过滤方法和装置转让专利
申请号 : CN201180028343.3
文献号 : CN102985555B
文献日 : 2016-05-25
发明人 : 帕特里克·A·马赫 , 拉杰·拉贾戈帕尔 , 夏文胜 , 周金盛 , 郭春梅
申请人 : 3M创新有限公司
摘要 :
本发明涉及一种过滤液体样品的方法，其包括使包含至少一种生物有机体的样品以至少10L/m2.h.psi的被动水体积通量通过滤膜，其中所述滤膜具有不超过1.0μm的泡点孔径，由此在膜的表面上保留至少一种生物有机体；和检测被保留在滤膜的表面上的至少一种生物有机体。
权利要求 :
1.一种过滤液体样品的方法，其包括：提供一装置，所述装置包括：
挠性的、可变形的容器，所述容器包括可密封封口和小袋，所述小袋包括限定小袋体积的小袋表面；
吸收构件，所述吸收构件安置在至少一部分所述小袋表面上；和滤膜，所述滤膜安置在与所述小袋体积流体连通的所述吸收构件的至少一部分上，其中所述滤膜在功能上连通所述吸收构件，其中所述在功能上连通使得能够产生充足的水通量梯度以汲取液体通过所述滤膜并进入所述吸收构件内；
2
使包含至少一种生物有机体的样品以至少10L/m.h.psi的被动水体积通量通过所述滤膜，其中所述滤膜具有不超过1.0μm的泡点孔径，由此在所述滤膜的表面上保留至少一种生物有机体；和检测保留在所述滤膜的表面上的所述至少一种生物有机体；
其中使所述样品通过所述滤膜包括：
添加所述样品到所述小袋体积中；
允许所述吸收构件吸收至少50％的所述样品体积。
2
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述被动水体积通量为至少32L/m .h.psi。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述滤膜的表面上原位检测所述至少一种生物有机体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中检测被保留在所述滤膜的表面上的所述至少一种生物有机体包含在执行检测分析之前从所述滤膜的表面洗脱被保留的生物有机体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述至少一种生物有机体包括以下至少一种：使所述生物有机体与特异性结合所述生物有机体的抗体组合物接触；
检测所述生物有机体的酶活性；
检测所述生物有机体的生物分析物；
检测由所述生物有机体产生的生物分析物，随后检测来自所述生物有机体的一部分核酸；
扩增来自所述生物有机体的至少一部分核酸分子；和检测所述生物有机体的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述样品通过所述滤膜之后不超过24小时内检测所述至少一种生物有机体。
说明书 :
过滤方法和装置
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2010年6月7日提交的美国临时专利申请号61/352,205的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
[0003] 本申请与2011年5月25日创建且含有1,753个字节的序列表(文件名为Sequence_Listing_66415WO003)有关，所述序列表以引用的方式并入本文中。
背景技术
[0004] 膜过滤是分析液体样品中生物有机体的存在的许多方法中的标准步骤。通常在为了例如食品安全、水质和/或环境监测和/或研究时进行这些分析。许多具有0.45μm或更小的平均孔径的膜(例如乙酸纤维素、尼龙等膜)可能能够截留细菌并且允许所截留的细菌当放置在合适的培养基上时进行生长。然而，难以从这些膜中回收细菌。尽管这些膜具有0.45μm或更小的平均孔径，但是它们典型地在膜表面具有大量的大于生物有机体的孔，且因此具有弯曲的孔结构，生物有机体可能被截留在其中。
发明内容
[0005] 一方面，本发明提供一种过滤液体样品的方法。通常，所述方法包括使包含至少一2
种生物有机体的样品以至少10L/m.h.psi的被动水体积通量通过滤膜，其中滤膜具有不超过1.0μm的泡点孔径，由此在膜表面上保留至少一种生物有机体；且检测保留在滤膜表面上的至少一种生物有机体。
种生物有机体的样品以至少10L/m.h.psi的被动水体积通量通过滤膜，其中滤膜具有不超过1.0μm的泡点孔径，由此在膜表面上保留至少一种生物有机体；且检测保留在滤膜表面上的至少一种生物有机体。
[0006] 在某些实施例中，可在滤膜上原位检测生物有机体，而在其它实施例中，可在检测之前将生物有机体从滤膜移出。由此，在一些实施例中，所述方法包括洗脱来自滤膜的所保留的生物有机体。
[0007] 在一些实施例中，所述方法可进一步包括量化至少一种生物有机体。
[0008] 在一些实施例中，所述方法可包括在样品通过滤膜之后不超过24小时内检测和/或量化生物有机体。
[0009] 在一些实施例中，所述液体样品可包括例如食品样品、环境样品或水样品。
[0010] 在一些实施例中，所述滤膜可以与吸收构件在功能上进行连通而提供。
[0011] 在一些实施例中，所述方法可包括减少至少50％的液体样品体积。
[0012] 另一方面，本发明提供一种过滤装置。通常，所述过滤装置包括小袋，所述小袋具有限定小袋体积的小袋表面；吸收构件，所述吸收构件安置在小袋表面的至少一部分上；和滤膜，所述滤膜安置在与小袋体积流体连通的吸收构件的至少一部分上。
[0013] 本发明的上述发明内容并不打算描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了示例性实施例。在整个申请的若干地方，通过实例清单提供了指导，所述实例可以按多种组合方式来使用。在各种情形下，所列举的清单仅仅作为代表性群组，而不应被理解为排他性清单。
附图说明
[0014] 图1.R1933-18(新生的，0.23μm)膜的SEM图像。1A敞开面(5000x)，1B致密面(5000x)，1C横截面(500x)。
[0015] 图2.R1933-7(新生的，0.34μm)膜的SEM图像。2A敞开面(5000x)，2B致密面(5000x)，2C横截面(500x)。
[0016] 图3.R1933-8B(新生的，0.51μm)膜的SEM图像。3A敞开面(5000x)，3B致密面(5000x)，3C横截面(500x)。
[0017] 图4.R1901-11(新生的，0.74μm)膜的SEM图像。4A敞开面(5000x)，4B致密面(5000x)，4C横截面(500x)。
[0018] 图5.PAN膜(10,000x)的SEM图像。5A PAN-1(0.613μm)，5BPAN-2(0.531μm)，5C PAN-3(0.367μm)。
[0019] 图6.MF-密理博型(MF-Millipore Type)HAWP(0.4μm)(6A)和艾瑟泊(Isopore)聚碳酸酯滤器(0.4μm)(6B)的SEM图像(10,000x)。两种膜的图像都是接收样品的侧面的图像。
[0020] 图7.过滤装置的一个实施例的透视示意图。
[0021] 图8.过滤装置的一个实施例的示意性侧视图。
[0022] 图9.过滤装置的一个实施例的示意性侧视图。
[0023] 图10A.过滤装置的一个实施例的示意性侧视图。
[0024] 图10B.具有样品收回端口的过滤装置的一个实施例的示意性侧视图。
[0025] 图11.根据本发明的过滤装置的一个实施例的分解侧视图。
[0026] 图12.图11的组装过滤装置的平面图。
[0027] 图13.根据本发明，具有支撑构件的过滤装置的一个实施例的横截面示意性侧视图。
具体实施方式
[0028] 本发明描述可分析液体样品中一或多种生物有机体的存在的方法。取决于实行方法的具体背景，所述方法可包括使液体样品通过过泡点孔径不超过1.0μm的膜而同时仍提供相对较高的水体积通量。
[0029] 任选地，所述方法可进一步提供使样品的相对较高百分比的生物有机体保留在膜表面上而不是嵌入膜的孔中。由此，在一些实施例中，所述方法进一步提供保留在膜表面上的相对较高百分比的生物有机体可容易地从膜表面回收。在其它情况下，所述方法可进一步提供使液体样品的体积显著减少。
[0030] 以下术语应具有指定含义。
[0031] “主动”是指以机械力(例如真空)驱动液体样品移动通过滤膜的过滤方法。
[0032] “生物分析物”是指出现在有机体中或由有机体形成的分子或其衍生物。举例来说，生物分析物可包括(但不限于)氨基酸、核酸、多肽、蛋白质、聚核苷酸、脂质、磷脂、糖类、多糖中的至少一种或其两种或两种以上的任意组合。示例性生物分析物可包括(但不限于)代谢物(例如葡萄球菌肠毒素)、过敏原(例如花生过敏原)、激素、毒素(例如芽孢杆菌(Bacillus)、腹泻毒素、黄曲霉毒素等)、RNA(例如mRNA、总RNA、tRNA等)、DNA(例如质粒DNA、植物DNA等)、标记蛋白、抗体、抗原或其两种或两种以上的任意组合。
[0033] “泡点孔径”是指膜的计算平均孔径。泡点孔径是基于液体通过表面张力和毛细管力被保持在滤器的孔内这一事实。克服表面张力并将液体赶出孔所需的最小压力是孔直径的量度。计算泡点孔径的方程是：
[0034]
[0035] 其中：
[0036] P＝泡点压力；
[0037] σ＝液体的表面张力(对水来说，72达因/厘米)；
[0038] θ＝液-固接触角(对水来说，通常假定为0)；和
[0039] D＝孔的直径。
[0040] “洗脱”和其变型是指使用低严紧性物理方法，诸如重力、手动振荡或旋涡，从滤膜移出生物有机体。
[0041] “截留”是指被滤膜捕获的生物有机体无法轻易从滤膜洗脱下来，因为例如生物有机体被捕获在膜中的空间内。
[0042] “被动”是指无机械力(例如真空)驱动液体样品移动通过滤膜的过滤。被动过滤法包括使用例如重力和/或通过吸收剂吸收流体以驱动流体移动通过滤膜的过滤。
[0043] “回收”是指在用于检测和/或进一步分析的条件下从滤膜洗脱生物有机体。
[0044] “保留”和其变型是指生物有机体在过滤后安置在滤膜表面上且易于从滤膜洗脱。
[0045] “水体积通量”是指每单位时间每单位压力下通过单位面积膜的流体体积。除非另外指出，否则水体积通量在本文中以每小时每磅每平方英寸压力下通过1平方米膜的液体样品的升数表示。
[0046] 术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或两个以上的组合。
[0047] 当术语“包括”和其变型出现在说明书和权利要求书中时，这些术语不具有限制性含义。
[0048] 除非另外特别说明，否则“一”、“所述”和“至少一个”可互换使用且意指一个或超过一个。
[0049] 另外，本文通过端点表述的数值范围包括所述范围内包含的所有数值(例如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
[0050] 许多市面有售的膜用于从液体样品过滤和移出生物有机体。膜过滤技术众所周知。然而，现有市面有售的膜典型地具有弯曲的通道且在表面上具有大量的大型孔。这种特征使得难以回收被过滤的生物有机体，这是因为被捕获的生物有机体可能卡在滤膜的孔中，且因此难以从滤器完整移出以致不可分析被捕获的生物有机体。
[0051] 这里，我们描述可使用滤膜过滤液体样品以致两个竞争参数中的每一者都得到满足的方法。首先，所述方法包括在滤膜表面上保留生物有机体，以便所保留的生物有机体可容易地从膜上洗脱以供进一步分析。然而，被设计用于捕获高百分比生物有机体的现有方法是使用具有极小平均孔径的膜来进行的。这必定限制水通量体积，从而限制给定体积的液体样品的处理速率。由此，本文所述的方法进一步提供比在过滤方法中目前所观测到的水通量体积更大的水通量体积。
[0052] 在一些情况下，所述方法可包括过滤例如环境测试、水质测试、水处理测试和/或经修复和/或恢复的供水管的测试所需的大体积(例如很多升)液体样品。举例来说，当使用现有方法来测试经修复和/或恢复的水管中的水质时，可能需要两天或三天来确定水质是否足以恢复供水。然而，使用本文所述的方法可快速确认水质以便可在24小时内恢复供水。
[0053] 在其它情况下，所述方法可包括过滤强化食品样品、食品加工水样品和/或饮用水样品。
[0054] 本文所述的方法可在至少两个方面减少所述测试所需的时间。第一，所述方法允许过滤且分析大体积的液体样品。第二，所述方法导致相当大百分比的被捕获生物有机体保留在滤膜表面上以致其更容易通过洗脱回收。
[0055] 在其它应用中，所述方法可包括相对较快地过滤更小体积的液体样品(例如小于1升)。又在这些申请中，相对高的水通量体积与在滤膜上保留生物有机体以易于回收的组合促进了更快和/或更简单地过滤液体样品。在一些这些应用中，可使用简单的重力将生物有机体从滤膜驱逐来回收生物有机体。在其它应用中，可显著浓缩液体样品-即小于总液体体积的部分量可通过滤膜。因为相当大百分比的生物有机体被保留在滤膜上而不是被截留在滤膜中，所以可在残余液体体积中回收原始样品中更大百分比的生物有机体，从而浓缩生物有机体以供进一步鉴定和/或其它分析。
[0056] 通常，所述方法包括使包含至少一种生物有机体的样品通过泡点孔径不超过1.0μm的滤膜，从而在膜表面上保留至少一种生物有机体。所述方法包括使样品通过滤膜，
2
对于被动过滤，水体积通量为至少10L/m.h.psi，对于主动过滤，水体积通量为至少100L/
2
m.h.psi。所述方法进一步包括检测保留在滤膜表面上的至少一种生物有机体。
2
对于被动过滤，水体积通量为至少10L/m.h.psi，对于主动过滤，水体积通量为至少100L/
2
m.h.psi。所述方法进一步包括检测保留在滤膜表面上的至少一种生物有机体。
[0057] 液体样品可从任何合适的来源获得，且可包括水样。示例性水样包括环境样品(例如湖、河、溪、海洋、池塘等)、供水/水处理样品(例如供水管、水处理设施、水处理排放、下水道等)、饮用水样品(例如瓶装水、井水)或食品样品(例如液体食品、通过例如均质化进行处理的食品样品等)。样品可在保持收集原样下进行过滤，或在过滤和进一步分析之前处理到一定程度。
[0058] 生物有机体可为可能需要在液体样品中进行检测和/或量化的任何原核或真核有机体。因此，生物有机体可包括例如寄生虫或微生物，诸如单细胞真核有机体(例如酵母菌)、藻类或细菌。示例性微生物包括例如大肠型细菌。示例性细菌属包括例如埃希氏菌属(Escherichia spp.)(例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)(例如产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠球菌属(Enterococcus spp.)(例如粪肠球菌(E.faecalis)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)(例如弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、志贺杆菌属(Shigella spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)(例如肠道沙门氏菌(S.enterica)、李斯特氏菌属(Listeria spp)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)等。
[0059] 虽然可使用泡点孔径大于1.0μm的滤膜执行所述方法，但是滤膜可具有不超过1.0μm的泡点孔径。示例性滤膜的泡点孔径可为例如不超过0.95μm、不超过0.9μm、不超过0.85μm、不超过0.8μm、不超过0.75μm、不超过0.7μm、不超过0.6μm或不超过
0.5μm。可通过例如需要检测的生物有机体的尺寸、待过滤的样品体积和滤膜的孔深来至少部分地确定合适的泡点孔径。在多区域膜的背景下，测量为保留生物有机体而放置的区域的的泡点孔径。
0.5μm。可通过例如需要检测的生物有机体的尺寸、待过滤的样品体积和滤膜的孔深来至少部分地确定合适的泡点孔径。在多区域膜的背景下，测量为保留生物有机体而放置的区域的的泡点孔径。
[0060] 示例性滤膜可由例如TIPS(热致相分离)法、SIPS(溶剂致相分离)法、VIPS(蒸汽致相分离)法、拉伸法、径迹蚀刻或电纺丝(例如PAN纤维膜)制造。合适的膜材料包括例如聚烯烃(例如聚乙烯和/或聚丙烯)、乙烯-氯三氟乙烯共聚物、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、聚砜、聚醚砜、聚偏二氟乙烯(PVDF)、纤维素酯和/或它们的组合。
[0061] 合适的膜可被表征为多孔膜或纳米纤维膜。纳米纤维滤膜的纤维直径可为小于5μm，例如小于1μm。纳米纤维膜可由例如聚丙烯腈、聚偏二氟乙烯、纤维素酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩丁醛和/或它们的组合制备。
[0062] 可制备某些TIPS聚烯烃膜以使其在膜结构中具有单一的均匀区域，每个区域具有不同的孔微结构。在其它情况下，可将TIPS膜制备成包括两个或两个以上区域的多区域膜，每个区域具有不同的孔微结构。多区域TIPS膜可含有不同区域，或者可具有在两个另外不同区域之间的过渡区域。
[0063] 示例性滤膜包括膜，且制造示例性滤膜的方法描述在：例如美国专利号4,539,256、美国专利号4,726,989、美国专利号4,867,881、美国专利号5,120,594、美国专利号5,260,360、国际专利公开号WO2010/078234、国际专利公开号WO2010/071764、2010年
6月4日提交的名为“经涂覆的多孔材料(Coated Porous Materials)”的美国临时专利申请号61/351,441和2010年6月4日提交的名为“制造经涂覆的多孔材料的方法(Process for Making Coated Porous Materials)”的美国临时专利申请号61/351,447。
6月4日提交的名为“经涂覆的多孔材料(Coated Porous Materials)”的美国临时专利申请号61/351,441和2010年6月4日提交的名为“制造经涂覆的多孔材料的方法(Process for Making Coated Porous Materials)”的美国临时专利申请号61/351,447。
[0064] 在一些情况下，虽然可以小于100L/m2.h.psi的水通量体积执行所述方法，但是主2
动过滤可提供至少100L/m.h.psi的水通量体积。使用主动过滤的示例性水通量体积值包
2 2 2
括(但不限于)至少250L/m.h.psi、至少500L/m.h.psi、至少750L/m.h.psi、至少1000L/
2 2 2 2
m.h.psi、至少1250L/m.h.psi、至少1500L/m.h.psi、至少1750L/m.h.psi、至少2000L/
2 2 2
m.h.psi、至少2500L/m.h.psi或至少3000L/m.h.psi。最大水通量率可由用于驱动液体样品移动通过滤膜的机械力的最大能力、滤膜的强度和/或耐久性以及滤膜的泡点孔径来至少部分地决定。
动过滤可提供至少100L/m.h.psi的水通量体积。使用主动过滤的示例性水通量体积值包
2 2 2
括(但不限于)至少250L/m.h.psi、至少500L/m.h.psi、至少750L/m.h.psi、至少1000L/
2 2 2 2
m.h.psi、至少1250L/m.h.psi、至少1500L/m.h.psi、至少1750L/m.h.psi、至少2000L/
2 2 2
m.h.psi、至少2500L/m.h.psi或至少3000L/m.h.psi。最大水通量率可由用于驱动液体样品移动通过滤膜的机械力的最大能力、滤膜的强度和/或耐久性以及滤膜的泡点孔径来至少部分地决定。
[0065] 在一些情况下，虽然可以小于10L/m2.h.psi的水通量体积执行所述方法，但是被2
动过滤可提供至少10L/m.h.psi的水通量体积。使用主动过滤的示例性水通量体积值包
2 2 2 2
括例如至少10L/m.h.psi、至少20L/m.h.psi、至少25L/m.h.psi、至少32L/m.h.psi、至
2 2 2 2 2
少50L/m.h.psi、至少60L/m.h.psi、至少75L/m.h.psi、至少88L/m.h.psi、至少95L/m.
2
h.psi或至少100L/m.h.psi。最大被动水通量率可由滤膜的泡点孔径和/或由例如吸收材料产生的通量梯度至少部分地决定，所述吸收材料与滤膜呈流体连通放置以便能够汲取至少一部分流体样品通过滤膜。
动过滤可提供至少10L/m.h.psi的水通量体积。使用主动过滤的示例性水通量体积值包
2 2 2 2
括例如至少10L/m.h.psi、至少20L/m.h.psi、至少25L/m.h.psi、至少32L/m.h.psi、至
2 2 2 2 2
少50L/m.h.psi、至少60L/m.h.psi、至少75L/m.h.psi、至少88L/m.h.psi、至少95L/m.
2
h.psi或至少100L/m.h.psi。最大被动水通量率可由滤膜的泡点孔径和/或由例如吸收材料产生的通量梯度至少部分地决定，所述吸收材料与滤膜呈流体连通放置以便能够汲取至少一部分流体样品通过滤膜。
[0066] 在一些实施例中，虽然可实行所述方法以使样品中的生物有机体少于30％被滤膜所保留，但是所述方法导致样品中的生物有机体的至少30％被滤膜保留。在示例性方法中，样品中的生物有机体的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％被滤膜所保留。
[0067] 如以上所注释，一些实施例可包括例如与大型装置中的吸收构件在功能上连通的滤膜。所述装置10的实施例显示在图7至图13中。在所述实施例中，吸收构件16可产生充足的水通量梯度以汲取液体通过滤膜并进入吸收构件16内。在一些实施例中(例如，如图7中所示)，滤膜可覆盖吸收构件16的至少一部分，使得进入吸收构件16中的液体的流量要求液体流过滤膜。按这种方式，液体样品中的生物有机体可被滤膜保留。装置10进一步包括容器12，所述容器具有任选的封口13。容器12可包括挠性的、可变形的容器12(诸如ZIPLOK牌贮存袋)，其例如具有由联锁组件(13a和13b)构成的可密封封口13。
[0068] 在图8所示的一个特定实施例中，吸收构件16可安置在装置10中形成的小袋18的表面上。因此，小袋18可充当液体样品24的容器。吸收构件16可任选地包括非织造背衬20以辅助形成密封件26，从而使吸收构件16固定在容器12的一部分上。例如，密封件26可经由粘合剂或通过热粘合形成。滤膜14可安置在吸收构件16的敞开小袋表面上(即面朝小袋18的内部体积)。在使用中，如图9和图10A、图10B所说明，可对装置10进行定向以使滤膜14通常位于垂直方向。因此，在一些情况下，被滤膜14所保留的生物有机体可由于重力而从滤膜14洗脱下来。由此，因为液体被吸收构件16吸收，所以液体样品24中的生物有机体得到浓缩。当液体样品24达到与生物有机体的所需浓缩水平对应的体积时，浓缩的液体样品24(图10A)中的一部分可使用例如注射器22从装置10移出。经浓缩的液体样品的移出部分随后可进行进一步分析。
[0069] 在一些实施例中，经浓缩的液体样品24(图10B)的一部分可使用例如样品端口30从装置10移出以得到经浓缩的液体样品24。样品端口30可包括弹性可变形的分隔膜
40(例如购自迈克罗尼北美(Micronic North America)，LLC；麦克默里(McMurray)，宾夕法尼亚州(PA)的分离帽TPE插入式帽)，其包括缝隙42，可通过此缝隙插入吸液管尖端(未图示)以回收经浓缩的液体样品24的全部或一部分。在一些实施例(未图示)中，样品端口可包括阀门，所述阀门能开启以通过例如重力流释放经浓缩的液体样品的一部分(或全部)。
40(例如购自迈克罗尼北美(Micronic North America)，LLC；麦克默里(McMurray)，宾夕法尼亚州(PA)的分离帽TPE插入式帽)，其包括缝隙42，可通过此缝隙插入吸液管尖端(未图示)以回收经浓缩的液体样品24的全部或一部分。在一些实施例(未图示)中，样品端口可包括阀门，所述阀门能开启以通过例如重力流释放经浓缩的液体样品的一部分(或全部)。
[0070] 图13显示根据本发明的装置10的另一个实施例。在这个实施例中，用于滤膜14的材料经配置以形成安置在容器12内的小袋18(例如除了两片滤膜材料的边缘的一部分，将边缘密封在一起)(例如ZIPLOK袋)。小袋18具有由滤膜14限定的内部体积。任选地，小袋18可进一步包括外部非织造背衬20以便为滤膜14提供结构支撑。将吸收构件16放置在由滤膜14形成的小袋18外面的容器12的一部分中。优选地，吸收构件16紧接小袋18。更优选地，吸收构件16与小袋18外面的滤膜14的至少一部分接触。甚至更优选地，吸收构件16安置在小袋18外面的滤膜14的至少一部分上。在一些实施例中，吸收构件16安置在滤膜与非织造背衬20之间。任选地，装置10可进一步包括支撑构件28(例如具有基座的模制塑料棒)，其可用于在添加液体样品之前、期间和之后为相对挠性的容器12提供结构支撑。在使用中，当将液体样品(未图示)放置入小袋18中时，可固持装置10(例如手动或经由支撑构件)。在液体样品的一部分通过滤膜14之后，可使用例如吸液管从小袋18移出经浓缩的液体样品(未图示)。
[0071] 图13所说明的装置的替代性实施例(未图示)包括如下装置，其中吸收构件安置在小袋的内部体积中且样品沉积进入小袋外面的容器内。在使用时，样品沉积进入容器内而不是进入小袋中。在液体样品的至少一部分已通过滤膜之后，在容器中所剩余的液体样品的全部或一部分可从容器中收回，以便使用本文所公开的任何检测方法来检测生物有机体。
[0072] 吸收构件16可由任何合适的液体吸收材料构成。在一些情况下，吸收构件24可包括水凝胶。如本文所用，术语“水凝胶”是指亲水性的且用极性溶剂溶胀或能够用极性溶剂溶胀的聚合材料。合适的水凝胶包括交联水凝胶、溶胀水凝胶和干燥或部分干燥的水凝胶。
[0073] 合适的水凝胶包括：如美国专利申请公开号US2004/0157971中所述的聚合物，其包含烯系不饱和含羧基单体和由羧酸、乙烯基磺酸、纤维素单体、聚乙烯醇中选出的共单体；如美国专利申请公开号US 2006/0062854中所述的聚合物，其包括淀粉、纤维素、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚丙二醇和它们的共聚物；国际专利公开号WO 2007/146722中所述的水凝胶和由其制造的聚合物微珠；如美国专利号6,861,067中所述的聚合物，其包含具有由聚乙二醇、聚丙二醇和丙二醇中选出的至少一种醇的聚氨基甲酸酯预聚物；和如美国专利号6,669,981中所述的聚合物，其包含由多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、胶原蛋白和明胶中选出的亲水性聚合物，所述专利的公开内容皆以全文引用的方式并入本文中。其它合适的水凝胶包括琼脂、琼脂糖和聚丙烯酰胺水凝胶。在某些实施例中，水凝胶可包括交联聚丙烯酸钠盐/共聚物、聚丙烯酰胺共聚物、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、交联羧甲基纤维素、聚乙烯醇共聚物、交联聚氧化乙烯、聚丙烯腈的淀粉接枝共聚物或它们的任何组合。
[0074] 水凝胶可包括成型水凝胶。成型水凝胶包括成型为例如珠状、片材、带材和纤维的水凝胶。
[0075] 水凝胶可进一步包括支撑型水凝胶。支撑型水凝胶包括安置在微珠、非织造片材、纤维(例如吹塑微纤维)等之上和/或其中的水凝胶。
[0076] 在一些实施例中，尽管可在减少样品体积至更低含量的情况下实行所述方法，但经浓缩的样品的体积可小于添加至装置中的样品体积的50％。体积减少的示例性程度可包括例如经浓缩的样品的体积小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于
2％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％、小于0.09％、小于0.08％、小于0.07％、小于0.06％、小于0.05％、小于0.04％、小于0.03％、小于0.02％或小于0.01％的添加至装置中的样品体积。在一个示例性实施例中，最初的225ml样品可减少至约2ml体积，因此经浓缩的样品具有添加至装置中的液体样品体积的约0.09％的体积。
2％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％、小于0.09％、小于0.08％、小于0.07％、小于0.06％、小于0.05％、小于0.04％、小于0.03％、小于0.02％或小于0.01％的添加至装置中的样品体积。在一个示例性实施例中，最初的225ml样品可减少至约2ml体积，因此经浓缩的样品具有添加至装置中的液体样品体积的约0.09％的体积。
[0077] 所述方法进一步包括检测被滤膜保留的至少一种生物有机体。在此背景下，被滤膜保留的生物有机体包括与滤膜接触的生物有机体以及随后从滤膜回收的生物有机体。生物有机体可通过任何合适的方法从滤膜回收。通过实行本文所述的方法保留在滤膜上的生物有机体的一个特征是，可使用诸如重力、手动振荡和/或旋涡等相对低严紧性物理方法从滤膜移出所保留的生物有机体。因此，例如，在液体样品体积减小的刚刚描述的实施例中，在体积减小的液体样品中浓缩的生物有机体可被认为回收自滤膜，即使生物有机体不在滤膜中或滤膜上驻留任何可辨别的时间长度。
[0078] 由此，在一些实施例中，可原位检测所保留的生物有机体而使其仍与滤膜接触。然而，在其它实施例中，可从滤膜移出保留的生物有机体，且可检测这样移出的生物有机体。不管原位检测抑或在从滤膜回收之后检测，均可使用任何合适的方法(包括那些对微生物检测领域的普通技术人员为惯例的)来检测生物有机体。合适的原位检测方法包括例如检测生物有机体与抗体组合物(例如单克隆抗体或多克隆抗体)的特异性结合。其它检测方法可包括例如检测由生物有机体产生的生物分析物的存在。示例性检测方法包括(但不限于)检测扩增(通过例如PCR)的生物有机体特异性核苷酸序列、核苷酸测序、酶分析(例如脱氢酶、葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、蛋白酶等的检测)、生物发光分析(例如ATP/ADP/AMP的检测)、蛋白质/肽、光谱和/或荧光(例如NAD/NADH、FAD/FADH、自发荧光的检测)的检测等。对于回收自滤膜的生物有机体的合适的检测方法包括适于原位检测生物有机体的方法，且进一步包括检测培养物中的生长。
[0079] 在一些情况下，所述方法可进一步包括量化被滤膜保留的生物有机体。又在此背景下，被滤膜保留的生物有机体包括与滤膜接触的生物有机体以及随后从滤膜回收的生物有机体。
[0080] 由此，在一些实施例中，可原位量化所保留的生物有机体而使其仍与滤膜接触。然而，在其它实施例中，可从滤膜移出所保留的生物有机体且可量化这样移出的生物有机体。不管原位量化还是在从滤膜回收之后量化，均可使用任何合适的方法(包括那些对微生物检测领域的普通技术人员为惯例的)来量化生物有机体，诸如菌落形成单位(cfu)检测、最可能数(MPN)分析、ATP生物发光、酶分析、PCR、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量PCR等。
[0081] 在从滤膜回收之后检测和/或量化生物有机体的实施例中，尽管可在从滤膜洗脱小于50％所保留的生物有机体之后执行所述方法，但是所述方法包括从滤膜洗脱至少50％所保留的生物有机体。在示例性方法中，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少
99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的所保留的生物有机体从滤膜洗脱。
99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的所保留的生物有机体从滤膜洗脱。
[0082] 在一些情况下，可通过重新定位滤膜以便重力驱逐所保留的生物有机体且从而从滤膜洗脱而对所保留的生物有机体进行洗脱。在其它情况下，可通过手动振荡滤膜以从滤膜驱逐所保留的生物有机体来洗脱所保留的生物有机体。在其它情况下，可通过使滤膜旋涡以从滤膜驱逐所保留的生物有机体来洗脱所保留的生物有机体。在其它情况下，可通过如下文实例12中所述的泡沫洗脱从滤膜洗脱生物有机体。
[0083] 某些现有方法提供最多约30％的生物有机体(例如细菌)回收率，且因此不能提供与使用本文所述方法观测到的同样程度的回收率。
[0084] 在不希望被任何特定理论束缚的情况下，因为即使在滤膜具有小于细菌尺寸的孔等级时，微孔滤膜仍然在膜表面上具有大量的大型孔，所以某些现有方法可能无法提供令人满意的生物有机体回收率。大型孔被认为当减少样品体积时截留生物有机体而不是保留生物有机体。
[0085] 另外，例如细菌在滤膜表面上的非特异性结合造成问题。这是因为(至少部分地)更快速地减少液体样品体积的一种方法为提供吸收液体样品的滤膜更大的表面积。然而，增加表面也就是增加生物有机体可能非特异性结合的表面积。研究了许多替代方案。然而，没有一种膜能够提供生物有机体的高保留率(和因此的高回收率)和良好的水通量体积(例如，在例如小于1小时内足以将225ml浓缩到2-3ml)。
[0086] 在某些实施例中，所述方法可使样品体积减少约98.6％至约99.2％，同时允许回收原始样品中至少70％的生物有机体。
[0087] 对于包括不连续步骤的本文所公开的任何方法，可以任何可行的顺序进行所述步骤。此外，适当时，可同时进行两个或两个以上步骤的任何组合。
[0088] 通过以下实例说明本发明。应当理解，特定实例、材料、量和程序应根据如本文中所阐述的本发明的范围和精神进行广义地解释。
[0089] 实例
[0090] 实例1
[0091] TIPS膜的制备
[0092] R1901-11膜
[0093] 如国际专利公开号WO2010/078234中所述，使用40mm双螺杆挤出机和25mm双螺杆挤出机来制备多区域微孔聚丙烯膜(文中指定为R1901-11)。来自两台挤出机的熔体流通过多歧管模铸成单片。
[0094] 熔体流1。将聚丙烯(PP)树脂颗粒(来自太阳石油化学品公司(Sunoco Chemicals)，费城(Philadelphia)，宾夕法尼亚州(PA)的F008F)和成核剂(MILLAD 3988，米利肯化学品公司(Milliken Chemical)，斯帕坦堡(Spartanburg)，南卡罗来那州(SC))引入维持在250rpm的螺杆速度下的40mm双螺杆挤出机中。将矿物油稀释剂(SUPERLA白色矿物油31(Mineral Oil SUPERLA White 31)，雪佛龙公司(Chevron Corp.)，圣拉蒙市(San Ramon)，加州(CA))自贮液器分别馈入挤出机中。PP/稀释剂/成核剂的重量比是29.25％/70.7％/0.05％。总挤出速率为约30lb/hr(13.6kg/hr)，且设置挤出机的8个区域以提供自271℃至177℃的下降温度特征。
[0095] 熔体流2。将PP树脂颗粒和MILLAD 3988引入维持在125rpm的螺杆速度下的25mm双螺杆挤出机中。将矿物油稀释剂自贮液器分别馈入挤出机中。PP/稀释剂/成核剂的重量比是29.14％/70.7％/0.16％。总挤出速率为约6lb/hr(2.72kg/hr)，且设置挤出机的8个区域以提供自271℃至177℃的下降温度特征。
[0096] 将多区域膜从维持在177℃下的多歧管模浇铸到图案化浇铸轮上。浇铸轮的温度维持在60℃下且浇铸速度为3.35m/min(11ft/min)。在溶剂中在线洗涤所得膜以移除膜中的矿物油且随后风干。继而将经洗涤的膜以纵向和横向1.8×2.80(分别在99℃和154℃下)定向。
[0097] R1901-8B膜
[0098] 如国际专利公开号WO2010/078234中所述，使用40mm双螺杆挤出机和25mm双螺杆挤出机来制备多区域微孔聚丙烯膜(文中指定为R1901-8B)。来自两台挤出机的熔体流通过多歧管模铸成单片。
[0099] 熔体流1。将聚丙烯(PP)树脂颗粒(来自太阳石油化学品公司，费城，宾夕法尼亚州的F008F)和成核剂(MILLAD 3988，米利肯化学品公司，斯帕坦堡，南卡罗来那州)引入维持在250rpm的螺杆速度下的40mm双螺杆挤出机中。将矿物油稀释剂(白色矿物油SUPERLA 31，雪佛龙公司，圣拉蒙市，加州)自贮液器分别馈入挤出机中。PP/稀释剂/成核剂的重量比是29.254％/70.7％/0.045％。总挤出速率为约27lb/hr(12.2kg/hr)，且设置挤出机的8个区域以提供自271℃至177℃的下降温度特征。
[0100] 熔体流2。将PP树脂颗粒和MILLAD 3988引入维持在125rpm的螺杆速度下的25mm双螺杆挤出机中。将矿物油稀释剂自贮液器分别馈入挤出机中。PP/稀释剂/成核剂的重量比是28.146％/70.7％/0.154％。总挤出速率为约9lb/hr(4.08kg/hr)，且设置挤出机的8个区域以提供自271℃至177℃的下降温度特征。
[0101] 将多区域膜自维持在177℃下的多歧管模浇铸到图案化浇铸轮上。浇铸轮的温度维持在60℃且浇铸速度为3.52m/min(11.54ft/min)。在溶剂中在线洗涤所得膜以移除矿物油稀释剂且随后风干。继而将经洗涤的膜以纵向和横向1.6×2.85(分别在99℃和154℃下)定向。
[0102] R1933-7膜
[0103] 如国际专利公开号WO2010/078234中所述，使用40mm双螺杆挤出机和25mm双螺杆挤出机来制备多区域微孔聚丙烯膜(文中指定为R1933-7)。来自挤出机的两股熔体流通过多歧管模铸成单片。
[0104] 熔体流1。将聚丙烯(PP)树脂颗粒(来自太阳石油化学品公司，费城，宾夕法尼亚州的F008F)和成核剂(MILLAD 3988，米利肯化学品公司，斯帕坦堡，南卡罗来那州)引入维持在175rpm的螺杆速度下的40mm双螺杆挤出机中。矿物油稀释剂(Kaydol 350矿物油，布伦塔格大湖LCC(Brenntag Great Lakes LCC)，圣保罗(St.Paul)，明尼苏达州(MN))自贮液器分别馈入挤出机中。PP/稀释剂/成核剂的重量比是34.247％/65.7％/0.053％。总挤出速率为约32lb/hr(14.5kg/hr)，且设置挤出机的8个区域以提供自271℃至177℃的下降温度特征。
[0105] 熔体流2。将PP树脂颗粒和MILLAD 3988引入维持在150rpm的螺杆速度下的25mm双螺杆挤出机中。矿物油稀释剂自贮液器分别馈入挤出机中。PP/稀释剂/成核剂的重量比是29.14％/70.7％/0.16％。总挤出速率为约6lb/hr(2.72kg/hr)，且设置挤出机的8个区域以提供自254℃至177℃的下降温度特征。
[0106] 将多区域膜自维持在177℃下的多歧管模浇铸到图案化浇铸轮上。浇铸轮的温度维持在71℃下且浇铸速度为5.79m/min(19.00ft/min)。在溶剂中在线洗涤所得膜以移除矿物油稀释剂且随后风干。继而将经洗涤的膜以纵向和横向1.5×2.70(分别在99℃和160℃下)定向。
[0107] R1933-18膜
[0108] 如国际专利公开号WO2010/078234中所述，使用40mm双螺杆挤出机和25mm双螺杆挤出机来制备多区域微孔聚丙烯膜(文中指定为R1933-18)。来自挤出机的两股熔体流通过多歧管模铸成单片。
[0109] 熔体流1。使用固体加料器将聚丙烯(PP)树脂颗粒(来自太阳石油化学品公司，费城，宾夕法尼亚州的F008F)和成核剂(MILLAD 3988，米利肯化学品公司，斯帕坦堡，南卡罗来那州)引入料斗中，且将材料馈入维持在175rpm的螺杆速度下的40mm双螺杆挤出机中。矿物油稀释剂(Kaydol 350矿物油，布伦塔格大湖LCC，圣保罗，明尼苏达州)自贮液器分别馈入挤出机中。PP/稀释剂/成核剂的重量比是34.247％/65.7％/0.053％。总挤出速率为约32lb/hr(14.5kg/hr)，且设置挤出机的8个区域以提供自271℃至177℃的下降温度特征。
[0110] 熔体流2。将PP树脂颗粒和MILLAD 3988引入维持在150rpm的螺杆速度下的25mm双螺杆挤出机中。矿物油稀释剂自贮液器分别馈入挤出机中。PP/稀释剂/成核剂的重量比是28.98％/70.7％/0.32％。总挤出速率为约6lb/hr(2.72kg/hr)，且设置挤出机的8个区域以提供自260℃至194℃的下降温度特征。
[0111] 将多区域膜自维持在177℃下的多歧管模浇铸到图案化浇铸轮上。浇铸轮的温度维持在52℃下且浇铸速度为5.84m/min(19.15ft/min)。在溶剂中在线洗涤所得膜以移除矿物油稀释剂且随后风干。继而将经洗涤的膜以纵向和横向1.7×2.75(分别在99℃和160℃下)定向。
[0112] 实例2
[0113] TIPS膜的表面涂覆
[0114] 通过将表面活性剂溶解在2-丙醇(阿法埃莎公司(Alfa Aesar)，沃德山(Ward Hill)，马萨诸塞州)中来制备4-wt％斯潘(SPAN)20(有利凯玛(Uniqema)，纽卡斯尔市(New Castle)，特拉华州)溶液。
[0115] 在聚乙烯(PE)袋中用以上表面活性剂溶液来饱和TIPS微孔膜。膜立刻饱和且通过摩擦PE袋移除过量的表面溶液。将膜自袋中移出且暴露在空气中以使膜完全干燥。将经干燥的膜在室温下储存在PE袋中。
[0116] 实例3
[0117] TIPS膜的表面改性
[0118] 如2010年6月4日提交的名为“制造经涂覆的多孔材料的方法(Process for Making Coated Porous Materials)”的美国临时专利申请号61/351,447所述，用聚乙二醇(PEG)涂覆TIPS膜。
[0119] 通过在70-80℃温度的水浴中，将44mol％乙烯含量的乙烯-乙烯醇共聚物(EVAL)(EVAL44，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.)，圣路易斯(St Louis)，密苏里州(MO)，美国)溶解在乙醇(AAPER酒精和化学品公司(AAPER Alcohol and Chemical Co.)，谢尔比维尔(Shelbyville)，肯塔基州(KY))/水溶剂混合物(70vol％乙醇)中来制备5-wt％EVAL储备溶液。
[0120] 自以上储备溶液制备溶液，所述溶液在乙醇/水混合溶剂(70vol％乙醇)中含有1-wt％EVAL44、2-wt％SR@610(沙多玛公司(Sartomer)，沃灵顿(Warrington)，宾夕法尼亚州)、1wt％反应性光引发剂VAZPIA(如美国专利号5,506,279中所公开的2-[4-(2-羟基-2-甲基丙酰基)苯氧基]乙基-2-甲基-2-N-丙烯酰氨基丙酸酯)。
[0121] 在较重的PE袋中用上述涂覆溶液饱和TIPS微孔膜。在自PE袋移除饱和膜之后通过纸巾擦拭来移除过量的表面溶液。通过在室温下蒸发溶剂10-12小时来干燥膜。随后，用20-wt％NaCl水溶液饱和干膜。其后，使膜在传送带上通过具有H型灯泡的氮气惰性熔化UV系统。传送带的速度为20英尺/分钟(fpm)。在膜的反面朝向光源的情况下，将膜以相同速度再次传送通过UV系统。经固化的膜用过量去离子水洗涤并在90℃下干燥1至2个小时直到完全干燥。经干燥的膜在室温下储存在PE袋中。
[0122] 实例4
[0123] 制备聚丙烯腈(PAN)膜
[0124] 如韩国专利申请号KR20040040692中所公开，制备各种PAN膜。10.5-wt％的聚丙烯腈(Mw.150,000)是在N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)中制备的。使用注射泵将PAN聚合物溶液的恒定流(50微升/分钟/孔)供应到连接到高压电源的注射器中。引入90-100Kv的电力以形成静电力，从而引起聚合物溶液喷入空气中并形成PAN纳米纤维。在电纺丝工艺之后，经收集的PAN纳米纤维具有与棉花类似但与薄膜和/或膜不同的蓬松度。为降低3
电纺丝PAN纳米纤维的蓬松度且增加其结构完整性，在140℃和10-20kgf/cm压力下进行后处理(热轧工艺)。PAN纳米纤维以卷筒形式在室温下储存在PE袋中。
电纺丝PAN纳米纤维的蓬松度且增加其结构完整性，在140℃和10-20kgf/cm压力下进行后处理(热轧工艺)。PAN纳米纤维以卷筒形式在室温下储存在PE袋中。
[0125] 实例5
[0126] 膜的表征
[0127] a)水流速率测量
[0128] 使用模冲头切割47mm的膜圆盘，并将膜圆盘安装在格尔曼(Gelman)磁性支架(格尔曼科技有限公司(Sciences，Inc.)，安阿伯(Ann Arbor)，密歇根州(MI))中。支架中的有效膜直径为34mm。向支架中添加100ml水，并使用真空泵(GAST制造有限公司(GAST Manufacturing，Inc.)，本顿港(Benton Harbor)，密歇根州)施加约23.5英寸汞的真空压力以自膜汲取水。用秒表记录水通过膜的时间。使用时间、真空压力和膜面积计算水流速2
率(通量)且用L/(m.h.psi)表示。
率(通量)且用L/(m.h.psi)表示。
[0129] b)泡点孔径测量
[0130] 根据ASTM-F316-03测量膜的泡点孔径。膜用异丙醇或FC-43(3M公司，圣保罗，明尼苏达州)或液态GALWICK(PMI，多孔材料有限公司(Porous Materials，Inc.)，伊萨卡(Ithaca)，纽约州(NY))预润湿且安装在测试支架上。将加压氮气逐渐供应至膜的一面直到在另一面检测到的气流达到100％。记录100％气流通过膜时的压力并用其计算泡点孔径。
[0131] TIPS膜加工条件概述在下表1中。
[0132] 各种膜的水通量率和泡点孔径显示在下表2中。
[0133] 表1.TIPS膜加工条件
[0134]
[0135]
[0136] 表2-膜特性
[0137]
[0138] c)膜的扫描电子显微术
[0139] 对于PAN膜，将来自每个样品的滤器安装在铝短棒上。对于TIPS膜，移出每个样品的两个部分且安装在铝短棒上以观察“致密的”和“敞开的”两个表面。又通过在液氮下撕裂来制备每个TIPS膜的横截面。将这些安装在另一个短棒上。用金/钯溅涂所有标本并使用JEOL 7001F场发射扫描电子显微镜进行检查。数码显微照片是二次电子成像(SEI)(一种用于使样品的表面形态成像的技术)的产物。所有显微照片都取自垂直于短棒表面或截面(名义上)的视角。在不同的放大倍率下采集图像且放大倍率在所示图像上标明。对于每个横截面在图像中标明“致密的”和“敞开的”表面(也叫作面或层)。长度标记也显示在图1-图6的每个显微照片的下方。
[0140] 实例6
[0141] 实例中所用的细菌
[0142] 实例中所用的各种细菌(表3)获自ATCC(马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(VA))。
[0143] 表3.实例中所用的细菌
[0144]细菌 ATCC No.
粪肠球菌(Enterococcus faecalis) 700802
大肠杆菌(Escherichia coli) 51813
肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella entericasubsp.enterica) 51812
布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii) 10625
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii) 14135
产气肠杆菌 29007
阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) 10699
粪肠球菌(Enterococcus faecalis) 700802
大肠杆菌(Escherichia coli) 51813
肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella entericasubsp.enterica) 51812
布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii) 10625
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii) 14135
产气肠杆菌 29007
阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) 10699
[0145] 将细菌菌株的纯培养物接种在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，BD，富兰克林湖(Franklin Lakes)，新泽西州(NJ))中并在37℃下生长过夜。在巴特菲尔德磷酸盐缓冲液(Butterfield phosphate buffer)(沃特曼(Whatman)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)中连续稀释培养物以获得用于掺入水样中的所需量的每毫升菌落形成单位(cfu)。根据制造商的说明书通过将合适的稀释液涂布到3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板(3M公司，圣保罗，明尼苏达州)上来量化细菌，并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪(3M公司)读取平板，并确定菌落形成单位(cfu)。
[0146] 实例7
[0147] 通过过滤且随后直接生长而从加样水样回收大肠杆菌
[0148] 大肠杆菌在37℃下在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长过夜。稀释培养物以得到约100cfu/ml并向1000ml无菌水中添加1ml溶液以得到约100cfu。从片材或圆板切割47mm膜并放置在具有漏斗状烧结底座的无菌玻璃滤器支架组件(密理博，比尔里卡(Billerica)，马萨诸塞州)上。使滤器支架连接于4L真空过滤烧瓶。使用AIR CADET真空/加压站(型号
420-3901，巴纳特公司(Barnant Company)，巴灵顿(Barrington)，伊利诺伊州(IL))，在约
20英寸汞的真空压力下，通过各种膜来过滤溶液。在无菌条件下移出膜并放置在血琼脂或胰蛋白酶大豆琼脂平板(哈迪诊断公司(Hardy Diagnostics)，圣马丽亚(Santa Maria)，加州)上并在37℃下培育过夜。计数在膜上生长的菌落以确定菌落形成单位(cfu)。所得结果显示在下表4中。经测试的所有膜都显示大于73％的回收率，较小孔径的膜(＜0.5μm)显示大于90％的回收率。
420-3901，巴纳特公司(Barnant Company)，巴灵顿(Barrington)，伊利诺伊州(IL))，在约
20英寸汞的真空压力下，通过各种膜来过滤溶液。在无菌条件下移出膜并放置在血琼脂或胰蛋白酶大豆琼脂平板(哈迪诊断公司(Hardy Diagnostics)，圣马丽亚(Santa Maria)，加州)上并在37℃下培育过夜。计数在膜上生长的菌落以确定菌落形成单位(cfu)。所得结果显示在下表4中。经测试的所有膜都显示大于73％的回收率，较小孔径的膜(＜0.5μm)显示大于90％的回收率。
[0149] 表4.通过过滤和直接生长从加样水样中回大肠杆菌
[0150]经回收的总cfu 回收率％
输入 105cfu
R1933-18/斯潘(0.23μm) 98 93.33
R1933-7/斯潘(0.34μm) 95 90.48
R1901-8B/斯潘(0.49μm) 92 87.62
R1901-11/斯潘(0.74μm) 77 73.33
PAN-1(0.613μm) 80 76.19
PAN-2(0.531μm) 88 83.81
PAN-3(0.367μm) 100 95.24
艾瑟泊(Isopore)聚碳酸酯滤器(0.40μm) 97 92.38
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 98 93.33
输入 105cfu
R1933-18/斯潘(0.23μm) 98 93.33
R1933-7/斯潘(0.34μm) 95 90.48
R1901-8B/斯潘(0.49μm) 92 87.62
R1901-11/斯潘(0.74μm) 77 73.33
PAN-1(0.613μm) 80 76.19
PAN-2(0.531μm) 88 83.81
PAN-3(0.367μm) 100 95.24
艾瑟泊(Isopore)聚碳酸酯滤器(0.40μm) 97 92.38
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 98 93.33
[0151] 实例8
[0152] 通过过滤且随后洗脱而从加样水样回收大肠杆菌
[0153] 使大肠杆菌在37℃下在TSB中生长过夜。稀释培养物以得到约100cfu/ml并向1000ml无菌水中添加1ml溶液以得到约100cfu。从片材或圆板切割47mm膜并放置在无菌真空过滤设备上。使用AIR CADET真空/加压站，在约20英寸汞的真空压力下，通过各种膜过滤溶液。在无菌条件下将膜移出并添加到具有5ml 0.2％吐温-20(西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的无菌聚苯乙烯50-ml离心管(BD生物科学(Biosciences)，圣何塞(San Jose)，加州)中，并在室温下涡旋(固定速度旋涡混合器(Fixed Speed Vortex Mixer)，VWR，西切斯特(West Chester)，宾夕法尼亚州)1到2分钟。根据制造商的说明书将溶液涂布到3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板(3M公司，圣保罗，明尼苏达州)上并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪(3M公司)读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。所得结果显示在下表5中。所述结果是典型实验的代表。自掺入约100cfu的大肠杆菌的1000ml水样，回收率在28.6％到72.9％变化。对于经处理的TIPS膜和一种PAN膜(PAN-3)，回收率在45％到72.9％变化。TIPS膜R1933-18/斯潘(0.2μm)具有较低的通量率，因为其过滤1升水需要25分钟。R1933-7/斯潘(0.34μm)具有良好的通量率。
两种膜均显示经过滤的细菌的良好的回收率。对于两种商业膜，回收率在28.6到35.7％变化。
两种膜均显示经过滤的细菌的良好的回收率。对于两种商业膜，回收率在28.6到35.7％变化。
[0154] 表5.通过从各种膜过滤和洗脱来回收大肠杆菌
[0155]
[0156]
[0157] 实例9
[0158] 各种提取剂对通过过滤且随后洗脱从加样水样回收细菌的影响
[0159] 将大肠杆菌在37℃下在TSB中生长过夜。稀释培养物以得到约100cfu/ml并向1000ml无菌水中添加1ml溶液以得到约100cfu。从片材或圆板切割47mm膜并放置在真空过滤设备上。使用AIR CADET真空/加压站，在约20英寸汞的真空压力下，通过各种膜过滤溶液。在无菌条件下将膜移出并添加到具有5ml各种提取剂的无菌聚苯乙烯50-ml离心管(BD生物科学，圣何塞，加州)中，并在室温下涡旋(固定速度旋涡混合器，VWR，西切斯特，宾夕法尼亚州)1到2分钟。根据制造商的说明书将溶液涂布在3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板上并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。所得结果显示在下表6中。使用0.2％吐温-20和磷酸盐缓冲盐水(PBS，英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加州)显示比曲通-X-100(Triton-X-100)(西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)或水更好的回收率。在使用吐温-20的情况下，回收率在35％到77％变化，而在使用PBS的情况下，回收率在33％到79％变化。在使用无菌MILLI-Q水(密理博公司，比尔里卡，马萨诸塞州)和曲通-X-100的情况下，回收率仅为11％到46％。
[0160] 表6.使用各种提取剂通过过滤和洗脱从膜回收大肠杆菌
[0161]膜 0.2％吐温-20 0.1％曲通-X-100 PBS Milli-Q水
R1933-7/斯潘(0.34μm) 76.7％ 37.1％ 73.8％ 26.2％
R1901-8B/斯潘(0.49μm) 65.2％ 31.4％ 69.0％ 35.7％
PAN-3(0.367μm) 63.5％ 46.2％ 78.6％ 35.7％
艾瑟泊聚碳酸酯(0.40μm) 34.7％ 10.7％ 33.3％ 19.0％
R1933-7/斯潘(0.34μm) 76.7％ 37.1％ 73.8％ 26.2％
R1901-8B/斯潘(0.49μm) 65.2％ 31.4％ 69.0％ 35.7％
PAN-3(0.367μm) 63.5％ 46.2％ 78.6％ 35.7％
艾瑟泊聚碳酸酯(0.40μm) 34.7％ 10.7％ 33.3％ 19.0％
[0162] 实例10
[0163] 吐温-20浓度对细菌回收率的影响
[0164] 将大肠杆菌在37℃在TSB中生长过夜。稀释培养物以得到约100cfu/ml并向1000ml无菌水中添加1ml溶液以得到约100cfu。从片材或圆板切割47mm膜并放置在真空过滤设备上。使用AIR CADET真空/加压站，在约20英寸汞的真空压力下，通过各种膜过滤溶液。在无菌条件下将膜移出并添加到具有5ml各种浓度的吐温-20的无菌聚苯乙烯50-ml离心管(BD生物科学，圣何塞，加州)中，并在室温下涡旋(固定速度旋涡混合器，VWR，西切斯特，宾夕法尼亚州)1到2分钟。根据制造商的说明书将溶液涂布到3MPETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板上并在37℃下培育过夜。使用3MPETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。所得结果显示在下表7中。在测试的所有膜中，使用0.1％或
0.2％吐温-20得到最佳回收率。
0.2％吐温-20得到最佳回收率。
[0165] 表7.吐温-20浓度对通过过滤和洗脱从膜回收大肠杆菌的百分比的影响[0166]
[0167] 实例11
[0168] 从膜回收细菌的各种方法的效果
[0169] 将大肠杆菌在37℃在TSB中生长过夜。稀释培养物以得到约100cfu/ml并向1000ml无菌水中添加1ml溶液以得到约100cfu。从片材或圆板切割47mm膜并放置在真空过滤设备上。使用AIR CADET真空/加压站，在约20英寸汞的真空压力下，通过各种膜过滤溶液。在无菌条件下将膜移出并添加到具有5ml 0.2％吐温-20的无菌聚苯乙烯50-ml离心管(BD生物科学，圣何塞，加州)中。在室温下，使用超声发生器(必能信
2200(Branson2200)，必能信超声(Branson Ultrasonics)，丹伯里(Dansbury)，康涅狄格州(CT))对离心管超声处理5分钟，涡旋1到2分钟(固定速度旋涡混合器，VWR，西切斯特，宾夕法尼亚州)或在回旋振荡器(纽布伦斯威克科学振荡器(Newbrunswik Scientific shaker)，型号英诺华4000(Innova 4000))中振荡10分钟。根据制造商的说明书将溶液涂布到3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板上并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。所得结果显示在下表8中。
2200(Branson2200)，必能信超声(Branson Ultrasonics)，丹伯里(Dansbury)，康涅狄格州(CT))对离心管超声处理5分钟，涡旋1到2分钟(固定速度旋涡混合器，VWR，西切斯特，宾夕法尼亚州)或在回旋振荡器(纽布伦斯威克科学振荡器(Newbrunswik Scientific shaker)，型号英诺华4000(Innova 4000))中振荡10分钟。根据制造商的说明书将溶液涂布到3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板上并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。所得结果显示在下表8中。
[0170] 表8.在通过各种提取方法过滤之后从膜回收大肠杆菌
[0171]
[0172] 实例12
[0173] 使用泡沫洗脱从膜回收细菌
[0174] 将大肠杆菌在37℃在TSB中生长过夜。稀释培养物以得到约100cfu/ml并向50ml无菌水中添加1ml溶液以得到约100cfu。从片材或圆板切割25mm膜并放置在25mm斯温奈克滤器支架(Swinnex filter holder)(密理博公司，比尔里卡，马萨诸塞州)中。将滤器支架连接到真空歧管(沃特斯公司(Waters Corporation)，米尔福德(Milford)，马萨诸塞州)上并将50ml注射器连接到滤器支架的另一端。使用AIR CADET真空/加压站，在约20英寸汞的真空压力下，通过各种膜过滤加样水样。将具有膜的滤器支架连接到HSC 40台式(bench-top)浓缩器(英诺华制备(InnovaPrep)，德雷克塞尔(Drexel)，密苏里州)。所述系统产生提取剂溶液的泡沫，且通过使泡沫(1ml的0.05％吐温-20)通过膜来洗脱细菌。
[0175] 根据制造商的说明书将提取的溶液涂布到3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板上并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。所得结果显示在以下表9中。泡沫洗脱方法为洗脱小体积的生物有机体提供一个优势，并且能够在不对经洗脱的材料进一步浓缩的情况下容易地提取核酸。
[0176] 表9.在通过泡沫洗脱过滤之后从膜回收大肠杆菌
[0177]1ml中的总cfu 回收率％
输入 86cfu
R1933-7/斯潘(0.34μm) 46 53.5
R1933-7/PEG(0.34μm) 49 57.0
PAN-3(0.367μm) 47 54.7
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 35 40.7
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 25 29.1
输入 86cfu
R1933-7/斯潘(0.34μm) 46 53.5
R1933-7/PEG(0.34μm) 49 57.0
PAN-3(0.367μm) 47 54.7
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 35 40.7
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 25 29.1
[0178] 实例13
[0179] 从加样水样回收细菌，随后生长
[0180] 将大肠杆菌、肠道沙门氏菌肠道亚种和粪肠球菌在37℃下在TSB中生长过夜。稀释培养物以得到约10cfu/ml并向1000ml无菌水中添加1ml溶液以得到约10cfu。使用AIR CADET真空/加压站，在约20英寸汞的真空压力下，通过各种膜过滤溶液。在无菌条件下将膜移出并添加到具有10ml极品肉汤(TB)或胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)的无菌聚苯乙烯50-ml离心管(BD生物科学，圣何塞，加州)中，并在37℃下在纽布伦斯威克科学振荡器2
(型号英诺华4000)中在300rpm下搅拌2小时。通过掺入约10cfu(100μl的10cfu/ml)到10ml TB中来建立对照管，并类似地进行生长。在2小时结束时，将来自这些管的生长培养基涂布在3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板(用于大肠杆菌)和需氧计数板(Aerobic Count Plates)(用于肠道沙门氏菌和粪肠球菌)上并在37℃下培育过夜。使用
3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。使用输入的细胞数目来计算倍数增加。
(型号英诺华4000)中在300rpm下搅拌2小时。通过掺入约10cfu(100μl的10cfu/ml)到10ml TB中来建立对照管，并类似地进行生长。在2小时结束时，将来自这些管的生长培养基涂布在3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板(用于大肠杆菌)和需氧计数板(Aerobic Count Plates)(用于肠道沙门氏菌和粪肠球菌)上并在37℃下培育过夜。使用
3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。使用输入的细胞数目来计算倍数增加。
[0181] 表10.在过滤和在TB中生长2小时后，大肠杆菌的细胞数目增加
[0182]
[0183] 表11.在过滤和在TB中生长2小时后，大肠杆菌的细胞数目增加
[0184]
[0185] 表12.在过滤和在TB中生长2小时后，大肠杆菌的细胞数目增加
[0186]
[0187] 表13.在过滤和在TSB中生长2小时后，大肠杆菌的细胞数目增加
[0188]
[0189] 表14.在过滤和在TSB中生长2小时后，肠道沙门氏菌的细胞数目增加[0190]
[0191] 表15.在过滤和在TSB中生长2小时后，大肠杆菌和粪肠球菌的细胞数目增加[0192]
[0193] 实例14
[0194] 从加样水样回收大肠型细菌，随后生长
[0195] 将大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和布氏柠檬酸杆菌在37℃下在TSB中生长过夜。稀释培养物以得到约100cfu/ml并向1000ml无菌水中添加0.4ml溶液以得到约40cfu。使用AIR CADET真空/加压站，在约20英寸汞的真空压力下，通过各种膜过滤溶液。在无菌条件下将膜移出并添加到具有10ml极品肉汤(TB，西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)或胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，BD生物科学，圣何塞，加州)的无菌聚苯乙烯50-ml离心管(BD生物科学，圣何塞，加州)中，并在37℃下在纽布伦斯威克科学振荡器(型号英诺华4000)中在300rpm下搅拌2.5或3小时。通过掺入约40cfu(400μl的100cfu/ml)到10ml TB中来建立对照管且类似地进行生长。在培育周期结束时，将来自这些管的生长培养基涂布到3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。使用输入的细胞数目来计算倍数增加。
[0196] 表16.在过滤和在TB中生长2.5小时后，大肠型细菌的细胞数目增加[0197]大肠杆菌 10ml中的总cfu 倍数增加
输入 92cfu
对照组 2500 27.2
R1933-7/PEG(0.34μm) 1900 20.7
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 820 8.9
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 530 5.8
输入 92cfu
对照组 2500 27.2
R1933-7/PEG(0.34μm) 1900 20.7
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 820 8.9
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 530 5.8
[0198]产气肠杆菌 10ml中的总cfu 倍数增加
输入 80cfu
对照组 2450 30.6
R1933-7/PEG(0.34μm) 1500 18.8
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 900 11.3
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 450 5.6
输入 80cfu
对照组 2450 30.6
R1933-7/PEG(0.34μm) 1500 18.8
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 900 11.3
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 450 5.6
[0199]
[0200]
[0201]布氏柠檬酸杆菌 10ml中的总cfu 倍数增加
输入 10cfu
对照组 150 15
R1933-7/PEG(0.34μm) 100 10
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 60 6
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 40 4
输入 10cfu
对照组 150 15
R1933-7/PEG(0.34μm) 100 10
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 60 6
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 40 4
[0202]弗氏柠檬酸杆菌 10ml中的总cfu 倍数增加
输入 80cfu
对照组 900 11.3
R1933-7/PEG(0.34μm) 650 8.1
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 400 5.0
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 250 3.1
输入 80cfu
对照组 900 11.3
R1933-7/PEG(0.34μm) 650 8.1
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 400 5.0
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 250 3.1
[0203] 表17.在过滤和在TSB中生长3小时后，大肠型细菌的细胞数目增加[0204]大肠杆菌 10ml中的总cfu 倍数增加
输入 88cfu
对照组 5100 58.0
R1933-7/PEG(0.34μm) 6000 68.2
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 3500 39.8
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 2800 31.8
输入 88cfu
对照组 5100 58.0
R1933-7/PEG(0.34μm) 6000 68.2
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 3500 39.8
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 2800 31.8
[0205]产气肠杆菌 10ml中的总cfu 倍数增加
输入 76cfu
对照组 4900 64.5
R1933-7/PEG(0.34μm) 4000 52.6
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 2850 37.5
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 2200 28.9
输入 76cfu
对照组 4900 64.5
R1933-7/PEG(0.34μm) 4000 52.6
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 2850 37.5
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 2200 28.9
[0206]弗氏柠檬酸杆菌 10ml中的总cfu 倍数增加
输入 68cfu
对照组 2050 30.1
R1933-7/PEG(0.34μm) 1400 20.6
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 700 10.3
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 875 12.9
输入 68cfu
对照组 2050 30.1
R1933-7/PEG(0.34μm) 1400 20.6
艾瑟泊聚碳酸酯滤器(0.40μm) 700 10.3
MF-密理博型HAWP(0.45μm) 875 12.9
[0207] 实例15
[0208] 用于通过PCR检测大肠杆菌的引物和探针的开发
[0209] 选择两种大肠杆菌基因uidA(用于编码b-葡萄糖醛酸苷酶)和tufA(用于编码蛋白质链延长因子EF-Tu)作为靶基因。基于比对GenBank中可获得的所有序列来设计PCR引物和探针。设计的引物为：uidA：正向引物5’-TCTACTTTACTGGCTTTGGTCG-3’(SEQ ID NO：1)
[0210] 反向引物5’-CGTAAGGGTAATGCGAGGTAC-3’(SEQ ID NO：2)
[0211] 探针5’-6-FAM-AGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGC-3’-Iowablack FQ(SEQ ID NO：3)[0212] tufA：正向引物：5’-TCACCATCAACACTTCTCACG-3’(SEQ ID NO：4)[0213] 反向引物：5’-CAGCAACTACCAGGATCGC-3’(SEQ ID NO：5)
[0214] 探针：5’-6-FAM-TGAATACGACACCCCGACCCG-3’-Iowablack FQ(SEQ ID NO：6)[0215] 引物和探针是由IDT DNA技术公司(IDT DNA Technologies)(科勒尔维尔(Coralville)，爱荷华州(IA))合成的。在10μl 2x塔格曼快速通用预混液(TaqMan Fast Universal Master Mix)(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特市(Foster City)，加州)和5μl DNA模板的情况下，以250到500nM使用设计的引物并以125到250nM使用探针。另外，根据制造商的说明书，使用来自引物设计有限公司(Primer Design Ltd)(南安普敦(Southampton)，英国)(大肠杆菌标准定量试剂盒)和BioGx(伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州(Alabama))(大肠杆菌种蝎子)的用于检测大肠杆菌的市面有售的试剂。
[0216] 将大肠杆菌细胞在巴特菲尔德磷酸盐缓冲液中连续稀释，并通过将100μl的普利曼超级(PREPMAN Ultra)样品制备试剂(应用生物系统公司)与25μl的细菌稀释液混合且煮沸10分钟来制备DNA模板。冷却沸腾的悬浮液，在14,000RPM下旋转2分钟并将上清液转移到干净的管子中。将5μl的DNA样品添加到含有20μl的反应混合物(引物、探针和酶混合物)的96孔PCR平板中。在以下条件下，使用ABI 7500序列检测系统进行热循环：在95℃下变性2分钟，随后以下循环40次：95℃下20秒和60℃下1分钟。如下所示，PCR的检测极限为约100cfu。
[0217] 表18.PCR检测大肠杆菌
[0218]
[0219] 实例16
[0220] 通过PCR检测来自加样水样的细菌
[0221] 将大肠杆菌在37℃在TSB中生长过夜。稀释培养物以得到约10cfu/ml并向1000ml无菌水中添加1ml溶液以得到约10cfu。使用AIR CADET真空/加压站，在约20英寸汞的真空压力下，通过各种膜过滤溶液。在无菌条件下将膜移出并添加到具有10ml TB(西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的50-ml管中，并在37℃下在纽布伦斯威克科学振荡器(型号英诺华4000)中在300rpm下搅拌2小时。通过掺入约10cfu(100μl的
102cfu/ml)至10ml TB中来建立对照管且类似地进行生长。所有样品都是一式两份地建立。
在2小时结束时，将来自一套管中的生长培养基涂布在3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板上并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。
102cfu/ml)至10ml TB中来建立对照管且类似地进行生长。所有样品都是一式两份地建立。
在2小时结束时，将来自一套管中的生长培养基涂布在3M PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板上并在37℃下培育过夜。使用3M PETRIFILM平板判读仪读取平板并确定菌落形成单位(cfu)。
[0222] 自另一套管中，在5000rpm下旋转含有细胞的生长培养基20分钟使细胞成颗粒。根据制造商的说明书使用凯杰迷你DNA提取试剂盒(Qiagen Mini DNA extraction kit)提取DNA，并在10μl中洗脱DNA。将5μl经提取的DNA添加到20μl PCR分析混合物中，且如上所述用针对uidA基因的引物和探针进行PCR(引物设计试剂盒)。从过滤到随后的生长和PCT检测的整个过程耗时约4小时。
[0223] 如下所示，倍数增加从5倍到18倍不等。对于掺入10cfu大肠杆菌的1000ml水样，经改性的TIPS膜显示9倍到18倍的增加且通过PCR检测时为阳性的。商业膜显示仅5倍到6倍的增加，且不显示靶DNA的任何扩增。
[0224] 表19.用PCR快速检测大肠杆菌
[0225]
[0226] 实例17
[0227] 制备和评估具有聚丙烯膜的袋子
[0228] 通过将山梨醇单月桂酸酯(斯潘20，购自禾大公司(Croda)，纽卡斯尔(New Castle)，特拉华州)溶解在2-丙醇(阿法埃莎公司，沃德山，马萨诸塞州)中来制备4wt％(重量％)的表面活性剂溶液。将R1930-10、R1901-11和R1901-8B膜(表1)分别放置在聚乙烯(PE)袋中，所述PE袋具有充足的表面活性剂溶液以使这些膜饱和。膜立刻饱和。通过摩擦袋子以将溶液从袋子中挤出来移除过量的表面活性剂溶液。将膜从袋中移出并在室温下风干。针对表2中所示的特性对经处理和未经处理的膜的特征进行表征。致密区域厚度是指具有较小孔径的区域的近似厚度。经干燥的膜储存在塑料袋中直到使用。
[0229] 将膜构造成类似于图11和图12中所示装置的袋式浓缩装置。以相同方式构造包括每个膜的袋子。沿着密封边缘切割8英寸×8英寸的密保诺(ZIPLOC)聚乙烯袋(约翰逊父子公司(S.C.Johnson&Son，Inc.)，拉辛(Racine)，威斯康星州(WI))且分成两块。将单层的干膜切割成五边形形状，其具有三条5英寸直角边和两条约2.7英寸的等边。将膜堆叠在聚丙烯非织造片材(替派(TYPAR)，里梅公司(Reemay Inc.)，查尔斯顿(Charleston)，南卡罗来纳州(SC))上，所述聚丙烯非织造片材与朝向非织造片材的多区域膜的敞开面具有相同的尺寸。然后将堆叠物放置在一片密保诺袋子的内表面上，其中方形朝向密保诺封口且三角形在接近袋子底部处形成v形，且膜的致密面朝向袋子的内表面。图11显示具有以下组件的袋式浓缩装置10的分解图：密保诺袋片材(具有联锁封口组件13a和13b的容器组件12a和12b)、聚丙烯非织造片材(非织造背衬20)、滤膜14和超强吸收性颗粒(吸收构件16)。将膜和非织造五边形的四个边缘与密保诺袋子加热密封以形成一个小囊，其中朝向袋子顶端的密保诺封条的五边形的5英寸边保持开放，如图12所示。密保诺袋子的两边随后经加热密封(封条26)以使非织造物面向袋子的反面，从而形成类似于图8中所示的浓缩袋。
[0230] 通过将3.8g超强吸收性水凝胶颗粒(聚丙烯酸酯-多元醇)放置在小囊外面的每个袋子中来评估每个袋子。对于每个测试，通过添加1.125ml环氧乙烷/环氧丙烷表面活性剂普朗尼克(PLURONIC)L64(PL64，购自巴斯夫(BASF)，芒特奥利夫(Mount Olive)，新泽西州)来制备肉汤，且将0.45g牛血清白蛋白(BSA，西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)添加到作为快速丰富TSB(Quick-Enrich TSB)(3M公司，圣保罗，明尼苏达州)获得的225ml灭菌胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中直到最后浓度为0.5％PL64和0.2％BSA。随后5
用含有约10cfu(菌落形成单位)/ml无害李斯特菌(Listeria innocua)(ATCC 33090)的
225μl巴特菲尔德磷酸盐缓冲液来接种肉汤。随后将细菌肉汤倒入浓缩袋的小囊(膜的致密面)中并在室温下直立支撑在工作台上直到约3ml溶液残留在小囊中(20-30分钟)，并记录吸收时间。用吸液管移出残留的液体并转移到15ml刻度离心管中以测量体积。随后用巴特菲尔德缓冲液对每个经浓缩的样品稀释10倍，并将100μl稀释液放置在改良牛沣培养基平板(Modified Oxford Medium plate)(获自哈迪诊断公司(圣马丽亚，加州)的MOX平板)上并在37℃下培育24小时。
用含有约10cfu(菌落形成单位)/ml无害李斯特菌(Listeria innocua)(ATCC 33090)的
225μl巴特菲尔德磷酸盐缓冲液来接种肉汤。随后将细菌肉汤倒入浓缩袋的小囊(膜的致密面)中并在室温下直立支撑在工作台上直到约3ml溶液残留在小囊中(20-30分钟)，并记录吸收时间。用吸液管移出残留的液体并转移到15ml刻度离心管中以测量体积。随后用巴特菲尔德缓冲液对每个经浓缩的样品稀释10倍，并将100μl稀释液放置在改良牛沣培养基平板(Modified Oxford Medium plate)(获自哈迪诊断公司(圣马丽亚，加州)的MOX平板)上并在37℃下培育24小时。
[0231] 对照组代表初始浓度。以与评估分析相同的方式制备对照组样品，但不浓缩。用每一套膜测试独立的对照组，例如对照组1在与经斯潘20处理的膜相同的时间进行测试，且对照组2在与经PEG处理的膜相同的时间进行测试。
[0232] 每个评估重复第二次且细菌浓度代表浓缩之后两种不同的独立计数。浓集系数是最终浓度除以细菌初始浓度的值。经斯潘20处理的膜的测试结果显示在表20中。
[0233] 表20.TIPS膜的细菌回收率和吸收时间
[0234]
[0235] 实例18
[0236] 具有聚丙烯膜的袋子的制备和评估
[0237] 通过在温度70-80℃的水浴中将具有44摩尔％乙烯含量的乙烯-乙烯醇共聚物(EVAL44)(44％乙烯含量的聚(乙烯醇共乙烯聚合物)，以产品编号414107自西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州获得)溶解在乙醇(AAPER酒精和化学品公司，谢尔比维尔，肯塔基州)/水溶剂混合物(70vol％乙醇)中来制备乙烯乙烯醇共聚物的5wt％储备溶液。
[0238] 从以上储备溶液制备聚乙二醇(PEG)涂覆溶液，其在乙醇/水混合溶剂(70vol％乙醇)中含有1wt％EVAL44、2wt％聚乙二醇(600)二丙烯酸酯(以产品编号SR610自沙多玛公司，沃灵顿，宾夕法尼亚州获得)、1wt％反应性光引发剂VAZPIA(如美国专利号5,506,279中所公开的2-[4-(-羟基-2-甲基丙酰基)苯氧基]乙基-2-甲基-2-N-丙烯酰氨基丙酸酯)。
[0239] 在较重的PE袋中用PEG涂覆溶液饱和微孔膜R1933-7和R1933-18(表1)，随后从袋子中移出所述微孔膜。通过用纸巾擦拭饱和膜的表面来移除过量的溶液。在室温下使膜风干10-12小时。随后用20wt％NaCl水溶液饱和干膜且移除过量的溶液。随后将膜放置在UV固化系统(具有H型灯泡的熔化UV系统，来自熔化UV系统公司(Fusion UV Systems，Inc.)，盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰州(MD))的传送带上，并在惰性氮气氛围室中固化。传送带速度为20英尺/分钟(fpm)。将膜翻转且在膜的反面朝向光源的情况下以相同速度再次通过UV系统用过量的去离子水洗涤经固化的膜并在90℃下干燥1到2小时直到完全干燥。经过永久处理的干燥的膜在室温下储存在PE袋中。
[0240] 如实例17中所述制备袋式浓缩装置。
[0241] 实例19
[0242] 具有聚丙烯腈膜的袋子的制备和评估
[0243] 如韩国专利申请号KR20040040692所公开，制备各种聚丙烯腈(PAN)聚合物膜(PAN-1、PAN-2、PAN-3、PAN-4和PAN-5)。通过将聚合物分散在液体中来制备聚丙烯腈(MW.150,000)聚合物于N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)中的10.5-wt％溶液。将PAN聚合物溶液的恒定流(50微升/分钟/孔)抽汲到连接到高压电源的注射器中。将90-100Kv的电力引入注射器中，引起聚合物溶液喷入空气中以形成电纺丝PAN纳米纤维。将纤维收集在网上以形成蓬松毛层。为降低所述电纺丝PAN纳米纤维的蓬松度并增加其结构完整性，通3
过在140℃下和在约10到20kgf/cm之间的压力下砑光来进行后处理。不使用其它后续处理。膜在室温下储存在PE袋中。对于PAN-4、PAN-2和PAN-5膜，膜的孔径分别为0.2μm、
0.53μm和0.73μm。如实例17中所述制备袋式浓缩装置。
过在140℃下和在约10到20kgf/cm之间的压力下砑光来进行后处理。不使用其它后续处理。膜在室温下储存在PE袋中。对于PAN-4、PAN-2和PAN-5膜，膜的孔径分别为0.2μm、
0.53μm和0.73μm。如实例17中所述制备袋式浓缩装置。
[0244] 除了在每个袋子中使用3.9克水凝胶以外，根据与实例17中所述相同的程序评估袋子。测试结果示于表21中。
[0245] 表21.聚丙烯腈膜的细菌回收率
[0246]
[0247] 实例20
[0248] 制备具有尼龙膜的袋子
[0249] 从3M净化公司(3M Purification Inc.)(梅里登(Meriden)，康涅狄格州)获得尼龙膜液体滤器产品编号080ZN(0.8μm)和0606SN(0.6μm)。
[0250] 如实例17中所述制备袋式浓缩装置。
[0251] 实例21
[0252] 制备具有聚碳酸酯膜的袋子
[0253] 从通用奥斯莫尼斯公司(GE Osmonics)(霍普金斯(Hopkins)，明尼苏达州)获得0.8μm和0.6μm聚碳酸酯膜滤器。如实例17中所述制备袋式浓缩装置。
[0254] 实例22
[0255] 制备具有聚醚/聚砜(PES)膜的袋子
[0256] 从通用奥斯莫尼斯公司(霍普金斯，明尼苏达州)获得0.8μm和0.6μm聚醚/聚砜(PES)膜。如实例17中所述制备袋式浓缩装置。
[0257] 实例23
[0258] 膜的评估
[0259] 除了在每个袋子中使用4.0克水凝胶以外，根据如实例17中所述的程序评估含有0.6μm尼龙膜的袋子(实例20)和含有0.8μm聚碳酸酯膜的袋子(实例21)。另外，除了所用表面活性剂为0.01％含氟表面活性剂(3M诺维(NOVEC)FC-4430，3M公司，圣保罗，明尼苏达州)而不是普朗尼克L64以外，使用按以上所述制备的TSB肉汤来评估含有0.6μm尼龙膜的袋子。测试结果显示在表22中。
[0260] 表22.自尼龙和聚碳酸酯膜回收细菌
[0261]
[0262] 除了以下情况，根据实例17中所述的程序评估含有0.8μm尼龙膜的袋子(实例20)和含有0.8μm PES膜的袋子(实例22)。在每个袋子中所用水凝胶的量为约4.0克。
通过用异丙醇喷射袋子内部，将袋子撑开，并用紫外光照射袋子45分钟而对袋子内部进行灭菌。胰蛋白酶大豆肉汤含有通过将30克TSB与3克酵母提取物溶解在1升去离子水中制备的0.6％酵母提取物。将两种表面活性剂中的一种(如表23所指出)添加到肉汤-0.2％(w/v)普朗尼克L64和0.2％吐温80(v/v)(西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)
7
中。用含有约1×10cfu/ml无害李斯特菌(Listeria innocua)(ATCC 33090)的225μl巴特菲尔德缓冲液接种所得肉汤(225ml)且充分混合。随后将肉汤倒入到样品浓缩袋的小囊中且直立支撑50-90分钟。收集经浓缩样品，进行测量，并连续用3ml巴特菲尔德缓冲液稀释10倍。随后，将每个样品的1ml第三次稀释液涂布在AC PETRIFILM平板(3M公司，圣保罗，明尼苏达州)上。在37℃培育平板24小时且计数菌落。表23显示细菌回收结果。
通过用异丙醇喷射袋子内部，将袋子撑开，并用紫外光照射袋子45分钟而对袋子内部进行灭菌。胰蛋白酶大豆肉汤含有通过将30克TSB与3克酵母提取物溶解在1升去离子水中制备的0.6％酵母提取物。将两种表面活性剂中的一种(如表23所指出)添加到肉汤-0.2％(w/v)普朗尼克L64和0.2％吐温80(v/v)(西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)
7
中。用含有约1×10cfu/ml无害李斯特菌(Listeria innocua)(ATCC 33090)的225μl巴特菲尔德缓冲液接种所得肉汤(225ml)且充分混合。随后将肉汤倒入到样品浓缩袋的小囊中且直立支撑50-90分钟。收集经浓缩样品，进行测量，并连续用3ml巴特菲尔德缓冲液稀释10倍。随后，将每个样品的1ml第三次稀释液涂布在AC PETRIFILM平板(3M公司，圣保罗，明尼苏达州)上。在37℃培育平板24小时且计数菌落。表23显示细菌回收结果。
[0263] 表23.聚醚砜和尼龙膜的细菌回收率
[0264]
[0265]
[0266] 实例24
[0267] 具有浮阀和容器的大型水样收集系统
[0268] 使用四加仑塑料坛(P/N 073004，美国塑料公司(US Plastic Corporation)，利马(Lima)，俄亥俄州(OH))建立大型样品体积收集系统。使用适当的管配件(梅纳公司(Menards)，斯蒂尔沃特(Stillwater)，明尼苏达州)将47mm滤器支架(目录号EW-06623-22，科尔帕默仪器公司(Cole-Parmer Instrument Co.)，弗农山(Vernon1
Hills)，伊利诺伊州)连接到 /2″浮阀(哈德逊阀公司(Hudson Valve Company)，贝克斯菲尔德(Bakersfield)，加州)。将浮阀安装到坛的开口中以便达到所需量时，浮体可上升以使水流停止。在滤器支架的另一端连接合适的管配件以便滤器支架可连接到水源。将
47mm膜滤器放置在滤器支架中并将装置连接到水源(水龙头)。打开水源并使水通过膜过滤。当容器盛满(10升)时，浮阀关闭水流。关闭水龙头，断开滤器支架，且移出膜滤器并进行进一步分析。将膜放置在血琼脂(哈迪诊断公司(圣马丽亚，加州))或胰蛋白酶大豆琼脂平板(哈迪诊断公司)上，并在37℃下培育平板16到24小时。对菌落形成单位进行计数以确定10升水中的细菌含量。
Hills)，伊利诺伊州)连接到 /2″浮阀(哈德逊阀公司(Hudson Valve Company)，贝克斯菲尔德(Bakersfield)，加州)。将浮阀安装到坛的开口中以便达到所需量时，浮体可上升以使水流停止。在滤器支架的另一端连接合适的管配件以便滤器支架可连接到水源。将
47mm膜滤器放置在滤器支架中并将装置连接到水源(水龙头)。打开水源并使水通过膜过滤。当容器盛满(10升)时，浮阀关闭水流。关闭水龙头，断开滤器支架，且移出膜滤器并进行进一步分析。将膜放置在血琼脂(哈迪诊断公司(圣马丽亚，加州))或胰蛋白酶大豆琼脂平板(哈迪诊断公司)上，并在37℃下培育平板16到24小时。对菌落形成单位进行计数以确定10升水中的细菌含量。
[0269] 实例25
[0270] 具有流量计的大型水样收集系统
[0271] 通过使用合适的管配件(梅纳公司，斯蒂尔沃特，明尼苏达州)将流量计(目录号WU-05610-01，科尔帕默仪器公司，弗农山，伊利诺伊州)连接到47mm滤器支架(目录号EW-06623-22，科尔帕默)来建立大型样品体积收集系统。在滤器支架的另一端连接合适的管配件以便滤器支架可连接到水源。将47mm膜滤器放置在滤器支架中并将装置连接到水源(水龙头)。打开水源且使水通过膜过滤。使用流量计上的读数来确定流过滤器的水量，且当水流达到所需量(10升)时，手动关闭水流。断开滤器支架且移出膜滤器并进行进一步分析。将膜放置在血琼脂(哈迪诊断公司(圣马丽亚，加州))或胰蛋白酶大豆琼脂平板(哈迪诊断公司)上，并在37℃下培育平板16到24小时。对菌落形成单位进行计数以确定10升水中的细菌含量。
[0272] 实例26
[0273] 管道修复工艺的说明
[0274] 使用优选膜滤器处理1到10升水样。保留的细菌可被洗脱或进一步生长以用于通过诸如PCR、等温扩增、免疫分析等分析进行检测。快速检测可实现在短时间内(例如小于8小时)确定存在还是不存在细菌以便被恢复的管子更快地重新工作。
[0275] 本文所引用的所有专利、专利申请和出版物的全部公开内容，以及以电子版形式获得的材料(包括例如，核苷酸序列提交序列，如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交序列；和氨基酸序列提交序列，如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交序列；以及GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译序列)均以全文引用的方式并入本文。在本专利申请和以引用方式并入本文的任何文献的公开内容之间存在矛盾的情况下，应以本发明的公开内容为准。给出上述详细说明及实例仅为清楚地理解本发明。这些说明和实例不应被理解成对本发明进行不必要的限制。本发明不限于所示和所述的具体细节，对本领域的技术人员显而易见的变型形式也将包括在由权利要求书所限定的本发明中。
[0276] 应了解，除非另外指明，否则用于本说明书和权利要求中的表示组分数量、分子量等的所有数值在一切情况下均可被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和权利要求中所述的数值参数是近似值，其可根据本发明旨在得到的所需特性而变化。在最低程度上，没有将等同原则局限于权利要求保护的范围的意思，最起码应该根据所报告的有效数字的数并运用惯常的舍入技术来解释各数值参数。
[0277] 尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数为近似值，但具体实例中所述数值将尽可能精确地加以叙述。尽管如此，在各自测试过程中产生的标准偏差不可避免地导致所有数值固有地包括一定范围。
[0278] 所有的标题是为了阅读者方便，而不应该被用于限制该标题后面的正文的含义，除非如此明确指出。