短小芽孢杆菌及其在防控水产霍乱弧菌中的应用

摘要

本发明公开了一种短小芽孢杆菌AB3，该菌株保藏名称为Bacillus？pumilus？AB3，其保藏编号为CGMCC？NO:6408，其具有抑制霍乱弧菌生长或繁殖的能力。该菌作为霍乱弧菌拮抗菌可以制成抗菌制剂在水产养殖中进行应用，可作为替代化学消毒剂的有益微生物制剂，用于改善渔业水质，清除水产品养殖系统中的霍乱弧菌，从而预防霍乱弧菌对水产养殖对象的危害，促进水产养殖业的发展；避免水产品携带霍乱弧菌，保障人类健康安全。

权利要求

1.一种短小芽孢杆菌AB3，该菌株保藏名称为Bacillus pumilus AB3，其保藏编号为CGMCC NO:6408，其具有抑制霍乱弧菌生长或繁殖的能力。

2.一种霍乱弧菌抑菌制剂，其特征在于，所述制剂包括药学上有效量的权利要求1所述的短小芽孢杆菌AB3(Bacillus pumilus AB3)。

说明书

短小芽孢杆菌及其在防控水产霍乱弧菌中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株短小芽孢杆菌、其制剂及其在防控水产霍乱弧菌中的应用，属于渔业生态安全和水产品卫生安全领域，用于改善渔业水质，抑杀水产养殖系统中的霍乱弧菌。

背景技术

[0002] 霍乱弧菌(VC)是引起人烈性传染病霍乱的病原体，在我国被列为甲类传染病，国际上被列为检疫传染病。霍乱弧菌的自然栖息地是水体生态系统，它是在水环境中土生土长的，是水生动物、浮游生物的共栖体。它以水生动物的甲壳质为营养基质，具嗜温、嗜碱、嗜营养盐的特性，能产生毒素使人致霍乱病；能分泌甲壳质酶腐蚀某些水生动物（甲鱼、虾、蟹、贝及浮游甲壳类等）的甲壳，破坏其保护层，引发疾病；能转化硝酸盐为有毒的亚硝酸盐使水质败坏，危害养殖对象。

[0003] 人类霍乱是经口感染的肠道传染病，主要经水、食物等而传播，正常人食入霍乱弧8-9
菌量超过10 均可发病；霍乱自流行区向外扩散，主是通过水体与食品的污染以及病人与带菌者的扩散而实现，随着安全饮用水的普及，食物型（主要是水产品，尤其是甲鱼产品）传播日趋突出。

[0004] 目前，国内外对甲鱼等水产品携带霍乱弧菌的防疫尚处于对其苗种和产品检疫防疫阶段，但往往防不胜防。因为其养殖水体中滋生的病菌，不仅污染水产品，也对周围环境造成污染，扩大传播途径，增加霍乱流行风险。而且，一旦发现养殖水体或水产品霍乱弧菌检测阳性，政府需要立即采取紧急措施予以控制，一般采用化学药物对染疫水体及周边环境进行全面彻底消毒，扑杀、销毁染疫水体中所有水产品，同时需支付巨额疫病防控补偿。这样不仅造成极大的经济损失，也会对环境造成严重的药物污染或次生灾害。因此，能否在水产品上市之前，通过无公害的生物预防方法，在养殖生产环节使霍乱弧菌得到消除，切断其传播源，是杜绝水产品卫生安全隐患的关键所在和理想途径，也是国内外亟需攻克的重要课题。通过寻求拮抗菌以消除水产养殖系统中的霍乱弧菌，目前国内外尚未见有关研究报道。

发明内容

[0005] 本发明目的在于提供一种短小芽孢杆菌AB3（Bacillus pumilus AB3），该菌株可以以拮抗菌的作用有效的消除水产养殖系统中的霍乱弧菌，解决了现有技术中水产品携带霍乱弧菌的防疫问题。

[0006] 为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

[0007] 一种短小芽孢杆菌AB3（Bacillus pumilus AB3），其保藏编号为CGMCCNO:6408，其具有抑制霍乱弧菌生长或繁殖的能力。

[0008] 本发明的另一目的在于提供一种霍乱弧菌拮抗菌制剂，其特征在于所述制剂包括药学上有效量的所述的短小芽孢杆菌AB3（Bacillus pumilus AB3）。

[0009] 本发明的又一目的在于提供一种所述的微生态霍乱弧菌抑菌制剂在水产品养殖系统中霍乱弧菌抑制方面的应用。

[0010] 所述的霍乱弧菌选自人类霍乱以及甲鱼、虾类、蟹类和贝类的甲壳腐烂症的病原菌。

[0011] 使用的微生物：

[0012] 使用的短小芽孢杆菌菌株，自市场购买的渔用微生态制剂，经分离培养和抑菌筛选得到，菌株代号为AB3。此菌经鉴定，其属于短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的成员，命名为短小芽孢杆菌AB3（Bacillus pumilus AB3），简称BPAB3，现在已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO:6408，保藏日期为2012年8月10日，为霍乱弧菌拮抗菌菌株。短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）是一种饲用微生物菌种，适用于猪、禽类、反刍动物和鱼、虾等水产动物，可用于防治小麦根腐病、草莓灰霉病。

[0013] 短小芽孢杆菌AB3（Bacillus pumilus AB3）的生物学特性：

[0014] 短小芽孢杆菌AB3（Bacillus pumilus AB3），菌体呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，宽×长为（0.6~0.7）×（3-4）微米。能运动，革兰氏阳性，芽孢椭圆形，中生或次端生。该菌存在半透明型和不透明型两种不同的菌落形态，对两种菌落分别进行传代，半透明菌落能产生半透明和不透明型菌落，且基本各占一半。而不透明菌落在传代过程中只产生少许的半透明菌落，且传至第4代时半透明型菌落消失。该菌能水解淀粉，降解甘露聚糖、木聚糖、纤维素等。

[0015] 微生物的培养筛选方法:

[0016] 通过在琼脂培养基上打孔抑菌试验，从分离菌株中筛选出对霍乱弧菌抑制作用较强的拮抗菌。

[0017] 相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

[0018] 本发明的目的在于提供一种霍乱弧菌拮抗菌制剂及其在水产养殖中的应用技术。该霍乱弧菌拮抗菌制剂可作为替代化学消毒剂的有益微生物制剂，用于改善渔业水质，清除水产品养殖系统中的霍乱弧菌，从而预防霍乱弧菌对水产养殖对象的危害，促进水产养殖业的发展；避免水产品携带霍乱弧菌，保障人类健康安全。

具体实施方式

[0019] 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

[0020] 实施例1霍乱弧菌拮抗菌寻找、筛选、鉴定

[0021] （1）霍乱弧菌拮抗菌寻找、筛选

[0022] A）原料

[0023] 霍乱弧菌菌种：从温室甲鱼养殖水体分离获得，经鉴定确定为霍乱弧菌，其血清型为O139。

[0024] 渔用微生态制剂选用光合细菌类、芽孢杆菌类、乳酸菌类、硝化细菌类、酵母菌类、复合菌类六大类，共计28个品种，从渔药店市售采购。

[0025] 培养基试剂包括：胰酪胨大豆琼脂培养基、营养肉汤培养基，从试剂公司采购。

[0026] 胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA)的制备：称取42g，溶于1000ml蒸馏水的三角瓶中，搅拌溶解后，121℃高压蒸汽灭菌15min，然后在培养皿中倾注平板，4℃保存备用。

[0027] 营养肉汤培养基（NB）的制备：称取18g，溶于1000ml蒸馏水的三角瓶中，搅拌溶解后，用试管分装，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存备用。

[0028] B）霍乱弧菌液的制备：通过无菌操作，用接种环将霍乱弧菌接种到营养肉汤培养基试管中，放于36℃培养箱中培养18-20h，4℃保存备用。

[0029] C）霍乱弧菌拮抗菌分离筛选

[0030] 1）细菌分离

[0031] 通过无菌操作，用无菌生理水将28种渔用微生态制剂分别稀释成菌胞浓度为1000-3000cfu/ml,然后分别取各种稀释菌液0.1ml,各加入到一个胰酪胨大豆琼脂培养基培养皿中，并用无菌三角玻璃棒将各种菌液平铺于琼脂培养基表面，再将培养皿置于36℃培养箱中培养48h。根据培养皿中培养菌落的大小、形状、颜色、光泽等培养特征，将菌落区分为若干类。用接种环分别挑取每一类的单个菌落接种在营养肉汤培养基试管中，36℃下培养48h，制成若干种单个分离菌株的纯培养液，并通过比浊仪测试，用无菌生理盐水将各种细菌纯培养液的含菌量调整到基本相同。

[0032] 通过细菌分离培养，根据培养皿中胰酪胨大豆琼脂培养基上培养菌落的大小、形状、颜色、光泽等培养特征，从28种渔用微生物制剂中分离出36类菌株，并通过纯培养和浓度调试，获得36种含菌量相同的细菌纯培养液。

[0033] 2）拮抗菌的筛选

[0034] 通过无菌操作，在若干培养皿胰酪胨大豆琼脂培养基培养基表面均匀涂抹霍乱弧菌液，之后用打孔器在每个培养皿琼脂培养基上均匀打4个直径为9mm左右的园孔，然后分别吸取若干种分离菌的纯培养液各0.1ml，各入到一个琼脂培养基的孔中，其培养皿于36℃下培养24h，观察琼脂培养基打孔周围抑菌圈的大小，检验每一类菌落的纯培养物对霍乱弧菌的抑制效果。

[0035] 通过在胰酪胨大豆琼脂培养基培养皿上打孔抑菌试验，从36种分离细菌纯培养液中找到3对霍乱弧菌有抑制作用的拮抗菌株，取代号为：AB3、AB21、AB32，其中AB3纯培养液对霍乱弧菌的抑制效果最明显。拮抗菌AB3、AB21、AB32的培养特征及其对霍乱弧菌的抑制效果见表1。

[0036] 表1AB3、AB21、AB32培养特征及其对霍乱弧菌的抑制

[0037]

[0038]

[0039] （2）拮抗菌鉴定

[0040] 筛选出来的最佳霍乱弧菌拮抗菌株AB3，经过微生物自动分析系统鉴定，其属于短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）中的成员，根据鉴定结果并结合菌株号，将其命名为：短小芽孢杆菌AB3(Bacillus pumilus AB3)。

[0041] 实施例2拮抗菌制剂（发酵剂）的试制

[0042] 根据筛选获得的最佳霍乱弧菌拮抗菌短小芽孢杆菌AB3的生物学特性，筛选出合适的培养基，并采用适当的发酵条件，将该拮抗菌制成发酵菌液，在加入适量的稳定剂配成一定浓度的霍乱弧菌拮抗菌发酵剂。

[0043] 具体采用的发酵条件如下：

[0044] 发酵菌株：霍乱弧菌拮抗菌短小芽孢杆菌AB3。

[0045] 发酵培养基配方：蛋白胨10-80克，蔗糖20-100克，酵母粉1-10克，纯净水1000毫升。

[0046] 发酵温度：28-30℃。

[0047] 发酵周期：64小时。

[0048] 发酵摇床转速：150-200r/min。

[0049] 稳定剂：每升发酵液中吐温-205-10克，甘油10-20克。

[0050] 根据上述发酵条件，发酵研制成的霍乱弧菌拮抗菌发酵剂，其pH为4.0-4.5，菌胞8
含量为3×10cfu/ml。

[0051] 实施例3应用模拟试验

[0052] 根据已经对甲鱼温室养殖生产实际情况（包括相同的放养模式、饲养管理、水温、pH等）的调查结果，在实验室用5个水箱（规格：长×宽×高=0.5米×0.4米×0.3米）建立一组与实际甲鱼养殖条件相似的试验模型，每个水箱中加入40升自来水，经24h曝气后，其中5个水箱各放入甲鱼苗（平均60克/只）8只，每天投喂甲鱼饲料量为其体重的1%，分早晚两次投喂。另设一只水箱不投放甲鱼和饲料，只加入40升自来水，作为空白对照。整个建模期间，保持水体充氧，水温维持在27-28℃，pH控制在7.6-7.8。经过1个月的模拟饲养管理，放养水箱中水体达到了一定的肥度。

[0053] 在6个试验水箱或对照水箱中各加入适量霍乱弧菌液（3000cfu/ml水体），接着依箱号1-6分别加入不同剂量（1、2、4、8、0、0ppm）的拮抗菌制剂，具体方法是，先将制剂活化，即取既定剂量的拮抗菌制剂及与之重量相当的蔗糖，加入到相当10倍该制剂量（体积）的洁净水中，28℃左右温度下活化20-24小时，再将该不同剂量的制剂分别加入对应的水箱中。然后，每天采集各个水箱水样检验霍乱弧菌一次，并观察pH的变化。通过检测不同剂量拮抗菌制剂对霍乱弧菌的存活的影响，找出适合生产实际甲鱼养殖水体中拮抗菌可消除霍乱弧菌的合适用量。

[0054] 在试验水箱和对照水箱水体中分别接种适量霍乱弧菌和投放不同剂量的拮抗菌制剂后，每天采集水样检验霍乱弧菌一次，同时观测pH的变化。在实验室模拟甲鱼养殖水体中，拮抗菌制剂对霍乱弧菌的抑制试验结果见表2。试验结果显示，在制剂投放后，1-4号模拟试验水箱（制剂投放浓度分别为1、2、4、8ppm）中霍乱弧菌的检测数量，在第二天（D2）各浓度组均上升（大于初始接种量）；分别在第5、4、4、4天开始下降；分别在第7、6、5、5天为阴性。模拟对照水箱中霍乱弧菌的检测数量，从第二天开始上升，且一直大于初始接种量。空白对照对照水箱中霍乱弧菌的检测数量，从第三天开始下降，第五天以后均为阴性。1-4号试验水箱水体的pH从第三天开始有所下降，到第七天分别下降了0.4、0.5、06、和0.6，而模拟对照水箱和空白对照水箱的pH变化只有轻微的波动（±0.1）。

[0055] 表2模拟甲鱼养殖水体中拮抗菌制剂对霍乱弧菌（VC）抑制效果

[0056]

[0057] +++大于接种浓度；++等于或近似接种浓度；+小于接种浓度

[0058] 应用例拮抗菌发酵剂应用试验

[0059] 选择甲鱼养殖户凌某某和王某某的温室养殖池各三个作两组平行试验，各组含一个对照池。两组试验池的甲鱼放养情况见表3。

[0060] 拮抗菌制剂的使用方法包括全池泼洒和拌料投喂，以作对比，各组中的试验池1采用全池泼洒，各组中的试验池2采用拌料投喂，制剂用量（参考模拟试验结果）为用
2-4ppm。具体使用方法如下：

[0061] 1）全池泼洒：先将制剂活化，即取一定剂量拮抗菌制剂及等量的蔗糖加入到10倍制剂量的洁净水中，28℃左右温度下活化20-24小时，然后将其一次全池均匀泼洒。制剂用量：首次用量4ppm，以后每周使用一次，每次用量减半。

[0062] 表3两组试验甲鱼池的基本情况

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