一致，图中分别用a、b、c、d、e、f和a’、b’、c’、d’、e’、f’在相应位置表示引物对NS1-fung和引物对NS1-GCfung扩增产物的DGGE条带；对于尤溪红曲，从图4中可知引物对NS1-GCfung和NS1-fung扩增片段的DGGE带型（泳道3和泳道4）是一致的，均有四条分明的可识别条带且位置基本一致，图中分别用g、h、i、j和g’、h’、i’、j’在相应位置表示引物对NS1-fung和引物对NS1-GCfung扩增产物的DGGE条带。由此可知在本实施例中，采用引物对NS1-fung和引物对NS1-GCfung扩增片段获取的菌群多样性分析结果是一致的。此外，由于引物对NS1-GCfung的扩增片段比引物对NS1-fung的扩增片段多出了40bp的GC夹子部分，因此前者条带会跑得慢一点。

[0053] 4、割胶回收并进行重扩增

[0054] 对图4中的20条DGGE条带进行割胶回收，加50ul灭菌去离子水冻存过夜，解冻后取1ul回收液做为模板，采用引物对NS1-fung进行重新扩增，条件同原来一样。重扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，图谱分别如图5所示。由图5可以看出，重扩增的片段条带位置一致，带型单一，扩增效果良好。

[0055] 5、进行序列测定和分子鉴定

[0056] 对重扩增得到的片段进行测序（测序结果详见序列表），经过比对分析发现：条带a和a’、b和b’、c和c’ （序列如SEQ ID NO.8所示）、d和d’ （序列如SEQ ID NO.9所示）、e和e’、f和f’、g和g’、h和h’、i和i’、j和j’的测序结果是一致的（此外，条带a、a’、g、g’的测序结果是一致的（序列如SEQ ID NO.6所示），条带b、b’、h、h’的测序结果是一致的（序列如SEQ ID NO.7所示），条带e、e’、i和i’的测序结果是一致的（序列如SEQ ID NO.10），条带f、f’、j和j’的测序结果是一致的（序列如SEQ ID NO.11所示））。这一结果表明两对引物的扩增得到了各组除GC夹板外序列完全一致的片段，与两对引物扩增片段的DGGE带型一致的现象相符。各对应条带序列相同，说明在本实施例中采用NS1-fung引物和NS1-GCfung引物扩增片段获取的菌群结构分析结果将会是一致的。测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GenBank数据库中进行相似性搜索，结果详见表2。

[0057] 表2 种属鉴定结果

[0058]

[0059] 通过本实施例，证明了特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析，可以在无需GC夹板的情况下获得同带有GC夹板一致的结果，因此可以节约实验成本、减少实验操作。