好好芭ScMnSOD基因的CDS序列及应用转让专利
申请号 : CN201210375737.2
文献号 : CN102994523B
文献日 : 2014-06-18
发明人 : 张根发 , 刘肖飞
申请人 : 北京师范大学
摘要 :
本发明涉及好好芭（Simmondsia？Chinensis）ScMnSOD基因的CDS序列及应用，所述基因的CDS序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明利用转基因技术在野生型拟南芥中过表达ScMnSOD基因的CDS序列，结果表明，过表达ScMnSOD基因的CDS序列可提高拟南芥的抗旱性，这为充分利用好好芭SOD基因资源提供理论基础和技术支持，为抗旱作物育种提供新的基因资源。同时，也为进一步研究好好芭其他抗逆资源基因的功能及调控机制开辟了新思路。具有现实的理论意义和实际应用价值。
权利要求 :
1.好好芭（Simmondsia Chinensis）ScMnSOD基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.由权利要求1所述ScMnSOD基因的CDS序列编码的蛋白。
3.含有权利要求1所述ScMnSOD基因的CDS序列的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其出发载体为植物双元表达载体。
5.含有权利要求1所述ScMnSOD基因的CDS序列的工程菌。
6.权利要求1所述ScMnSOD基因的CDS序列在提高转基因植物抗旱性中的应用，其中，所述植物为拟南芥。
说明书 :
好好芭ScMnSOD基因的CDS序列及应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及好好芭ScMnSOD基因的CDS序列及应用。
背景技术
[0002] 在自然界中，导致作物低产的非生物胁迫因子有很多，例如，干旱、盐渍、低温等经常会影响植物的正常生长和发育过程，打破了植物正常的生理、生化代谢平衡，给植物造成严重伤害，甚至导致植株死亡。在这些非生物胁迫因子中危害最大的是干旱，由其导致的损失仅低于生物胁迫即病虫害。据文献报道，全球大约36%的土地处于干旱、半干旱地区，占耕地面积的43%。在我国，约占国土面积1/2的土地处于干旱和半干旱地区，特别是我国年降水季节分配不均且量少的北部和西部，遭受的干旱胁迫十分严重，这也是导致西部经济不发达的一个重要原因。
[0003] 干旱除了会对农作物造成低产，还会对生态环境造成危害。河流干涸、沙尘暴、草地退化、森林锐减、湖泊湿地减少以及生物量和生物多样性急剧下降等这一系列由干旱导致的生态环境危机己经对人类社会的可持续发展构成了严重威胁，并引起了社会的全面关注。另外，城市土地面积随着城市化步伐的加快而扩大，从而增强了对城市绿化植物的需求，同时，城市水资源的消耗也逐渐增大。目前我国水资源紧缺的地区有很多，性状优良但有着较大耗水量的植物在城市绿化中难以得到广泛推广。因此，水资源匮乏严重制约了我国城市绿化进程的发展。干旱严重影响着植物的正常生长发育和代谢，并阻碍着我国农业发展、生态环境建设及城市绿化建设的发展。因此，当前植物育种中的一个迫切需求和重要目标是提高植物的干旱耐受能力。
[0004] 引种、驯化、杂交、品种比较观察和选育等是常规植物抗旱工程研究的主要方法，然而这些方法耗时长，效果不明显。不同于常规育种，采用基因工程技术将抗旱基因重组到植物基因组中，植物的干旱耐受能力有可能在短期内得到提高，而且品种固有的优良性状仍会得到遗传，因此，这种方法在植物抗旱研究中得到了广泛应用，对我国开展抗旱植物育种工作具有十分重大的现实意义。
[0005] 好好芭（Simmondsia Chinensis）是原产于北美的一种多年生常绿灌木，主要分布在索罗兰沙漠，具有耐干旱，盐碱、高温等特点。好好芭能在荒山、丘陵、沙漠地区生长，起到防风固沙的作用，因此好好芭还具有重要的生态价值。好好芭油可以作为抹香鲸油的替代品，并且具有自身的特点：无鱼腥味，原油不含硬脂酸，用于工业时几乎不用处理，被称为“液体黄金”，可用于国防机械、民用机械、日化工业以及医药领域，具有重要的经济价值。目前关于好好芭的研究大多集中在好好芭油上，而对于好好芭的抗逆机理研究很少。
[0006] 由于好好芭是一种优良的资源植物，它有很强的环境胁迫适应能力，有极高的干旱耐受性和抵御沙漠高温、高热的能力，同时它还能耐受瘠薄土壤和抵抗盐碱，适合在荒山、丘陵、沙地等干旱半干旱地区种植，是保护生态环境的重要的种质基因资源植物。因此，研究好好芭抗逆资源基因的功能及调控机制，从而为抗旱作物育种提供新的基因资源，具有现实的理论意义和实际应用价值。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供好好芭ScMnSOD基因的CDS序列及应用。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的好好芭（Simmondsia Chinensis）ScMnSOD基因的CDS序列，其具有：i）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或ii）SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。例如，将SEQ ID No.1中的第6位A替换为C，或是将第694~696位TAA缺失，或是在第387位添加ACA均不会影响该基因的功能。
[0009] 经证实，本发明克隆得到的ScMnSOD基因的CDS序列，其表达产物定位于线粒体中。
[0010] 本发明还提供由上述ScMnSOD基因的CDS序列编码的蛋白。该蛋白具有超氧化物歧化酶(SOD)活性。
[0011] 本发明还提供含有上述ScMnSOD基因的CDS序列的载体。优选出发载体为植物双元表达载体。
[0012] 本发明还提供含有上述ScMnSOD基因的CDS序列的转基因细胞系。
[0013] 本发明还提供含有上述ScMnSOD基因的CDS序列的工程菌。
[0014] 本发明还提供上述ScMnSOD基因的CDS序列在提高转基因植物抗逆性中的应用。所述抗逆性是指抗旱性、抗寒性、抗盐性及抗氧化胁迫能力。优选抗逆性是指抗旱性。优选所述植物为拟南芥。
[0015] 本发明进一步提供上述ScMnSOD基因的CDS序列在抗旱作物育种中的应用。
[0016] 本发明首次从优良的资源植物--好好芭中克隆得到干旱高表达基因ScMnSOD，并对其表达产物的生化活性进行了分析。本发明利用转基因技术在野生型拟南芥中过表达ScMnSOD基因的CDS序列，结果表明，过表达ScMnSOD基因的CDS序列可提高拟南芥的抗旱，这为充分利用好好芭SOD基因资源提供理论基础和技术支持，为抗旱作物育种提供新的基因资源。同时，也为进一步研究好好芭其他抗逆资源基因的功能及调控机制开辟了新思路。具有现实的理论意义和实际应用价值。
附图说明
[0017] 图1为本发明实施例2中重组质粒pCAMBIA1302-ScMnSOD-GFP的BlnⅠ/NcoⅠ酶切产物鉴定结果；其中，1为酶切产物，M为DNAMarker DL2000。
[0018] 图2为本发明实施例2中ScMnSOD-GFP亚细胞定位分析结果；其中，A：转GFP拟南芥根DAPI染色；B：GFP在拟南芥中的表达；C：A、B叠加效果；D：转ScMnSOD-GFP拟南芥根毛Janu's green B染色；E：ScMnSOD-GFP在拟南芥根毛中的表达；F：D、E叠加效果。
[0019] 图3为本发明实施例3中pET28(a)-ScMnSOD重组质粒的EcoRⅠ/SalⅠ酶切产物鉴定结果；其中，1为酶切产物，M为DNA MarkerDL2000。
[0020] 图4为本发明实施例3中原核表达的ScMnSOD蛋白经SDS-PAGE检测结果；其中，1-5分别为未诱导、诱导1h、2h、3h和纯化的His6-ScMnSOD蛋白，M为蛋白分子量标准。
[0021] 图5为本发明实施例3中原核表达的ScMnSOD蛋白酶活测定结果；其中，A为ScMnSOD蛋白酶活抑制率曲线；B为ScMnSOD蛋白酶活趋势方程。
[0022] 图6为本发明实施例4中转ScMnSOD基因CDS序列的拟南芥植株在土壤干旱处理下的表型。
[0023] 图7为本发明实施例4中转ScMnSOD基因CDS序列的拟南芥干旱处理后植物存活率。
[0024] 图8为本发明实施例4中转ScMnSOD基因CDS序列的拟南芥干旱处理后叶片含水量情况；其中，A为野生型拟南芥和过表达ScMnSOD拟南芥叶片含水量测定，B为野生型拟南芥和过表达ScMnSOD拟南芥叶片失水速率测定，C为野生型拟南芥和过表达ScMnSOD拟南芥叶片ROS含量测定。
具体实施方式
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等。
[0026] 以下实施例中涉及的材料、菌株及载体：哥伦比亚野生型拟南芥，大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21及农杆菌GV3101购自Transgene，pMD18-T购自TaKaRa公司，pET-28(a)购自Novagen，pCAMBIA1302购自CAMBIA公司。
[0027] 以下实施例中涉及的试剂：限制性内切酶、限制性内切酶BlnⅠ、NcoⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ、HindⅢ、SpeⅠ和T4DNA Ligase购自TaKaRa公司；DNA Marker购自广州东盛生物公司；抗生素、IPTG购自Sigma公司，X-Gluc购自BBI，超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒-WST购自日本同仁化学研究所，Genome Walking Kit购自TaKaRa公司。
[0028] 实施例1好好芭ScMnSOD基因的CDS序列的克隆
[0029] 前期对好好芭（Simmondsia Chinensis）叶片进行脱水处理，然后提取RNA并反转录合成cDNA，采用抑制消减杂交（SSH）方法富集差异表达基因，构建消减文库，用放射性杂交方法筛选文库，测序后得到大量EST片段。从中选取ScMnSOD基因EST片段，根据片段序列设计上游引物P1：5’-CTCCCAAACATCTATACCAAGCAAACGG-3’，下游引物P2：3’-CGAACTGTTGTCATCTGCGTAGCGGGAA-5’。采用Plant RNeasy Kit（Qiagen）提取好好芭幼嫩叶片总RNA，然后采用Clontech的SMART RACE cDNA Amplification Kit按照试剂盒说明书分别进行3'RACE和5'RACE，对PCR产物分别测序。拼接3'RACE和5'RACE测序结果，获得全长好好芭ScMnSOD基因的CDS序列（SEQ ID NO.1）。
[0030] 实施例2好好芭ScMnSOD基因的CDS序列表达产物的亚细胞定位
[0031] 通过PCR法，分别在ScMnSOD的cDNA编码区的5′和3′端添加BlnⅠ和NcoⅠ酶切位点，然后与经相应酶切的pCAMBIA1302-GFP载体（CAMBIA公司）连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。酶切消化重组质粒pCAMBIA1302-ScMnSOD-GFP，电泳检测，结果显示，重组载体的插入片段大小约为700bp，和预期的ScMnSOD的cDNA编码区大小相符(图1)。测序进一步证实了载体构建的正确性。
[0032] 采用蘸花法转化野生型拟南芥，分别筛选、鉴定转35S::GFP，35S::ScMnSOD-GFP的阳性转基因植株。将消毒后的阳性植株种子种植于MS培养基上，取阳性植株幼苗的根来观察目的蛋白在细胞内的定位情况。将转35S::GFP的阳性苗幼根置于0.1%的TBST溶液中浸泡3次，每次5min，然后用200ng/μl DAPI染色5min，制成装片与荧光显微镜下观察。结果显示，GFP在细胞质、细胞核中均有表达。将转35S::ScMnSOD-GFP的阳性苗幼根置于
0.02%詹姆斯绿B染液中染色10min，然后制作装片置于显微镜下观察，结果显示ScMnSOD在线粒体中表达（图2）。
0.02%詹姆斯绿B染液中染色10min，然后制作装片置于显微镜下观察，结果显示ScMnSOD在线粒体中表达（图2）。
[0033] 实施例3ScMnSOD蛋白表达、纯化及酶活鉴定
[0034] 将带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的ScMnSOD基因的PCR扩增产物经EcoRⅠ和SalⅠ酶切后亚克隆至pET-28(a)载体上，使它们处于His6标签的C端，构建成pET28(a)-ScMnSOD重组载体，酶切鉴定（图3）。结果显示，表达质粒中包含的插入片段，与目的基因片段的cDNA编码区长度大小相符。序列测定进一步证实了构建载体的正确性。
[0035] 将pET28(a)-ScMnSOD质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），在含有卡那霉素（50μg/ml）的LB平板上筛选转化子。挑取单菌落，经液体培养和1mM IPTG诱导融合蛋白的表达，菌体和裂解液上清经15%SDS-PAGE，考马斯亮蓝G250染色，在约30kD处有一条明显的诱导条带，与预期的His6-ScMnSOD蛋白分子量完全符合。融合蛋白His6-ScMnSOD存在于细菌裂解液2+
上清中，为可溶性蛋白。离心收集IPTG诱导培养4h的转化子，按照Ni -NTA说明书，在非变性条件下纯化融合蛋白His6-ScMnSOD。经SDS-PAGE检测，表明融合蛋白成功从菌体总蛋白中分离，且条带位置正确（图4）。结果表明，His6-ScMnSOD可以在原核细胞中正确表达，并能在非变性条件下以可溶蛋白的形式纯化获得。
上清中，为可溶性蛋白。离心收集IPTG诱导培养4h的转化子，按照Ni -NTA说明书，在非变性条件下纯化融合蛋白His6-ScMnSOD。经SDS-PAGE检测，表明融合蛋白成功从菌体总蛋白中分离，且条带位置正确（图4）。结果表明，His6-ScMnSOD可以在原核细胞中正确表达，并能在非变性条件下以可溶蛋白的形式纯化获得。
[0036] 为准确测定每毫克SOD蛋白的酶活，采用Bradford法对纯化蛋白的浓度进行测定。然后采用日本同仁化学研究所研制的超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒-WST，对纯化蛋白的SOD酶活进行测定。按照试剂盒说明书计算出各样品蛋白的抑制率，绘制各纯化蛋白样品的抑制率曲线，并选择50%抑制率上下两点的数值做出趋势方程（图5A、图5B），计算纯化蛋白的酶活，公式如下：
[0037] 酶活=1/（IC50×20μl×蛋白浓度）
[0038] 最后得出纯化蛋白的酶活为1189.91U/mg，该结果显示ScMnSOD基因表达产物具有SOD酶活。
[0039] 实施例4转ScMnSOD基因CDS序列的拟南芥抗旱性分析
[0040] 1 土壤干旱处理下转基因拟南芥表性分析
[0041] 分别对野生型及转基因拟南芥种子进行消毒，均匀点种于MS固体培养基平板上，4℃春化3d。然后置于恒温22℃，光照16h/黑暗8h的培养箱中。一周后，将生长状况一致的幼苗移至盆中（营养土:蛭石=3:1），置于空气湿度为50%~60%，22℃恒温，光照16h/黑暗
8h条件的培养箱中，培养两周。然后对苗子进行干旱处理，直到大部分苗子出现脱水致死的现象发生，然后对苗子进行正常浇水，3d后照相记录表型，7d后统计存活的拟南芥植株，并比较分析各类拟南芥植株的表型差异。
8h条件的培养箱中，培养两周。然后对苗子进行干旱处理，直到大部分苗子出现脱水致死的现象发生，然后对苗子进行正常浇水，3d后照相记录表型，7d后统计存活的拟南芥植株，并比较分析各类拟南芥植株的表型差异。
[0042] 2 转基因拟南芥叶片含水量及ROS含量分析
[0043] 取生长4周的野生型及转基因拟南芥植株的大小相近的莲座叶片90片，分成三组，称鲜重，然后将叶片置于光下自然脱水6h，称重。然后置于烘箱中72h至恒重，称干重，计算叶片含水量并作显著性分析，并测定失水速率。
[0044] 将生长4周、长势相近的野生型及转基因拟南芥停止浇水1周，然后取相同位置的莲座叶片于液氮中研磨，称取粉末100mg，加1ml冰冷的生理盐水，1000g，4℃离心10min，取上清液，按照组织活性氧（ROS）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书测定拟南芥叶片中活性氧(ROS)相对含量，实验重复三次。
[0045] 对转基因拟南芥纯合体的干旱敏感表型进行分析，将在MS培养基平板上生长势均一的拟南芥植株移植营养土上，每小盆种植10棵幼苗，每种材料6盆，将不同材料的小盆放置到同一个托盘中，覆保鲜膜3d。揭膜后定量浇水，将待幼苗生长2周左右充分浇水，待土壤完全吸水后撤掉托盘中剩余的水分，植株停止浇水，开始干旱处理。所有材料随机摆放，每天移动位置，观察突变体与野生型在干旱处理过程中的生长情况。在停止浇水11d后，此时野生型和过表达植株生长状况相对良好，没有出现萎蔫现象。在停止浇水第14d后，野生型拟南芥已经部分开始萎蔫，此时转基因拟南芥少数开始萎蔫。在干旱19d后开始恢复浇水，野生型拟南芥绝大部分已萎蔫致死，部分转基因拟南芥还能生长。恢复浇水3d后照相，野生型拟南芥只有少数能恢复生长，而转基因拟南芥恢复生长的数目相对较多（图6）。因此认为过表达ScMnSOD拟南芥表现出干旱耐受，推测ScMnSOD与干旱胁迫相关。恢复浇水7d后统计植株存活率，统计结果也表明，过表达ScMnSOD基因植株表现出干旱耐受性状（图7），主要表现为在干旱处理过程中过表达植株存活数量明显大于野生型。这提示ScMnSOD基因在植物耐受干旱过程中起到了积极作用。
[0046] 植物耐受干旱能力差异主要反映在两方面，一方面是吸水能力的差异，主要是植物根系从土壤中摄取水分的能力，正常情况下植株体内的水分含量可以反映植物根系吸水能力的差异；另一方面是植物保水能力的差异，主要是在干旱胁迫下植物维持内部水分能力的差异，可以通过水分散失速率的差异来衡量。本发明分析野生型和转基因拟南芥植株在含水量及失水速率方面的差异，以期解释野生型和转基因拟南芥植株之间存在干旱耐受差异的主要原因。分析了生长4周的野生型和过表达ScMnSOD拟南芥莲座叶片含水量的差异。取植株的大小相近的莲座叶片90片，分成三组，称鲜重，然后将叶片置于光下自然脱水6h，称重。然后置于烘箱中72h至恒重，称干重，计算叶片含水量并作显著性分析。结果显示，野生型和转ScMnSOD基因拟南芥的吸水能力没有显著差异，而干燥6h后野生型叶片的含水量低于转ScMnSOD叶片的含水量（图8A），表明二者在正常情况下的吸水能力也没有差异，引起二者对干旱敏感的原因在于二者之间的保水能力存在差异。为验证这一推论，又进行了离体叶片失水速率的测定。材料为在土壤中生长4周左右的植株叶片，在取样前一天充分浇水，使野生型和转基因拟南芥材料都完全吸水，次日取相应材料的大小一致的离体莲座叶片各90片分成3组，平铺在不带盖子的培养皿中，放置在自然光下进行叶片失水实验，每30min称重一次，共6h，分析称重结果，计算水分散失速率和叶片相对鲜重。结果显示，野生型叶片水分散失速率大于转基因拟南芥叶片，自然干燥6h，野生型已丧失53%的水分，而转ScMnSOD基因拟南芥叶片丧失了约45%的水分(图8B)。该结果说明ScMnSOD基因的过表达可提高拟南芥的保水能力，提示MnSOD在植物耐旱过程中起到了重要的作用。
[0047] 干旱胁迫造成了植物代谢生理过程的紊乱，能引起植物细胞内ROS的大量积累。为研究在干旱胁迫过程中对野生型和转基因拟南芥叶片ROS含量的差异，检测了野生型和过表达ScMnSOD拟南芥叶片ROS量。将生长4周、长势相近的拟南芥干旱胁迫1周，然后取相同位置的莲座叶片于液氮中研磨，称取粉末100mg，加1ml冰冷的生理盐水，1000g，4℃离心10min，取上清液，按照试剂盒说明书测定拟南芥叶片中ROS相对含量，实验重复三次。结果显示，在干旱胁迫前野生型和转基因拟南芥叶片之间ROS含量差异不显著，但是野生型拟南芥叶片的ROS含量要高于转基因拟南芥叶片ROS含量。在干旱胁迫后，拟南芥叶片的ROS含量均提高，其中转基因拟南芥叶片中ROS含量明显低于野生型拟南芥叶片ROS含量（图8C）。以上结果表明，ScMnSOD在清除由干旱胁迫产生的ROS过程中发挥着重要的作用。
[0048] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。