一种快速酱油二次沉淀蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种快速和科学的酱油二次沉淀蛋白制备方法，包括如下步骤：酱油预冷至5～-10℃，用超声设备（功率：200~950W，频率：10~25Kz）进行适度超声处理2~16min。超声处理过的样品重新降温至5～-10℃，在相对离心力（RCF）为2000~17800g时离心10~40min，收集沉淀。用3~5倍体积的去离子水洗涤沉淀，将混悬液盛入截留分子量为3500~12000Da的透析袋进行脱盐透析。收集酱油二次沉淀蛋白混悬液，真空冷冻干燥得到酱油二次沉淀蛋白。与常规方法制备酱油二次沉淀蛋白相比，利用本方法制备酱油二次沉淀蛋白具有快速、沉淀蛋白种类全面、条件温和等优势。

权利要求

1.一种快速酱油二次沉淀蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将酱油样品降温至5～-10℃预冷，然后超声处理2～16min，超声功率为200～

950W，超声频率为10～25Kz；

（2）将步骤（1）超声处理过的样品重新降温至5～-10℃，在相对离心力为2000～

17800g时离心10～40min，收集沉淀；

（3）用3～5倍体积的去离子水分3次洗涤沉淀，将混悬液盛入截留分子量为3500～

12000Da的透析袋进行脱盐透析，得到高纯度的酱油二次沉淀蛋白混悬液；

（4）收集酱油二次沉淀混悬液，真空冷冻干燥，获得高纯度保持其原有空间结构和活性酱油二次沉淀蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述酱油样品降温至

0～-10℃预冷和超声功率为500～950W，超声频率为10～25KHz，处理时间为2～10min。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述超声处理过的样品重新降温至0～-10℃。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述离心力为2000～8000g，离心时间为20～40min。

5.根据权利要求3任一所述的制备方法，其特征在于步骤（3）所述透析袋截留分子量范围5000～10000Da。

说明书

一种快速酱油二次沉淀蛋白的制备方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及一类特殊蛋白的制备方法，具体涉及一类酱油二次沉淀蛋白的制备方法。背景技术：

[0002] 2011年我国酱油产量达662万吨，其总产量已经超过我国调味品总产量的50%，是我国调味品和食品工业的重要组成部分。近十年来我国酱油行业在生产技术、设备和科学研究等方面取得了一定的进步，使我国酱油的风味、企业的经济效益和形象不断改善。但随着我国人民生活水平的不断提高和国外（主要是日本、韩国）高档次酱油进入国内市场的影响，目前消费者不但要求酱油具有良好的调味、去腥和上色功能，而且对酱油的外观质量要求也越来越高（如是否有沉淀、长霉等）。近年来消费者对国产酱油投诉最多，也是我国酱油行业普遍存在的质量问题，即为酱油在储存和销售过程中的沉淀（酱油脚或二次沉淀）问题，其严重影响了产品的外观稳定性、消费者的购买欲和企业的形象，导致企业的竞争力下降。

[0003] 酱油二次沉淀样品的制备是研究其化学组成、分子结构特征及在储藏和运输过程中发生沉淀机理的先决条件。因此，酱油二次沉淀样品的制备方法对研究和最终解决酱油二次沉淀问题尤为重要。张志航等（张志航，李国基，于淑娟，等.酱油沉淀物的溶解性能[J].华南理工大学学报（自然科学版），2000，28（11）：59-63.）采用样品静置、虹吸和透析法制备了酱油二次沉淀并对其进行了初步成分分析，结果显示酱油二次沉淀的主要成分为粗蛋白（25.97%）、糖类物质（25.51%）和灰分（10.02%）。曾新安等（曾新安，李国基，于淑娟，等.酱油沉淀成分分析[J].食品科学，2002，23（11）：32–34.）通过静置（共17d）和滤纸过滤的方法制备了酱油二次沉淀，分析结果显示酱油二次沉淀中蛋白质、脂肪、总糖、灰分和食盐含量分别为27.55%、1.99%、16.16%、54.29%和37.00%。陈有容（陈有容，刘庆玮.酱油中沉淀及浑浊形成原因初探[J].天津微生物，1989，（2）：2227）的报道显示，酱油通过55℃加热处理并静置沉淀4d制备得到的沉淀，其基本成分为89.2%的蛋白质、9.6%的碳水化物和1.2%的灰分。由以上分析可知，不同学者制备酱油二次沉淀的方法不尽相同，导致收集的酱油二次沉淀蛋白存在较大的差异，特别是采用静置法制备酱油二次沉淀的过程中一些“潜在”的沉淀蛋白并未被收集。此外，酱油二次沉淀的含量较小，且样品制备需要的时间较长（几天甚至数月）。因此，寻找一种快速、科学，并能在温和条件下全面收集酱油二次沉淀蛋白的方法尤为重要。
发明内容：

[0004] 本发明的目的是为了解决目前现有技术中存在的上述不足，提供一种快速酱油二次沉淀蛋白的制备方法。具体为，本发明提供一种全新的诱导酱油中“潜在”的二次沉淀蛋白快速形成沉淀的方法，该方法具有快速、处理条件温和、能够收集全面的酱油二次沉淀蛋白等优势。

[0005] 本发明通过如下技术方案实现。

[0006] 一种快速和科学的酱油二次沉淀蛋白制备方法，包括如下步骤：

[0007] （1）将酱油样品降温至5~-10℃预冷处理，用超声设备（功率：200~950W，频率：10~25KHz）进行适度超声处理2~16min。加速酱油中“潜在”的沉淀蛋白沉淀。

[0008] （2）超声处理过的样品重新降温至5～-10℃，进一步降低“潜在”沉淀蛋白的溶解度。

[0009] （3）在相对离心力（RCF）为2000~17800g时离心10~40min，收集沉淀，得到酱油二次沉淀粗制品。

[0010] （4）用3~5倍体积的去离子水分3次洗涤沉淀，将混悬液盛入截留分子量为3500~12000Da的透析袋进行脱盐透析，得到高纯度的酱油二次沉淀蛋白混悬液。

[0011] （5）收集酱油二次沉淀混悬液，真空冷冻干燥，在温和条件下获得高纯度酱油二次沉淀蛋白，最大程度保持其原有空间结构和活性。

[0012] 上述制备方法中，步骤（1）所采用的样品预冷处理温度为0~-10℃，超声处理条件为：功率500~950W、频率10~25Kz、时间2~10min。

[0013] 上述制备方法中，步骤（2）所采用的二次降温预冷处理温度为0~-10℃。

[0014] 上述制备方法中，步骤（3）所采用的离心处理技术参数为：RCF2000~8000g、时间20~40min。

[0015] 上述制备方法中，步骤（4）所采用的透析袋截留分子量范围5000~10000Da。

[0016] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

[0017] 本发明利用预冷、超声、二次预冷、离心、透析、真空冷冻干燥中的几种或全部技术相结合的方法制备了具有较高纯度的酱油二次沉淀蛋白，具有快速、方法科学、条件温和、酱油二次沉蛋白全面、避免了引入有机溶剂、铵盐等非蛋白成分等优势。

[0018] 说明书附图

[0019] 图1酱油二次沉淀蛋白的溶解性能

[0020] 图2酱油二次沉淀中蛋白质氨基酸组成聚类分析

[0021] 注：1-5分别代表采用静置法、离心法、低温法、超声法及本发明法处理制备的酱油二次沉淀。

具体实施方式

[0022] 下面结合实例对本发明的具体实施方式作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

[0023] 涉及本发明效果的相关检测评价方法（均以以常规静置法、离心法、低温法、超声法制备的酱油二次沉淀蛋白为对照）：

[0024] 1、酱油二次沉淀蛋白的溶解性：用磷酸氢二钾、柠檬酸、四硼酸钠、氯化钙、氢氧化钠和重蒸水等试剂配制不同pH（2.5～13.5）的缓冲溶液。取0.1g样品放入10mL不同缓冲液中溶解，用振荡器充分混合，溶液于4500rpm离心15min（20℃），取其上清用Bradford法（杨晋，伍泽堂.用Bradford法测定蛋白质含量适宜条件的探讨[J].四川师范学院报（自然科学版），1998，19（2）：198–200.）测其蛋白浓度。

[0025] 2、酱油二次沉淀蛋白氨基酸组成分析：总氨基酸的测定参照Sun等（Sun,W.Z.,Zhao,H.F.,Zhao,Q.Z.,et al.Structural characteristics of peptides extracted from Cantonese sausage during drying and their antioxidant activities[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2010,10:558–563）的方法并稍作修改。向盛有约150mg样品的水解管中添加6mL6M HCl，加入3～4滴消泡剂，在110℃的烘箱水解24h，氨基酸经苯基异硫酸酯衍生化。色氨酸测定采用碱水解法，水解条件为4M NaOH105℃、24h。水解液经稀释、定容、滤纸过滤后备用。采用外标法对氨基酸含量进行测定。

[0026] 3、聚类分析：以采用不同处理方式制备的酱油二次沉淀蛋白中的18种氨基酸含量为变量，采用聚类分析法分析采用本发明方法制备的酱油二次沉淀蛋白与其他常规方法制备的酱油二次沉淀蛋白之间的“相似性”。它以样品之间连线的距离长短直观地表示样品之间的“相似性”或“不相似性”，样品之间的连线越短表示两者的“相似性”越高，反之则越低。本分析以SPSS11.5中的“Between groups linkage”为聚类方法，以“squared Euclidean distance”来测量样品之间的距离，即样品间的“相似性”和“不相似性”（Gao X.L.,Cui C.,Ren J.Y.,et al.Changes in the chemical composition of traditional Chinese-type soy sauce at different stages of manufacture and its relation to taste[J].International Journal of Food Science and Technology，2011,46(2):243249）。

[0027] 实施例1

[0028] 酱油在冰箱预冷至-7℃，将200mL酱油在功率950W、频率20KHz的条件下超声8min，重新将样品预冷至-7℃，之后样品在相对离心力（RCF）为3600g时离心30min并收集沉淀。4倍体积去离子水洗涤沉淀并盛入截留分子量为3500Da的透析袋进行脱盐透析，得到高纯度酱油二次沉淀蛋白混悬液。将混悬液真空冷冻干燥得高纯度酱油二次沉淀蛋白。
与对照相比，采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白在酱油正常pH范围内（pH3-6）不溶于水（图1），且采用本发明方法处理过后的酱油不再出现沉淀（表1），说明采用本发明能够将酱油中的二次沉淀蛋白（包括“潜在”的二次沉淀蛋白）全部分离、收集。同时聚类分析结果表明采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白在氨基酸组成上与常规方法制备的酱油二次沉淀蛋白存在显著差异（图2），再次说明采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白不但包括常规方法制备的二次沉淀蛋白，也包括“潜在”的酱油二次沉淀蛋白。本发明是制备酱油二次沉淀蛋白的关键技术，是研究酱油二次沉淀形成机理并最终解决酱油二次沉淀问题的先决条件。因此本发明对解决严重影响我国酱油行业的二次沉淀问题具有重要意义。

[0029] 表1上清液浑浊和再次出现沉淀的情况

[0030]

[0031] 注：“-”表示无肉眼可见浑浊；“+”至“+++++”表示有“极微量”至“大量”肉眼可见沉淀。

[0032] 实施例2

[0033] 酱油在冰箱预冷至5℃，将200mL酱油在功率200W、频率10KHz的条件下超声16min，重新将样品预冷至-7℃，之后样品在相对离心力（RCF）为17000g时离心10min并收集沉淀。4倍体积去离子水洗涤沉淀并盛入截留分子量为10000Da的透析袋进行脱盐透析，得到高纯度酱油二次沉淀蛋白混悬液。将混悬液真空冷冻干燥得高纯度酱油二次沉淀蛋白。与对照相比，采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白在酱油正常pH范围内（pH3-6）不溶于水，且采用本发明方法处理过后的酱油不再出现沉淀（表1），说明采用本发明能够将酱油中的二次沉淀蛋白（包括“潜在”的二次沉淀蛋白）全部分离、收集。同时聚类分析结果表明采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白在氨基酸组成上与常规方法制备的酱油二次沉淀蛋白存在显著差异，再次说明采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白不但包括常规方法制备的二次沉淀蛋白，也包括“潜在”的酱油二次沉淀蛋白。

[0034] 实施例3

[0035] 酱油在冰箱预冷至-10℃，将200mL酱油在功率500W、频率15KHz的条件下超声6min，重新将样品预冷至-10℃，之后样品在相对离心力（RCF）为5000g时离心25min并收集沉淀。4倍体积去离子水洗涤沉淀并盛入截留分子量为5000Da的透析袋进行脱盐透析，得到高纯度酱油二次沉淀蛋白混悬液。将混悬液真空冷冻干燥得高纯度酱油二次沉淀蛋白。与对照相比，采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白在酱油正常pH范围内（pH3-6）不溶于水，且采用本发明方法处理过后的酱油不再出现沉淀（表1），说明采用本发明能够将酱油中的二次沉淀蛋白（包括“潜在”的二次沉淀蛋白）全部分离、收集。同时聚类分析结果表明采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白在氨基酸组成上与常规方法制备的酱油二次沉淀蛋白存在显著差异，再次说明采用本发明制备的酱油二次沉淀蛋白不但包括常规方法制备的二次沉淀蛋白，也包括“潜在”的酱油二次沉淀蛋白。本发明是制备酱油二次沉淀蛋白的关键技术，是研究酱油二次沉淀形成机理并最终解决酱油二次沉淀问题的先决条件。因此本发明对解决严重影响我国酱油行业的二次沉淀问题具有重要意义。

[0036] 以上所述仅是本发明较佳的实施例，并非对本发明的技术方案做任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何形式的修改、等同变化与修饰，均属于本发明的技术方案的范围内。