霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒。该霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.6754的杂交瘤细胞株分泌产生。该霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体可用于检测霍乱弧菌。本发明还公开了一种霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒。

权利要求

1.霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No. 6754的杂交瘤细胞株分泌产生。

2.分泌产生霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.

6754。

说明书

霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于免疫学领域，具体涉及一种霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒。

背景技术

[0002] 霍乱是由霍乱弧菌（Vibrio cholera，VC）引起的烈性肠道传染病，该病起病急、传播快、涉及范围广，属国际检疫传染病，在我国被列为甲类传染病之一，是主要食源性致病微生物之一，时时威胁着人类并给人类带来危害。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，通过菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血液，在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌，此为本病典型的特征。

[0003] 目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5-7天，有时达到10-15天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果；以抗体为基础的免疫学检测已经成为食品中有毒有害物质及有害生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已经发展了多种特异性免疫学检测技术，如放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、荧光免疫分析（FIA）、时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）、化学发光免疫分析（CIA）、生物发光免疫分析（BIA）、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点一直是国境检验检疫安全侦检技术体系中的重要组成，已经成为有害生物及有毒有害物质检测不可或缺的重要技术手段。快速的ELISA方法检测，作为筛选方法具有快速、灵敏的特点，是受到广泛欢迎的筛选方法，但是所使用的试剂盒均来自国外，价格昂贵，而且需要配备其专门的仪器。因而，研究开发具有自主知识产权的食源性致病微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法、胶体金检测方法、基于免疫反应为基础的免疫纳米磁珠富集方法的基础。

[0004] 鞭毛是霍乱弧菌的一个重要毒力因子，具有特异性的鞭毛抗原（H抗原），常作为血清学鉴定的依据之一。细菌的鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物学和致病机制研究中具有重要的意义。例如，鞭毛蛋白被认为是一种保护性的抗原用于致病菌的疫苗研究，有研究结果表明，鞭毛蛋白可作为天然免疫应答的诱导剂，诱导产生的天然免疫应答可帮助建立针对外源抗原的获得性免疫应答，从而显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的特性。

[0005] 迄今用于霍乱特异性诊断的血清和预防用菌苗均为多克隆抗体和复杂的菌体抗原，难以对菌体抗原成分做进一步分析。霍乱弧菌血清群超过200个，但只有O1群及O139群引起霍乱大流行。O1群霍乱弧菌分为稻叶、小川和彦岛(少见)3种血清型。各型弧菌产生类似的肠毒素，临床表现也类似。每一次霍乱流行都会有一个特定的优势型，且流行趋势是在不断变化的。O139血清型霍乱是近10年来肆虐于南亚，并波及亚、欧、美、非、澳五大洲的数十个国家和地区的一种新发现的烈性传染病，目前已成为全球霍乱的优势菌群。目前已研制出专门针对O1群或O139群的抗体。但是，随着环境及其他条件的变化，其他血清型的霍乱弧菌仍然有引发流行病的可能。因此，制备适用于所有血清型的霍乱弧菌的抗体具有重要的意义。在已往的霍乱弧菌单克隆抗体的制备过程中，多使用灭活的VC菌体作为抗原，而菌体的大部分蛋白为菌属共有蛋白，不具有种间特异性，导致收获的单抗很难避免弧菌菌属内的种间交叉反应。本研究选用具有种间特异性的鞭毛蛋白作为抗原，并且在阳性克隆筛选过程中排除交叉反应，制备特异性良好的VC单克隆抗体，并将其应用于制备霍乱弧菌ELISA检测试剂盒。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体可以用于检测霍乱弧菌。

[0007] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案如下：

[0009] 本发明所提供的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.6754的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生。该小鼠杂交瘤细胞株已于2012年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.6754。

[0010] 保藏编号为CGMCC No.6754的小鼠杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。

[0011] 本发明还提供了一种霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被霍乱弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体的固相载体和酶标记的本发明所述的单克隆抗体。所述酶优选为辣根过氧化酶。进一步地，为了便于检测，本发明试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，以及ELISA反应所需的酶联免疫检测试剂。其中，所述阳性对照为霍乱弧菌鞭毛蛋白，所述阴性对照为未免疫霍乱弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀释液。所述酶联免疫检测试剂，均为常规的酶联免疫检测试剂，包括但不限于，酶的底物反应液、洗涤液和反应终止液。

[0012] 本发明具有以下优点和效果

[0013] 首先，本发明通过特异性实验，证明本发明的霍乱弧菌单克隆抗体显示出良好的特异性和稳定性。在特异性实验中检测了包括41株霍乱弧菌、1株O1群霍乱弧菌、1株O139群霍乱弧菌、50株副溶血性弧菌和28株非霍乱弧菌标准菌株，其中包括大部分常见的病原菌。从实验结果可知，本发明的霍乱弧菌单克隆抗体的特异性验证广度远大于其他霍乱弧菌单克隆抗体的验证，并且对不同血清型的霍乱弧菌检测均适用。其次，敏感性实验结果表3
明本发明试剂盒的检测敏感性为10/孔。目前在国内外已商业化生产的试剂盒，其灵敏度
4
基本在10/孔左右，因此，本发明的检测灵敏度高于其他试剂盒检测的平均水平，具有理想的应用前景。与微生物传统检测方法相比，本发明的ELISA检测方法与其检测灵敏度相当，但将检测周期从7~10天缩短至1~2天，并且具有快速、高效等优点。

附图说明

[0014] 图1.霍乱弧菌鞭毛蛋白的SDS-PAGE图；泳道1：霍乱弧菌鞭毛蛋白r；泳道2：蛋白Marker；

[0015] 图2.霍乱弧菌鞭毛蛋白电镜；

[0016] 图3.mAb的SDS-PAGE图；泳道1：蛋白Marker；泳道2：mAb。

具体实施方式

[0017] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

[0018] 实施例1霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备

[0019] 1.菌体培养及鞭毛蛋白的提取

[0020] 霍乱弧菌（Vibrio cholera）（VC-75，实验室分离保存）接种于T1N1培养基（购自北京陆桥技术有限责任公司，货号CM168），36℃活化24h；挑取单菌落接种于含2%NaCl的TSA培养基（购自北京陆桥技术有限责任公司，货号CM417）生长18~24h；用无菌棉签将生长良好的菌落均匀涂布在TSA（2%NaCl）培养基上，36℃培养18±2h。次日用无菌棉签刮下菌体悬浮于预冷的0.15M NaCl溶液中，冰浴15~30min，1000rpm匀浆45sec，立即置于冰上10min。匀浆液4℃条件下10000rpm离心10min；取上清液4℃条件下16000rpm离心2h，弃上清，沉淀重悬于TET（10mM Tris，2mM EDTA，pH 8.0，1%Triton X-100)缓冲液中。离心过程重复3次。操作过程保持低温下进行。最后留取沉淀，溶于少量Tris-EDTA（0.1M Tris，
0.1mM EDTA，pH 7.8）buffer中，4℃保存备用。

[0021] 2.SDS-PAGE及电镜鉴定

[0022] 提取的鞭毛蛋白进行SDS-PAGE电泳。5%积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部。凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察结果。见图1。

[0023] 霍乱弧菌鞭毛蛋白的电镜鉴定见图2。

[0024] 3.动物的免疫

[0025] （1）BALB/c小鼠的免疫

[0026] 以鞭毛蛋白为抗原，免疫6~8周龄的BALB/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照。初次免疫抗原加等量福氏完全佐剂充分乳化后，皮下注射免疫小鼠，40μg/小鼠。以后每隔两周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后免疫。第五次免疫3~5天后尾静脉采血，检测抗血清效价。

[0027] （2）新西兰纯种兔的免疫

[0028] 用霍乱弧菌鞭毛蛋白免疫雌性新西兰兔0.5mg/只。每隔两周免疫一次，共免疫5次。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37℃1小时，然后放冰箱4℃过夜，隔天取血清纯化得霍乱弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体，-20℃冻存备用。

[0029] 4.抗血清效价

[0030] 抗血清效价采用间接ELISA方法：用PBS稀释VC抗原浓度至1μg/mL，加入96孔板，100μL/孔，4℃过夜。用PBST洗板3次。2%的牛血清白蛋白溶于PBS溶液中，200μL/孔，37℃封闭1h。用PBST洗板。5只免疫鼠血清用PBS梯度稀释加入对应孔中，100μL/孔，空白对照为PBS溶液，阴性对照为未免疫小鼠血清37℃包被45min后洗板。HRP标记的羊抗鼠以1:2500倍数稀释加入，100μL/孔，37℃包被40min后洗板。每孔加新鲜配制的底物溶液100μL，37℃作用15min后每孔加入2M浓硫酸50μL，用酶联检测仪测定OD450nm值，读数并观察结果。选择效价高且满足P/N值＞2.0的小鼠，一周后加强免疫，3~5天内取小鼠脾细胞进行细胞融合。

[0031] 5.P2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养

[0032] 提前对冻存的骨髓瘤细胞（SP2/0）进行复苏，将-80℃冷冻冰箱中冻存的骨髓瘤细胞快速取出后，置于38℃水浴中轻微晃动使其迅速融化，注意冻存管口不能碰到水，以免污染，然后将细胞转移到含6~10ml RPMI-1640完全培养基（含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，小牛血清购自Hyclone，货号SH30541.03）的细胞培养瓶中，放入37℃，5%CO2培养箱中培养4~6个小时，待细胞全部贴壁生长时，及时换液，以后每隔2~3天传代一次，并调整细胞使其处于最适生长密度，当细胞达到一定活性，计数，准备进行融合。细胞融合前1~2天5
对细胞进行1比4传代，用新鲜培养基调整每瓶细胞浓度为1~2×10/ml，一般1~2天即可获得对数生长期的细胞。

[0033] 6.饲养细胞的制备

[0034] (1)将BALB/c小鼠拉颈处死，自来水冲洗后，完全浸泡于75%酒精中10min，移入超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。

[0035] (2)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的胸腺，用镊子，小剪刀小心将胸腺取出，放在一次性平皿中，细心剥去胸腺上附带的脂肪、结缔组织等，加入RPMI-1640培养基（购自Hyclone，货号SH30809.01）5ml，研磨胸腺，过筛，将胸腺细胞悬液加入离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，离心洗涤两次。

[0036] (3)用5ml HAT培养液轻轻将细胞重悬并混和均匀，计数，补加HAT培养液至细胞5
浓度为1~2×10/ml。

[0037] (4)将细胞悬液滴入96孔细胞培养板内，100μl/孔(两滴)，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。

[0038] 7.免疫脾细胞悬液的制备

[0039] (1)加强免疫3~5天后，选血清效价较高的BALB/c小鼠，摘除眼球，放血，收集并分离血清作为抗体检测的阴性对照。

[0040] (2)断颈处死，自来水冲洗后浸泡于75%酒精中10min，取出小鼠放在无菌超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。

[0041] (3)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，再用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心去除脂肪和结缔组织。

[0042] (4)用RPMI-1640洗液冲洗后，加入新的RPMI-1640洗液，用注射器针芯研磨，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，离心洗涤两次。

[0043] (5)用10ml HAT培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用。

[0044] 8SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备

[0045] (1)取4瓶100ml培养瓶培养好的骨髓瘤细胞（融合前一天换液，融合时细胞应处于对数生长期），收集于50ml离心管中。

[0046] (2)1000rpm离心5~10分钟，弃上清。

[0047] (3)沉淀中加入30ml RPMI-1640洗液，轻轻重悬，混匀，同法再离心洗涤一次。

[0048] (4)用10ml HAT培养液轻轻将脾细胞重悬并混和均匀，计数，备用。

[0049] 9细胞融合

[0050] (1)轻轻吹下培养好的骨髓瘤细胞，将其转移到50mL离心管中，1000r/min离心7min，弃上清，10mL培养基洗液悬浮，计数。

[0051] (2)将含1×108个脾细胞的悬液和含2×107个骨髓瘤细胞的悬液混合于一支50ml的离心管内，补加培养基洗液至30ml，充分混匀。

[0052] (3)1000rpm离心7分钟，弃去上清，清洗两次，尽量去上清。

[0053] (4)用手轻轻弹离心管底，使细胞团块松散均匀呈糊状。置37℃水浴，预热5~10min，以达到融合温度。

[0054] (5)从4℃冰箱中拿出已配好的50%PEG（MW4000）、RPMI-1640洗液，放在37℃水浴中，预温备用。

[0055] (6)将离心管放进含有37~40℃水的烧杯中，转动离心管，用1ml吸管吸取50%的PEG 1ml,沿管壁逐滴、缓慢加入离心管，时间控制在60秒内，然后再用30秒的时间吸取细胞悬液，静置30秒，再在30秒内将细胞缓缓吹入离心管内。

[0056] (7)加入预温好的RPMI-1640洗液，使PEG稀释而失去促融作用，具体方法：前两分钟内加2ml,第三分钟加入3ml，最后在3min内加入20ml。

[0057] (8)室温离心融合细胞，800rpm离心7min，弃上清。

[0058] (9)加入HAT培养液（50×，购自Sigma，货号H0262），轻轻吹吸、重悬沉淀细胞。

[0059] (10)将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，100μl/孔(两滴)，然后将培养板置37℃、5%CO2的培养箱中培养。

[0060] 10阳性克隆的筛选和克隆化培养

[0061] 融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理。融合后第6d、9d用HAT培养液半量换液，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT（50×，购自Sigma，货号H0137）培养液半量换液，以后根据细胞生长情况，1~2d换一次液，两周后改用完全培养液。待杂交瘤细胞长满孔底面积的1/10时（约10d左右），吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测。采用间接ELISA法。交叉反应：用副溶血性弧菌弧菌（VP）、创伤弧菌（VV）及溶藻弧菌（VA）的鞭毛蛋白为抗原，包被96孔板，测定VC抗血清与3种弧菌的交叉反应情况。用酶联检测仪测定OD450，满足P/N值＞2.0为阳性。将VC抗原包被板检测结果呈阳性，其他细菌抗原包被板检测结果呈阴性的杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞长满孔底面积的1/10时再用同样方法检测，强阳性孔再克隆。如此反复3~4次，直到阳性克隆率达到100%。

[0062] 11腹水制备与抗体鉴定

[0063] 对最后筛选出的阳性克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并且已于2012年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.6754。常规腹水体内诱生方法制备单抗腹水。mAb的特性鉴定：（1）Ig类和亚类的检测：用小鼠mAb亚类检测试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中Ig的类和亚类，操作步骤按说明书上进行。（2）Western blot检测：采用常用Western blot实验方法，测定腹水在1：2000稀释度下的特异性。（3）抗体纯化及效价测定：腹水用Protein G Sepharose亲和层析法纯化后得到抗体，纯化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价。抗体经SDS-PAGE分析纯度。

[0064] 纯化后抗体经SDS-PAGE电泳得到两条清晰的条带：重链分子量50KDa，轻链分子量25KDa，图3所示。抗体ELISA效价结果（见表1）可以看出，稀释度为1：2187000情况下仍有很强的阳性反应。

[0065] 表1.mAb的ELISA效价。

[0066]

[0067] 实施例2霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒

[0068] 1.霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒组成

[0069] 已包被霍乱弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体的固相载体即酶标板，辣根过氧化物酶标记的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对照、洗涤液和反应终止液。

[0070] （1）酶标板包被多抗

[0071] 用PBS缓冲液将霍乱弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体（如实施例1制备得到）稀释至浓度为10μg/mL，包被96孔EIA高效结合酶标板，100μL/孔，4℃过夜。取出后用PBST洗板3次，甩干。2%的BSA溶于PBS溶液中作为封闭液，100μL/孔加入酶标板，37℃封闭1h。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干，干燥后真空密封保存。

[0072] 其中，PBS缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 13.76g、NaH2PO4·2H2O 1.794g、NaCl 9g，加去离子水至1000ml；PBST洗涤液：含0.005%Tween 20的PBS水溶液，PH为7.4。

[0073] （2）抗霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的标记

[0074] 将抗霍乱弧菌鞭毛蛋白杂交瘤细胞株CGMCC No.6754分泌的单克隆抗体与辣根过氧化物酶（HRP）采用过碘酸盐氧化法进行偶联。

[0075] （3）底物

[0076] 采用3,3,5,5-四甲基联苯胺TMB（SIGMA）作为辣根过氧化物酶的底物。醋酸钠溶液（pH=4.3）4mL，加入30%的H2O25mL，TMB 1mL，即成10mL底物反应液（现用现配）。

[0077] （4）阳性和阴性对照

[0078] 阳性对照：按霍乱弧菌鞭毛蛋白，可以按照实施例1所述的方法提取，50μg/mL。

[0079] 阴性对照：未免疫霍乱弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清100倍稀释液。

[0080] （5）洗涤液

[0081] 为PBST洗涤液

[0082] （6）反应终止液

[0083] 用三蒸水配制的2M H2SO4溶液。

[0084] 实施例3霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒的使用方法

[0085] 1.待检样本的处理

[0086] 取待检样本增菌液1mL，10000rpm离心2min后弃上清，沉淀用PBS缓冲液洗涤两次后，加入少量200μLPBS重悬沉淀。沸水浴5min。

[0087] 2.加入对照和待检样本

[0088] 取待检样本100μL加入相应酶标孔，阳性对照和阴性对照100μL/孔，敲击已加样板的一侧，以确保样本均匀覆盖孔底，37℃孵育1h后PBST洗板3次，甩干。

[0089] 3.加入酶标单克隆抗体

[0090] 加入酶标单克隆抗体工作液（PBS缓冲液1:1000稀释酶标单抗）100μL/孔，37℃孵育1h后PBST洗板3次，甩干。

[0091] 4.加入底物显色

[0092] 加入新鲜配制的TMB底物100μL/孔，室温避光10~15min。

[0093] 5.加入反应终止液

[0094] 加入2M H2SO4溶液50μL/孔，终止反应。

[0095] 6.测OD450nm值

[0096] 酶标板置于酶标仪中测定OD450nm值。

[0097] 7.结果判定

[0098] 按上述方法，对20份阴性正常鼠血清纯化产物100倍稀释液进行了检测。按照公式临界值=阴性OD平均值+3×标准差，计算得阴性临界值为0.135。待检样本OD值大于0.135判为阳性，否则判为阴性。

[0099] 实施例4霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒的特异性和敏感性测定

[0100] （1）特异性测定

[0101] 为了验证本发明的霍乱弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒的特异性，按照实施例2及实施例3所述的试剂盒组成和方法对41株霍乱弧菌（实验室自分离）、1株O1群霍乱弧菌、1株O139群霍乱弧菌以及50株副溶血性弧菌（实验室自分离）和28株非副溶血性弧菌标准菌株进行了检测，见表2。结果表明，本发明试剂盒对41株霍乱弧菌OD450nm值在2.089~2.31之间，对O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌的OD450nm值依次为1.897和
1.92，说明本试剂盒对不同血清型的霍乱弧菌检测均适用。50株副溶血性弧菌OD450nm值在0.102~0.129之间，28株非副溶血性弧菌标准菌株OD450nm值在0.075~0.125之间，显示可良好的特异性。

[0102] 表2

[0103]菌株名称 OD450nm值
霍乱弧菌（实验室自分离，41株） 2.089~2.31
O1群霍乱弧菌（CDC） 1.897
O139群霍乱弧菌（CDC） 1.92
副溶血性弧菌ATCC 17802 0.125
副溶血性弧菌(实验室自分离，50株) 0.102~0.129
溶藻弧菌ATCC 1833 0.081
创伤弧菌ATCC 1758 0.093
格氏李斯特氏菌ATCC 700545 0.075
西尔李斯特氏菌ATCC 35967 0.071
英诺克李斯特氏菌ATCC 33090 0.084
默氏李斯特氏菌ATCC 2540 0.085
单增李斯特氏菌ATCC 15313 0.078
肺炎克雷伯氏菌CGMCC 1.1736 0.089
阴沟肠杆菌CGMCC 1.57 0.093
腊样芽孢杆菌ATCC 11778 0.077
金黄色葡萄球菌ATCC 25923 0.078
表皮葡萄球菌ATCC 12228 0.076
甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50001 0.103
大肠杆菌ATCC 25912 0.099
马红球菌ATCC 6936 0.112
肠炎沙门氏菌CMCC 50041 0.079
福氏志贺氏菌CMCC 51571 0.080
－大肠杆菌O157 0.078
鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115 0.085
阪崎肠杆菌ATCC 29544 0.078
枸橼酸杆菌CMCC 48017 0.094
丙型溶血性链球菌CMCC 32206 0.086
乙型溶血性链球菌CMCC 32210 0.095
铜绿假单胞菌ATCC 15442 0.087
小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC 52212 0.081
痢疾志贺氏菌CMCC 51252 0.098
粪肠球菌CGMCC 1.2135 0.092
阴性对照 0.084

[0104] （2）敏感性测定

[0105] 将霍乱弧菌VC-75菌株接种于APW培养基，36℃摇床培养1h后，生理盐水10倍梯8 2
度稀释，同时平板计数，得到菌体浓度为10~10CFU/mL的菌体溶液，然后按照实施例2及实施例3所述的试剂盒组成和方法进行检测，见表3。结果表明本发明试剂盒的检测敏感性为
3
10/孔。

[0106] 表3

[0107]

[0108] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。