一种HRAS基因突变检测特异性引物和液相芯片

摘要

本发明公开了一种HRAS基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对Codon 12位点的SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、和/或SEQ ID NO.21；针对Codon 13位点的SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、和/或SEQ ID NO.25；和/或针对Codon 61位点的SEQ IDNO.26及SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、和/或SEQ ID NO.30；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。

权利要求

1.一种HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有：

(A).针对HRAS基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对Codon12位点的SEQ ID NO.16以及SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21中的一种以上；以及选自针对Codon13位点和针对Codon61位点的特异性引物中的至少一种，所述针对Codon13位点的特异性引物是SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25中的一种以上；所述针对Codon61位点的特异性引物是SEQ ID NO.26以及SEQ ID NO.27、SEQ ID NO .28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30中的一种以上；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15；

(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.45，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物，所述扩增引物为：

针对Codon12和Codon13位点的SEQ ID NO.46及SEQ ID NO.47；或所述扩增引物为：SEQ ID NO.46及SEQ ID NO.47和针对Codon61位点的SEQ ID NO.48及SEQ ID NO.49。

2.根据权利要求1所述的HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为：

针对Codon12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.16组成的序列以及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.17组成的序列、由SEQIDNO.3和SEQIDNO.18组成的序列、由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.20组成的序列、和/或由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.21组成的序列；以及选自针对Codon13位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.22组成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.23组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.24组成的序列、和/或由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.25组成的序列；和针对Codon61位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.26组成的序列以及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.27组成的序列、由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.28组成的序列、由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.29组成的序列、和/或由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.30组成的序列中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，

(A)所述ASPE引物为：针对Codon12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.16组成的序列以及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.17组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.18组成的序列、由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.20组成的序列、和由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.21组成的序列；针对Codon13位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.22组成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.23组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.24组成的序列、和由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.25组成的序列；和针对Codon61位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.26组成的序列以及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.27组成的序列、由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.28组成的序列、由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.29组成的序列、和由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.30组成的序列；

(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.45，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

(C)所述扩增引物为：针对Codon12、Codon13位点的SEQ ID NO.46及SEQ ID NO.47；

和针对Codon61位点的SEQ ID NO.48及SEQ ID NO.49。

4.根据权利要求1-3任一项所述的HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5－10个T。

说明书

一种HRAS基因突变检测特异性引物和液相芯片

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种HRAS基因突变检测特异性引物和液相芯片。

背景技术

[0002] ras基因参与细胞生长和分化的调控，参与多种肿瘤的形成与发展。ras基因家族与人类肿瘤相关的特征性基因有三种，即H-ras、K-ras和N-ras，它们分别定位于11、12、1号染色体。ras族癌基因活化是某些肿瘤发生发展的分子基础，其中，点突变是ras族基因活化的重要方式，而ras族基因第12位、13位和61位密码子的点突变可使其获得转化细胞的能力。因此对肿瘤细胞ras基因点突变的检测，对了解肿瘤的发生发展，以及监测恶性肿瘤的治疗效果具有重大意义，对临床工作具有重要指导意义。

[0003] 其中，HRAS(v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog)基因定位于11号染色体，由946个腺嘌呤、2287个胞嘧啶、2113个鸟嘌呤、1107个胸腺嘧啶组成。HRAS基因突变及其突变率与地理环境条件、种族、致癌原的不同有关，有研究表明，HRAS点突变与胃癌的某些分子生物学行为相关，而且有可能成为判断胃癌患者预后的有用指标。
本发明所开发的HRAS基因突变检测液相芯片涉及的突变位点如下表所示：

[0004]

[0005]

[0006] 目前，对HRAS基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。

发明内容

[0007] 本发明的目的之一是提供HRAS基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单项或者并行检测HRAS基因Codon 12的正常基因型及五种突变型：G12S、G12C、G12R、G12D、G12V，Codon 13的正常基因型及三种突变型：G13S、G13R、G13C，以及Codon 61的正常基因型及四种突变型：Q61K、Q61R、Q61L、Q61H。

[0008] 实现上述目的的技术方案如下：

[0009] 一种HRAS基因突变检测液相芯片，包括有：

[0010] (A).针对HRAS基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对Codon 12位点的SEQ ID NO.16以及SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21中的一种以上；针对Codon 13位点的SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25中的一种以上；和/或针对Codon 61位点的SEQ ID NO.26以及SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30中的一种以上；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15；

[0011] (B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.45，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

[0012] (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。

[0013] 优选地，所述扩增引物为针对HRAS基因Codon 12和/或Codon 13位点的SEQ ID NO.46及SEQ ID NO.47；和/或针对Codon 61位点的SEQ ID NO.48及SEQ ID NO.49。

[0014] 优选地，所述ASPE引物为：针对Codon 12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.16组成的序列以及由SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.17组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.18组成的序列、由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.20组成的序列、和/或由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.21组成的序列；针对Codon 13位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.22组成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.23组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.24组成的序列、和/或由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.25组成的序列；和/或针对Codon 61位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.26组成的序列以及由SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.27组成的序列、由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.28组成的序列、由SEQ ID NO.14和SEQ IDNO.29组成的序列、和/或由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.30组成的序列。

[0015] 本发明的另一目的是提供用于HRAS基因突变检测的特异性引物。

[0016] 实现上述目的的技术方案如下：

[0017] 用于HRAS基因突变检测的特异性引物，其为：所述特异性引物序列为：针对Codon12位点的SEQ ID NO.16以及SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21中的一种以上；针对Codon 13位点的SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25中的一种以上；和/或针对Codon 61位点的SEQ ID NO.26以及SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30中的一种以上。

[0018] 本发明的主要优点在于：

[0019] 1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的HRAS基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

[0020] 2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。

[0021] 3.本发明的检测方法步骤简单，12种突变位点检测可通过一步PCR即可完成2条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。

[0022] 4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

具体实施方式

[0023] 实施例1

[0024] 本实施例所述的HRAS基因突变检测液相芯片，主要包括有：

[0025] 一、ASPE引物

[0026] 针对HRAS基因Codon 12的正常基因型及五种突变型：G12S、G12C、G12R、G12D、G12V，Codon 13的正常基因型及三种突变型：G13S、G13R、G13C，以及Codon 61的正常基因型及四种突变型：Q61K、Q61R、Q61L、Q61H，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：

[0027] 表1 HRAS基因的ASPE引物序列(tag序列+特异性引物序列)

[0028]

[0029]

[0030] 每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

[0031] 二、anti-tag序列包被的微球

[0032] 根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的15种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：

[0033] 表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列

[0034]

[0035]

[0036] 选择的15种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：

[0037] 分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/m1)。配制 10ng/ml 的 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)( 购 自 Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。

[0038] 三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物

[0039] 针对HRAS基因的Codon12、Codon13和Codon61，设计扩增引物对(见表3)，扩增出2条含有12种突变位点的目标序列，其中Codon12和Codon13位于同一条扩增产物内。

[0040] 表3 扩增出具有突变位点的目标序列的引物

[0041]

[0042] 所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

[0043] 实施例2 运用实施例1所述的HRAS基因突变检测液相芯片对样本的检测[0044] 所述各种溶液的配方如下：

[0045] 50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

[0046]

[0047] 2×Tm杂交缓冲液

[0048]试剂 来源 终浓度 每250ml的用量
1MTris-HCl，pH8.0 SigmaT3038 0.2M 50ml
5M NaCl Sigma S5150 0.4M 20ml
Triton X-100 Sigma T8787 0.16％ 0.4ml

[0049] 过滤后贮存于4℃。

[0050] ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。

[0051] 生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

[0052] 一、样本的DNA提取：

[0053] 参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。

[0054] 二、待测样品的PCR扩增

[0055] 设计2对引物，多重PCR一步扩增出分别含有HRAS基因Codon12、Codon13和Codon61的12常见基因型的2条目标序列，其中，Codon12和Codon13位于同一条扩增产物内，产物大小分别为320bp和282bp，引物序列(SEQ ID NO.46-49)见上述表3所示。

[0056] 首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.46-49的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：

[0057]

[0058] PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。

[0059] 三、PCR产物的酶切处理

[0060] 1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；

[0061] 2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。

[0062] 四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

[0063] 利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

[0064] 首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：

[0065]

[0066]

[0067] 反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。

[0068] 五、杂交反应

[0069] 1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的15种包被的微球(如实施例1所述)，5
每种微球的浓度均为2.5×10 个/ml；

[0070] 2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

[0071] 3.微球于≥10000g离心1-2min；

[0072] 4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；

[0073] 5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；

[0074] 6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；

[0075] 7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；

[0076] 8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；

[0077] 9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；

[0078] 10.微球于≥3000g离心2-5min；

[0079] 11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；

[0080] 12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。

[0081] 六、结果检测与数据分析

[0082] 反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以突变型荧光值(MFI)大于100为cut-off值，当突变型检测的MFI值大于100时，判定该样本存在该突变类型，否则判定该样本为相应的野生型。

[0083] 使用本方法检测大量样本的HRAS基因突变，以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的HRAS基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的HRAS基因突变检测液相芯片能够准确地检测出HRAS基因的突变类型，且结果稳定可靠。

[0084] 表4 样本检测结果(MFI)之一

[0085]

[0086] 表5 样本检测结果(MFI)之二

[0087]

[0088] 表6 样本HRAS基因突变类型分析结果

[0089]样本号 液相芯片检测结果 测序结果
1 野生型 野生型
2 野生型 野生型

[0090]3 野生型 野生型
4 野生型 野生型
5 野生型 野生型
6 G13R突变 G13R突变
7 野生型 野生型
8 野生型 野生型
9 野生型 野生型
10 野生型 野生型
11 野生型 野生型
12 G12C突变 G12C突变
13 野生型 野生型
14 野生型 野生型
15 G12D突变 G12D突变
16 Q61K突变 Q61K突变
17 野生型 野生型
18 野生型 野生型
19 野生型 野生型
20 野生型 野生型

[0091] 实施例3 不同的ASPE引物的液相芯片对HRAS基因突变位点的检测[0092] 一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)

[0093] 以HRAS基因G12S和G13S位点突变检测液相芯片为例，分别针对G12S和G13S的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.15，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.45。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

[0094] 表7 液相芯片制备的设计

[0095]

[0096]

[0097] 二、样品检测

[0098] 采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：

[0099] 表8 样本检测结果与基因突变分析

[0100]

[0101]

[0102] 表9 样本检测结果与基因突变分析

[0103]

[0104]

[0105] 由本实施例可见，ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组1和试验组4。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。

[0106] 其它针对不同突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，具体数据省略。

[0107] 实施例4 HRAS基因突变检测特异性引物序列的选择

[0108] 一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)[0109] 以HRAS基因G12R和Q61K的突变位点检测液相芯片为例，以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对G12R和Q61K的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备选的特异性引物序列，如表10所示。其中， 内碱基为突变位点。

[0110] 表10 特异性引物序列

[0111]

[0112]

[0113] 以HRAS基因G12R和Q61K的突变位点检测液相芯片为例，针对G12R和Q61K选用不同的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则固定为实施例1中的最佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表(表11)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

[0114] 表11 液相芯片制备的设计之二

[0115]

[0116] 二、样品检测

[0117] 采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：

[0118] 表12 样本检测结果与基因突变分析

[0119]

[0120]

[0121] 表13 样本检测结果与基因突变分析

[0122]

[0123]

[0124] 由本实施例可见，ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组7和试验组10。其它来源于目标检测位点所在序列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，即依然是实施例1中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳，具体数据省略。

[0125] 其它针对同一突变位点的多种特异性引物序列或不同的突变位点的多种特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，即实施例1所选择的特异性引物，具有更好的信噪比，检测效果也更好，具体数据省略。

[0126] 以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。