一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及使用方法转让专利
申请号 : CN201210539588.9
文献号 : CN102988981B
文献日 : 2015-03-04
发明人 : 黄倢 , 谢国驷 , 隋虎辰 , 王秀华 , 边慧慧 , 史成银 , 刘莉
申请人 : 中国水产科学研究院黄海水产研究所
摘要 :
本发明涉及一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用方法。其特征是上述的佐剂提取自谷物、酵母、部分真菌或海藻等原料，其有效成分为包含β-1，3-葡聚糖和β-1，3-葡聚糖的天然、人工改造或人工合成产物。该佐剂的应用可增强爱德华氏菌的灭活菌体、菌蜕成分、弱毒菌株、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上的爱德华氏菌疫苗抗原接种后的特异性免疫保护率；应用中可以与疫苗抗原混合使用，也可以制成单一制剂但与疫苗抗原同时使用，还可以与疫苗抗原不同时使用。
权利要求 :
1.β—1，3—葡聚糖在制备增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的爱德华氏菌疫苗的抗原包含源自于迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌或保科爱德华氏菌的一种或一种以上的疫苗抗原；疫苗抗原类型包括灭活菌体、菌蜕成分、弱毒菌株、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。
3.如权利要1所述的应用，其特征在于所述佐剂与疫苗抗原混合制成疫苗制剂使用，或者制成不含疫苗抗原的佐剂制剂但与疫苗抗原同时使用，或者与疫苗抗原不同时使用。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述佐剂的三种应用方式是：
(1)与疫苗抗原混合制成疫苗制剂使用时，加入到包含爱德华氏菌疫苗抗原的针剂、浸浴剂或口服剂中上述佐剂的有效成分与疫苗抗原重量比为1/10—1000/1；
(2)制成不含疫苗抗原的佐剂制剂但与疫苗抗原同时使用时，上述佐剂的有效成分在疫苗制剂对水生动物进行免疫接种前临时添加并充分混匀，添加量为疫苗抗原重量的
1/10—1000/1；
(3)与疫苗抗原不同时使用时，加入到水生动物饲料或浸浴水体中的上述佐剂的有效成分按饲料或浸浴水体重量的1/100000—1/100进行添加，添加时间为疫苗制剂对待免疫水生动物进行免疫接种前3日至接种后30日以内，可以给药1次或多次。
说明书 :
一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及使用方法
技术领域
[0001] 本发明涉及爱德华氏菌疫苗免疫防治技术，具体是一种可以增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用方法。
背景技术
[0002] 爱德华氏菌（Edwardsiella sp.），是当前水产养殖中的主要病原菌之一，目前包含迟缓爱德华氏菌(E. tarda)、鮰鱼爱德华氏菌(E. ictaluri)和保科爱德华氏菌(E. hoshinae)三个种，其宿主范围十分广泛，鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及包括人类的哺乳类都有感染报道，且呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水环境中，主要分布在中国、澳大利亚、日本、印度、以色列、马来群岛、美国、巴拿马等热带和亚热带国家和地区。从1962年首次报道至今，该病原对多种鱼类养殖业造成了巨大损失。采用抗生素和化学药物等方法进行预防或治疗，往往带来诸如病原的耐药性、药物残留以及水环境的污染等弊端，也引起了食品安全及环境污染等相关问题。当前在水生动物疾病防控方面，以疫苗免疫技术为基础的综合防控技术体系是被国际上普遍认可、接受并积极推广的病害控制技术，具有良好的开发应用前景。目前，国内处对爱德华氏菌疫苗有了较为广泛的研究，并取得了一系列的研究成果。其中传统疫苗（包括灭活疫苗、细胞提取物、佐剂疫苗）因具有制作简单，成本低、安全性高等优点成为各种疫苗形式的首选,但研究表明，爱德华氏菌与其他病原菌不同，常规灭活疫苗所产生的免疫保护效果不尽理想。Gutierrez和Miyazaki (1994) 研究中福尔马林灭活的爱德华氏菌注射免疫日本鳗的相对保护率（RPS）仅为12.5—25%；Sun等（2011）报道用爱德华氏菌的单价灭活疫苗免疫牙鲆（Paralichthys olivaceus）的RPS只有33.3%；我们前期实验采用常规技术制作的E. tarda灭活疫苗的相对保护率(RPS)也不到40%。近期，Hossain和Kawai (2009)和Hossain等(2011)报道了采用高压灭活(600psi，5min)的方式制备的爱德华氏菌灭活疫苗具有较好的免疫效果，腹腔注射日本鳗(Anguilla japonica)后，其RPS在80%—85%范围内。但高压的方法存在技术局限性，例如设备代价非常高，技术难度大，难以对大批量细菌进行生产性的操作。近年来，随着生物工程技术的迅猛发展，爱德华氏菌新型疫苗不断涌现，并在水生动物实验中显示出良好的应用前景，例如DNA疫苗（Jiao等（2009）、亚单位疫苗（Liu 等（2005），Jiao等（2009）、菌蜕疫苗（Kwon 等（2007）、减毒活疫苗（Mo等，2007；Xiao等，2011）等也有较多报道，，但出于应用安全性、研制周期及成本等因素考虑，这些新型疫苗仍然得不到商品化的应用。总体来说，爱德华氏菌疫苗的免疫效果不尽理想，近年来，人们已开始重视佐剂在其免疫技术中的应用，并取得了一定的成果。佐剂是非特异性免疫增强剂，与抗原混合使用可以增强机体免疫应答或改变免疫应答类型。Castro等（2008）研究结果用灭活爱德华氏菌疫苗与商业佐剂Montanide ISA 763 AVG（Seppic，France）联合使用，1次注射接种免疫大菱鲆，其RPS在6个月后仍然超过90%，而此时单一注射免疫灭活组的RPS只有20%；上述的Sun等（2011）的报道中，当灭活的爱德华氏菌与鳗弧菌（Vibrio anguillarum）等另三种菌联合使用时，其RPS可达到70.9%，该结果中鳗弧菌等其他三种菌灭活疫苗起到了爱德华氏菌灭活疫苗免疫佐剂的作用。
[0003] 目前在水产养殖中疫苗佐剂种类较少，且应用效果各有差异，其中应用于爱德华氏菌疫苗的佐剂报道甚少，因此开发其新型高效佐剂对于该病原的免疫防控具有重要意义。β-1，3-葡聚糖是一种多糖，主要来源于包括谷物、酵母、部分真菌和海藻中。研究证实葡聚糖自身具有特殊的分子结构使其易被免疫系统识别及接受，可有效激活巨噬细胞、嗜中性白血球等，刺激释放细胞因子及特异性抗体的生成，并诱导机体的体液与细胞免疫应答，提高机体的免疫功能。β-葡聚糖还具有清除游离基、抗辐射、抗肿瘤、溶解胆固醇，预防高脂血症作用，对滤过性病毒、真菌、细菌等引起的感染也具有一定的抵抗作用，目前在医药、食品、化妆品等行业已有着较广泛应用。葡聚糖在水产养殖中的应用主要是作为非特异性免疫增强剂使用，例如常见添加到虾饲料中用于提高对虾的非特异性抗病力，也有作为鱼类饲料添加剂用以非特异性地提高鱼的抗病力，葡聚糖的添加具有增强水生动物对病原的抵抗力，促进生长，并可提高动物的生产性能及饲料利用率，但目前没有将葡聚糖作为爱德华氏菌疫苗的佐剂的研究报道、专利或应用。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用方法，以提高爱德华氏菌疫苗抗原接种后的免疫效果。
[0005] 本发明所述的一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂，为从谷物、酵母、真菌或海藻中获得的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品；以及及具有增强免疫接种效果的，对上述的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品进行人工改造、合成的产物。
[0006] 上述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品的该制品的β-1,3-葡聚糖，或具有增强疫苗接种效果的β-1,3-葡聚糖的人工改造、合成产物。
[0007] 本发明的增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂的使用方法，包括如下三种方式：
[0008] 1）与疫苗抗原混合制成疫苗制剂使用；
[0009] 2）制成不包含疫苗抗原的佐剂制剂，在免疫接种前与疫苗抗原混合后同时使用；
[0010] 3）与疫苗抗原不同时使用。
[0011] 对于第1种方式，加入到包含疫苗抗原的针剂、浸浴剂或口服剂中，上述佐剂有效成分与疫苗抗原重量比为1/10—1000/1，其免疫接种途径可以为注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫、口服免疫或其他将佐剂有效成分和疫苗抗原导入到水生动物体内的任何免疫接种途径。
[0012] 对于第2种方式，含有上述佐剂有效成分的制剂在疫苗抗原对水生动物进行免疫接种前临时添加到含有疫苗抗原的制剂中并充分混匀，添加量为疫苗抗原重量的1/10—1000/1，其免疫接种方式可以为注射、创伤、浸浴或口服免疫。
[0013] 对于第3种方式，加入到水生动物饲料或浸浴水体中的上述佐剂的有效成分与饲料或浸浴水体重量比为1/100000—1/100，添加时间为疫苗制剂对待免疫水生动物进行注射、创伤、浸浴或口服免疫接种前3日至接种后30日以内，实施1—5日的投喂或浸浴等免疫增强操作。
[0014] 以上免疫应用方式使佐剂有效成分β-1,3-葡聚糖在爱德华氏菌疫苗抗原与水生动物免疫系统作用时达到一定的浓度，从而让免疫细胞在递呈、加工、识别疫苗抗原的过程中受到葡聚糖的刺激，使免疫细胞的活性得以进一步提高，从而更好地活化免疫系统对疫苗抗原的应答，有效增强疫苗抗原的免疫效果。本发明发现佐剂有效成分的剂量对疫苗免疫效果有重要影响，在佐剂安全浓度范围以内，两者具有一定的相关性。当佐剂有效成分的使用剂量超过安全剂量范围时，会对水生动物有致死作用，因此有必要针对待免疫水生动物种类及具体的免疫方式条件下进行佐剂的给药方式测试或查明给药后2—4周内不会导致水生动物死亡的最高剂量，以此确定上述佐剂有效成分在水生动物中使用时的安全剂量。本发明证实上述佐剂的有效成分在水生动物体内的剂量达到安全剂量的1/100—4/5时可增强疫苗的免疫效果。
[0015] 本发明的爱德华氏菌疫苗佐剂可应用于鱼类、两栖类和爬行类的疫苗免疫接种，包括海水养殖鱼类（如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、石斑鱼、鲈鱼、真鲷、军曹鱼、大西洋鲑、河鲀等）、半咸水养殖鱼类（如罗非鱼、虹鳟、鲻鱼等）、洄游鱼类（如鳗鲡、小黄鱼等）、淡水养殖鱼类（如青鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲶鱼、鳜鱼、鲟鱼、澳洲宝石鲈等）、观赏鱼（如金鱼、锦鲤等）、两栖类（如牛蛙、大鲵等）和爬行类（如鳖、龟、蛇等）的疫苗接种。不同的水生动物的安全剂量和有效剂量不同，对于特定水生动物的具体应用剂量，应该进行单独测试。
[0016] 本发明的积极效果在于：所涉及佐剂可以提高爱德华氏菌疫苗抗原免疫接种后的特异性和非特异性免疫保护力。对于爱德华氏菌这种胞内感染或具有免疫逃避能力的病原的疫苗，本发明佐剂可有效的增强免疫保护作用，使用方法安全，对操作人员和环境无害，因而具有良好的应用前景和市场推广价值。
具体实施方式
[0017] 鉴于佐剂有效成分的剂量对疫苗抗原免疫效果有着重要影响，佐剂有效成分的使用剂量过低往往达不到增强免疫的效果，而过高的使用剂量往往会对水生动物产生不利或致死作用。因此上述佐剂在使用中应首先针对具体的水生动物种类、年龄和接种方法等通过疫苗保护实验确定上述佐剂有效成分在具体疫苗产品中的安全剂量范围及最佳使用浓度。在爱德华氏菌疫苗制剂中佐剂有效成分的浓度为1mg/g—20mg/g（佐剂有效成分重量/疫苗制剂重量），水生动物饲料中佐剂有效成分的浓度为0.1g/kg—5g/kg（佐剂有效成分重-3量/饲料重量），在给药后水生动物体内佐剂有效成分的浓度达到1.0×10 mg/g—5.0mg/g（佐剂有效成分重量/水生动物体重）。
[0018] 爱德华氏菌疫苗制剂中的抗原成分可以源自于迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌或保科爱德华氏菌等爱德华氏菌属的细菌的一种或一种以上的的病原的抗原或能在水生动物体内产生相应的抗原，也可以是包含源自爱德华氏菌的抗原和其他病原菌或病毒的抗原制成的联合疫苗制剂。疫苗抗原的类型可以为灭活菌体、菌蜕成分、弱毒株、减毒株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因的表达载体的任何一种或一种以上，上述抗原在疫苗制剂中可是单一种或一种以上以联合、整合或多价方式存在，制成的爱德华氏菌疫苗制剂除了抗原或能产生抗原的表达载体以外，还可包含其它的佐剂、保护剂、防腐剂、稀释剂、溶剂等多种成分。本发明佐剂在应用中可以与疫苗抗原混合使用，也可以制成单一制剂与疫苗抗原混合后同时使用，还可以与疫苗抗原不同时使用。应用中的免疫接种方式可以为注射免疫、创伤免疫、浸泡免疫或口服免疫。
[0019] 本发明证明酵母提取物中的β-1,3-葡聚糖能有效起到爱德华氏菌疫苗佐剂的作用，应用中与爱德华氏菌灭活疫苗协同使用时，能显著提高爱德华氏菌灭活疫苗的免疫保护率。所述的β-1,3-葡聚糖是从谷物、酵母、真菌或海藻中提取的，本发明证实了β-1,3-葡聚糖具有增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的功效，因此本发明的有效成分的功效包含β-1,3-葡聚糖的天然产物、人工改造产物或人工合成产物。天然的β-1,3-葡聚糖可提取自谷物、酵母、部分真菌和海藻等，对于不改变β-1,3-葡聚糖核心分子结构的人工改造产物或人工合成及仿制的产物可能增强或减弱本发明所涉及的功效，只要这种功效依然保留，就仍属于本专利的保护范围之内。
[0020] 本发明的使用方法如下：
[0021] （1）佐剂安全剂量的确定：制备包含β-葡聚糖的0.1%—10%的PBS（pH7.2）溶液，经0.22μm的滤膜过滤除菌，再用不同浓度的上述佐剂接种待免疫水生动物，接种方式可以是注射免疫、创伤免疫、浸泡免疫或口服免疫。免疫水生动物观察2周，根据实验结果来确定该佐剂安全剂量。
[0022] （2）爱德华氏菌疫苗制剂制备及使用：灭活疫苗制备中，向爱德华氏菌悬液中加入甲醛（36.5—38%, w/v），调节其终浓度为0.3%--1%，4℃过夜，用PBS（pH7.2）清洗3次后，制备一定浓度的灭活疫苗。将安全剂量范围内的佐剂与灭活疫苗按一定的比例混合后对待免疫水生动物进行免疫接种，再将水生动物进行正常养殖管理即可。使用减毒活疫苗时，则无需进行灭活处理。
[0023] （3）疫苗产品中佐剂最佳剂量的确定：
[0024] 疫苗制剂的使用方法可以有以下三种方式：1）与疫苗抗原混合制成疫苗制剂使用；或者2）制成单一制剂与疫苗抗原混合后同时使用；或者3）与疫苗抗原不同时使用。
[0025] 对于第1种方式，加入到包含爱德华氏菌疫苗抗原的针剂、浸浴剂或口服剂中上述佐剂有效成分与疫苗抗原重量比为1/10—1000/1，其免疫接种方式可以为注射、创伤、浸浴或口服免疫。
[0026] 对于第2种方式，上述佐剂有效成分在爱德华氏菌疫苗制剂对水生动物进行免疫接种前临时添加并充分混匀，添加量为疫苗抗原重量的1/10—1000/1，其免疫接种方式可以为注射、创伤、浸浴或口服免疫。
[0027] 对于第3种方式，加入到水生动物饲料或浸浴水体中的上述佐剂的有效成分与饲料或浸浴水体重量比为1/100000—1/100，添加时间为爱德华氏菌疫苗制剂对待免疫水生动物进行注射、创伤、浸浴或口服免疫接种前3日至接种后15日以内，实施1—5日的投喂或浸浴等免疫增强操作。
[0028] 待免疫水生动物经上述疫苗制剂接种后，30—60天后进行人工感染实验，通过14—60天后的相关生理生化指标（如增重率、抗体效价等）及相对保护率（RPS）等免疫指标的分析，以确定佐剂的最佳使用剂量。
[0029] 实施例1：β-1,3-葡聚糖对大菱鲆（Scophthatmus maximus）注射安全剂量的确定
[0030] 选用健康大菱鲆（11.4±1.8）g，试验前在水泥池中暂养2周后，置于圆形玻璃钢3
桶（盛水0.7米 ）中，流水养殖，水温为18±2℃，盐度28‰±2‰，24小时连续充气。试验期间按鱼体重3%投喂配合饲料，日投喂3次，每日换水并清污2次。注射前对大菱鲆用MS222（1:9000）进行浸泡麻醉处理。
桶（盛水0.7米 ）中，流水养殖，水温为18±2℃，盐度28‰±2‰，24小时连续充气。试验期间按鱼体重3%投喂配合饲料，日投喂3次，每日换水并清污2次。注射前对大菱鲆用MS222（1:9000）进行浸泡麻醉处理。
[0031] 分别用浓度为2、5、8、10和20 mg/mL的β-1,3-葡聚糖腹腔注射20尾大菱鲆，注射剂量为100μL/尾，观察14天。
[0032] 各实验组大菱鲆14天中死亡情况见表1，由结果确定β-1,3-葡聚糖对大菱鲆的最大安全腹腔注射剂量为1000μg/尾，即87.7μg/g（葡聚糖/鱼体重）。
[0033] 表1. β-1,3-葡聚糖对大菱鲆注射安全剂量试验
[0034]
[0035] 实施例2：β-1,3-葡聚糖添加于福尔马林灭活E. tarda疫苗中，免疫接种大菱鲆（S. maximus）。
[0036] 试验用鱼及养殖管理同实施例1。
[0037] 将E. tarda 1101接种于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，28℃振荡培养过夜，再以1：100转接至新鲜TSB中，28℃振荡培养5h，收集菌液，6000g，4℃，10min，无菌PBS（pH7.2）清洗3次，重悬于PBS，并稀释涂布于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），细菌计数采用平板计数法，
9
制成1×10 CFU/mL菌悬液，加入福尔马林（含甲醛36.5—38%, w/v），调节其终浓度为1%，
4℃过夜，制成灭活疫苗，PBS洗涤菌体3次（方法同上），4℃保存。另取灭活后的菌液0.2mL
8
涂TSA，28℃培养48h，确定无菌落生长。疫苗安全性检测中，取疫苗调节浓度至10 CFU/mL，腹腔注射20尾大菱鲆，注射剂量为100μL/尾，观察14天，以确定疫苗制剂的安全性。
9
制成1×10 CFU/mL菌悬液，加入福尔马林（含甲醛36.5—38%, w/v），调节其终浓度为1%，
4℃过夜，制成灭活疫苗，PBS洗涤菌体3次（方法同上），4℃保存。另取灭活后的菌液0.2mL
8
涂TSA，28℃培养48h，确定无菌落生长。疫苗安全性检测中，取疫苗调节浓度至10 CFU/mL，腹腔注射20尾大菱鲆，注射剂量为100μL/尾，观察14天，以确定疫苗制剂的安全性。
[0038] 对健康大菱鲆进行随机分组，各组设3个平行组。试验设对照组（注射PBS）、β-1,3-葡聚糖组、灭活疫苗组、不同浓度的β-1, 3-葡聚糖与灭活疫苗配伍组，免疫试验分组见表2。
[0039] 表2. 大菱鲆免疫试验分组
[0040]
[0041] 采用腹腔注射免疫大菱鲆，注射剂量为100μL/尾。
[0042] 免疫28天后，大菱鲆腹腔注射新鲜E. tarda菌液（1.35×104CFU/尾），进行人工感染试验。
[0043] 攻毒后14天统计各试验组的死亡率，并根据公式RPS = [1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)] × 100%。计算RPS。结果见表3。
[0044] 表3. 葡聚糖为E. tarda灭活疫苗佐剂对大菱鲆的免疫保护效果（平均值±标准差）
[0045]
[0046] 以上结果表明，单纯用E. tarda福尔马林灭活疫苗（107cfu/尾）或43.9μg/g （佐剂剂量/体重）β-1,3-葡聚糖注射大菱鲆的免疫保护效果较低，其RPS值分别为18.5%和14.7%。灭活疫苗添加21.9、43.9和87.7μg/g（佐剂剂量/体重）β-1,3-葡聚糖时，可不同程度的提高RPS。其中以灭活疫苗添加43.9μg/g（佐剂剂量/体重）β-1,3-葡聚糖具有较好的免疫保护效果，RPS提高到64%。以上结果证明本发明佐剂可较好的增强疫苗的免疫保护效果。
[0047] 实施实例3：β-1,3-葡聚糖添加于福尔马林灭活E. tarda疫苗中，免疫大菱鲆对血清抗体效价的影响
[0048] 试验用鱼及养殖管理同实施例1。
[0049] 疫苗制剂制备及试验设计（实验分组和免疫方法）同实施例2，免疫28天后，每组各取5尾鱼抽取0.1mL尾静脉血，室温静置2h，再置于4°C，12h，收集血清，混合同组鱼血清，-20℃贮存。
[0050] 血清的抗体效价测定参照抗大菱鲆IgM的小鼠单克隆抗体（Aquatic Diagnostic8
Ltd，英国）使用说明，每孔加入100µL 1.0×10cfu/mL重悬于包被液中的E. tarda 1101悬液加盖后4℃过夜包被96孔酶标板，然后再向各孔加入50 µL PBS稀释的0.05% (v/v)戊二醛，22℃静置20 min，用低盐洗液洗板3次；加入250 µL 1% BSA封闭，22℃静置2h，低盐溶液洗板3次；再分别向每孔中加入100µL用PBS系列稀释的大菱鲆血清，每个稀释度作3个平行，22℃静置3 h后高盐洗液洗板5次，最后一次孵育5min；每孔加入100 µL再生的抗大菱鲆IgM单克隆抗体，22℃静置60min后按前述高盐溶液洗板方法洗板5次；再向每孔中加入100 µL 1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗（天根生化科技有限公司），22℃静置60 min，按前述高盐溶液洗板5次；之后每孔加入100 µL TMB溶液，22℃显色10 min；每孔加入50 µL 2M H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm处测OD值。分析样品(P)和空白对照(N)的OD值，计算P/N比值，P/N≥3.0时样品为阳性，P/N＜3.0时样品为阴性。各组的抗体效价结果见表4。
Ltd，英国）使用说明，每孔加入100µL 1.0×10cfu/mL重悬于包被液中的E. tarda 1101悬液加盖后4℃过夜包被96孔酶标板，然后再向各孔加入50 µL PBS稀释的0.05% (v/v)戊二醛，22℃静置20 min，用低盐洗液洗板3次；加入250 µL 1% BSA封闭，22℃静置2h，低盐溶液洗板3次；再分别向每孔中加入100µL用PBS系列稀释的大菱鲆血清，每个稀释度作3个平行，22℃静置3 h后高盐洗液洗板5次，最后一次孵育5min；每孔加入100 µL再生的抗大菱鲆IgM单克隆抗体，22℃静置60min后按前述高盐溶液洗板方法洗板5次；再向每孔中加入100 µL 1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗（天根生化科技有限公司），22℃静置60 min，按前述高盐溶液洗板5次；之后每孔加入100 µL TMB溶液，22℃显色10 min；每孔加入50 µL 2M H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm处测OD值。分析样品(P)和空白对照(N)的OD值，计算P/N比值，P/N≥3.0时样品为阳性，P/N＜3.0时样品为阴性。各组的抗体效价结果见表4。
[0051] 表4. 葡聚糖为E. tarda灭活疫苗佐剂对大菱鲆的血清抗体效价的影响（平均值±标准差）
[0052]7
[0053] 以上结果表明，对照组（PBS），E. tarda福尔马林灭活疫苗（10cfu/尾）、43.9μg/g （佐剂剂量/体重）β-1,3-葡聚糖注射大菱鲆的血清抗体效价值很低，分别为
106.7±37.0、170.7±73.9和213.3±73.9，灭活疫苗添加21.9、43.9和87.7μg/g（佐剂剂量/体重）β-1,3-葡聚糖时，可不同程度的提高抗体效价。其中以灭活疫苗添加
43.9μg/g（佐剂剂量/体重）β-1,3-葡聚糖具有较好的免疫保护效果，抗体效价值达到
682.7±147.8。以上结果证明本发明佐剂可较好的增加血清中的抗体效价。
106.7±37.0、170.7±73.9和213.3±73.9，灭活疫苗添加21.9、43.9和87.7μg/g（佐剂剂量/体重）β-1,3-葡聚糖时，可不同程度的提高抗体效价。其中以灭活疫苗添加
43.9μg/g（佐剂剂量/体重）β-1,3-葡聚糖具有较好的免疫保护效果，抗体效价值达到
682.7±147.8。以上结果证明本发明佐剂可较好的增加血清中的抗体效价。
[0054] 实施例4：β-1,3-葡聚糖添加于福尔马林灭活鮰鱼爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）
[0055] 疫苗中，免疫黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）的应用方式。
[0056] 选择健康黄颡鱼，首先参照实验例1和2中的方法进行β-1,3-葡聚糖与E. ictaluri灭活疫苗配伍在饲料中的最佳应用剂量的确定。以此为基础确定饲料中葡聚糖的8
添加量，应用中首先采用浸泡免疫，将黄颡鱼置于有终浓度为10CFU/mL灭活E. ictaluri疫苗的新鲜淡水中，10—20min后，移入淡水中正常养殖。14—30天后，加强免疫1次（加强免疫隔时间可视鱼的规格而定，鱼体规格较小则时间可缩短，鱼体规格较大则时间可适当延长），投喂含有葡聚糖与E. ictaluri灭活疫苗的免疫饲料，免疫饲料中灭活疫苗添加量为0.1g/kg（灭活疫苗重量/饲料重量），连续投喂5天，再进行正常饲养管理。加强免疫后30—60天，计算试验期间的增重率，另取部分实验用黄颡鱼腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜E. ictaluri菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对葡聚糖作为E. ictaluri灭活疫苗的佐剂免疫黄颡鱼应用方式进行评估，具有较好的增重效果且RPS值超过70%，视为合格。
添加量，应用中首先采用浸泡免疫，将黄颡鱼置于有终浓度为10CFU/mL灭活E. ictaluri疫苗的新鲜淡水中，10—20min后，移入淡水中正常养殖。14—30天后，加强免疫1次（加强免疫隔时间可视鱼的规格而定，鱼体规格较小则时间可缩短，鱼体规格较大则时间可适当延长），投喂含有葡聚糖与E. ictaluri灭活疫苗的免疫饲料，免疫饲料中灭活疫苗添加量为0.1g/kg（灭活疫苗重量/饲料重量），连续投喂5天，再进行正常饲养管理。加强免疫后30—60天，计算试验期间的增重率，另取部分实验用黄颡鱼腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜E. ictaluri菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对葡聚糖作为E. ictaluri灭活疫苗的佐剂免疫黄颡鱼应用方式进行评估，具有较好的增重效果且RPS值超过70%，视为合格。
[0057] 实施例5： β-1,3-葡聚糖添加于灭活迟缓爱德华氏菌（E. tarda）疫苗中，免疫罗非鱼（Oreochromis niloticus）的应用方式。
[0058] 首先制备具有免疫原性的迟缓爱德华氏菌（E. tarda）疫苗，该疫苗中所含的抗原可以为爱德华氏菌的灭活菌体、菌蜕成分、弱毒菌株或减毒菌株。应用中，参照实验例1和2中的方法对健康罗非鱼进行β-1,3-葡聚糖与E. tarda疫苗配伍在饲料中的最佳应用剂量的确定。以此为基础确定饲料中葡聚糖的添加量，应用中对罗非鱼采用浸泡免疫，将罗非8
鱼置于终浓度为10CFU/mL E. tarda疫苗的水体中，10—20min后，移入新鲜水体中正常养殖。14—30天后，进行加强免疫1次（加强免疫间隔时间可视鱼的规格而定，鱼体规格较小则时间可缩短，鱼体规格较大则时间可适当延长）。投喂含有葡聚糖与E. tarda疫苗配伍的免疫饲料，免疫饲料中疫苗添加量为0.1g/kg（疫苗重量/饲料重量），连续投喂5天，60天后，计算试验期间的增重率，另对罗非鱼腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜E. tarda菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对葡聚糖为E. tarda疫苗佐剂免疫罗非鱼应用方式进行评估，具有一定的增重效果且RPS值超过70%，视为合格。
鱼置于终浓度为10CFU/mL E. tarda疫苗的水体中，10—20min后，移入新鲜水体中正常养殖。14—30天后，进行加强免疫1次（加强免疫间隔时间可视鱼的规格而定，鱼体规格较小则时间可缩短，鱼体规格较大则时间可适当延长）。投喂含有葡聚糖与E. tarda疫苗配伍的免疫饲料，免疫饲料中疫苗添加量为0.1g/kg（疫苗重量/饲料重量），连续投喂5天，60天后，计算试验期间的增重率，另对罗非鱼腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜E. tarda菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对葡聚糖为E. tarda疫苗佐剂免疫罗非鱼应用方式进行评估，具有一定的增重效果且RPS值超过70%，视为合格。
[0059] 实施例6：β-1,3-葡聚糖添加于E. tarda的esrB、evpC双基因缺失减毒株中，免疫大菱鲆（S. maximus）的应用方式。
[0060] 选择健康大菱鲆，首先参照实验例1和2中的方法进行β-1,3-葡聚糖在饲料中最佳添加量及E. tarda的esrB、evpC双基因缺失减毒株浸泡大菱鲆最大安全浓度的确定。应用中首先在海水中浸泡免疫5—10min，浸泡海水中所用E. tarda的esrB、evpC双基因缺失减毒株的浓度为上述最大安全浓度的1/10，再移入新鲜海水中正常养殖。14—30天后，连续5天投喂含最佳应用剂量β-1,3-葡聚糖的饲料，再进行正常饲养管理。加强免疫后30—60天，计算试验期间的增重率，另对大菱鲆腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜野生E. tarda菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对β-1,3-葡聚糖作为E. tarda减毒活疫苗佐剂免疫大菱鲆应用方式进行评估，RPS值超过70%，视为合格。
[0061] 实施例7： β-1,3-葡聚糖与灭活的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和迟缓爱德华氏菌（E. tarda）二联灭活疫苗配伍免疫牛蛙（Rana catesbeiana）的应用方式。
[0062] 首先用传统灭活方法（如福尔马林灭活、热灭活、高压灭活等）制备灭活的无乳链球菌（S. agalactiae）和迟缓爱德华氏菌（E. tarda）疫苗。按1：1的比例配制成二联疫苗，8
疫苗中两种灭活细菌的终浓度均为10CFU/mL。免疫饲料制备，按0.25、0.5、0.75和1g/kg（佐剂有效成分重量/饲料重量）的配比将不同剂量的β-1,3-葡聚糖添加在饲料中。应用中，首先将健康牛蛙浸泡二联疫苗10—20min后取出，14—30天后，连续5天投喂含有葡聚糖饲料。60天后，比较饲料中添加不同剂量葡聚糖对增重率的影响，另对各配比组中的牛蛙随机分成两小组，各小组分别用10倍LD50剂量的新鲜S. agalactiae和E. tarda菌液进行腹腔注射，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对葡聚糖作为S. agalactiae和E. tarda二联灭活疫苗佐剂免疫牙牛蛙应用方式进行评估，感染实验结果中对上述两种病原的任何一种其RPS超过70%，并具有一定的增重效果其所对应的葡聚糖添加量视为可应用添加量，其佐剂作用也视为合格。
疫苗中两种灭活细菌的终浓度均为10CFU/mL。免疫饲料制备，按0.25、0.5、0.75和1g/kg（佐剂有效成分重量/饲料重量）的配比将不同剂量的β-1,3-葡聚糖添加在饲料中。应用中，首先将健康牛蛙浸泡二联疫苗10—20min后取出，14—30天后，连续5天投喂含有葡聚糖饲料。60天后，比较饲料中添加不同剂量葡聚糖对增重率的影响，另对各配比组中的牛蛙随机分成两小组，各小组分别用10倍LD50剂量的新鲜S. agalactiae和E. tarda菌液进行腹腔注射，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对葡聚糖作为S. agalactiae和E. tarda二联灭活疫苗佐剂免疫牙牛蛙应用方式进行评估，感染实验结果中对上述两种病原的任何一种其RPS超过70%，并具有一定的增重效果其所对应的葡聚糖添加量视为可应用添加量，其佐剂作用也视为合格。
[0063] 实施例8： β-1,3-葡聚糖添加于福尔马林灭活制备的多联疫苗中，免疫牙鲆（Paralichthys olivaceus）的应用方式。
[0064] 首先用传统灭活方法（如福尔马林灭活、热灭活、高压灭活等）对鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌（E. tarda）进行灭活，再将三者按1：1：1的比例配制成三联疫苗，该疫苗中三种灭活细菌的终浓度均为8
10CFU/mL。免疫饲料制备，按0.25、0.5、0.75和1g/kg（佐剂有效成分重量/饲料重量）的配比将不同剂量的β-1,3-葡聚糖添加在饲料中。应用中，首先将健康牙鲆浸泡于三联疫苗10—20min后，再移入新鲜海水中正常养殖。14—30天后，连续5天投喂含有葡聚糖饲料。60天后，比较饲料中添加不同剂量葡聚糖对增重率的影响，另对各配比组中的鱼随机分成三小组，各小组分别用10倍LD50剂量的新鲜V. anguillarum、A. hydrophila和E. tarda菌液，进行人工感染试验，感染采用腹腔注射方式。感染后14—30天，统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对葡聚糖作为V. anguillarum、A. hydrophila和E. tarda三联灭活疫苗佐剂免疫牙鲆应用方式进行评估，感染实验结果中对以上三种菌的任何一种其RPS超过70%，并具有一定的增重效果其所对应的葡聚糖添加量视为可应用添加量，其佐剂作用也视为合格。
10CFU/mL。免疫饲料制备，按0.25、0.5、0.75和1g/kg（佐剂有效成分重量/饲料重量）的配比将不同剂量的β-1,3-葡聚糖添加在饲料中。应用中，首先将健康牙鲆浸泡于三联疫苗10—20min后，再移入新鲜海水中正常养殖。14—30天后，连续5天投喂含有葡聚糖饲料。60天后，比较饲料中添加不同剂量葡聚糖对增重率的影响，另对各配比组中的鱼随机分成三小组，各小组分别用10倍LD50剂量的新鲜V. anguillarum、A. hydrophila和E. tarda菌液，进行人工感染试验，感染采用腹腔注射方式。感染后14—30天，统计死亡率，并根据公式RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。计算RPS，对所获数据进行分析，对葡聚糖作为V. anguillarum、A. hydrophila和E. tarda三联灭活疫苗佐剂免疫牙鲆应用方式进行评估，感染实验结果中对以上三种菌的任何一种其RPS超过70%，并具有一定的增重效果其所对应的葡聚糖添加量视为可应用添加量，其佐剂作用也视为合格。
[0065] 实施例9： 疫苗口服剂中β-1,3-葡聚糖与疫苗配伍中适宜配比的确认
[0066] 以β-1,3-葡聚糖添加于灭活的迟缓爱德华氏菌（E. tarda）疫苗中对日本鳗鲡（Anguilla japonica）实施口服免疫为例，对疫苗接种中佐剂与抗原浓度的适宜配比进行确认。
[0067] 首先制备具有免疫原性的迟缓爱德华氏菌疫苗，该疫苗中所含的抗原可以为细菌的灭活菌体、菌蜕成分、弱毒菌株、减毒菌株、保护性抗原蛋白、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的一种或一种以上以联合、整合或多价方式。应用中，选择健