一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用

摘要

本发明公开了一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用。该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）定量检测方法包括：（1）提取待检样品的总RNA；（2）将提取的总RNA反转录成cDNA；（3）采用特异性扩增植物乳杆菌的引物对，以所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，其中上游引物序列如SEQ ID No:1所示；下游引物序列如SEQ ID No:2所示；（4）通过比较待检样品的Ct值和定量外标准品的标准曲线测定其中植物乳杆菌数量。本方法能够有效排除其他细菌，尤其是近缘菌的干扰，只检测样品中存活的植物乳杆菌数量。本发明所述植物乳杆菌定量检测试剂盒使用简便，检测效率高。

权利要求

1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）定量检测方法，其特征在于，所述植物乳杆菌定量检测方法包括以下步骤：（1）提取待检样品的总RNA；

（2）将步骤（1）提取的总RNA反转录成cDNA；

（3）采用特异性扩增植物乳杆菌的引物对，以步骤（2）所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测，其中所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对为：上游检测引物，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示；下游检测引物，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示；

（4）通过比较待检样品的Ct值和定量外标准品的标准曲线测定样品中植物乳杆菌的数量，其中所述植物乳杆菌选自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ST-III、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）P8和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CCTCC No.M206033中的一种或几种。

2.如权利要求1所述植物乳杆菌定量检测方法，其特征在于，步骤（3）所述荧光定量PCR扩增程序为：（1）94℃～95℃，25～30秒；（2）94℃～95℃，5～15秒，（3）60℃，20～

30秒，其中步骤（2）～（3）重复30～45个循环。

3.如权利要求1所述植物乳杆菌定量检测方法，其特征在于，步骤（4）所述的定量外标准品是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC14917的总RNA反转录后所得的总cDNA，其中所述标准曲线是将外标准品采用10倍梯度稀释，以稀释后的外标准品作为底物进行荧光定量PCR反应得到Ct值，根据稀释后标准品的拷贝数和其相对应的Ct值绘制而得。

4.一种特异性扩增植物乳杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对中的上游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:1所示；其中下游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:2所示。

5.一种植物乳杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，所述定量检测试剂盒包括：SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、无菌双蒸水、上游检测引物和下游检测引物，其中所述上游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:1所示，所述下游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:2所示。

6.如权利要求5所述植物乳杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，所述植物乳杆菌定量检测试剂盒包括定量外标准品。

7.如权利要求6所述植物乳杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，所述定量外标准品是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC14917的总RNA反转录后所得的cDNA。

8.如权利要求7所述植物乳杆菌定量检测试剂盒，其特征在于，所述植物乳杆菌定量检测试剂盒还包括RNA提取试剂和反转录试剂。

9.如权利要求5～8任一项所述的植物乳杆菌定量检测试剂盒在检测植物乳杆菌数量中的应用。

说明书

一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，特别是涉及一种植物乳杆菌定量检测方法，所述植物乳杆菌定量检测方法是定量荧光PCR方法，一种植物乳杆菌定量检测试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸杆菌中的一种，与人类的生活关系密切，常存在于发酵的蔬菜和果汁中。植物乳杆菌作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能，因而被广泛的作为益生菌添加到功能性食品与保健品中。大量研究表明，只有产品中益生菌的活菌数达到6
1×10 个/ML才能够发挥其应有的功效，因而益生菌活菌数量是评价益生菌制品质量的重要指标。然而目前对多菌复合产品中的植物乳杆菌的定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法。传统生理生化方法易受选择培养基、培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，且耗时时间长，一般要2-3天；以16S rDNA序列同源性分析作为细菌系统发育和亲缘关系研究已被普遍应用于乳酸菌的分类鉴定中，但由于植物乳杆菌与戊糖乳杆菌、副植物乳杆菌等具有99%的相似性，利用该方法只能鉴定到属而无法准确到种。

[0003] 伴随着高通量测序技术的快速发展，大量乳酸菌菌株的基因组图谱已被解析。这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为不同种乳酸菌的区分和鉴定奠定了基础。

发明内容

[0004] 因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的菌数检测方法易受培养基、培养条件、菌种特性等因素影响，并且检测耗时时间长，检测效率较低的缺陷，提供一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用。本发明所述植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，操作简单、迅捷，能极大提高乳制品中乳杆菌数量的检出效率。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）定量检测方法，其中所述方法包括以下步骤：

[0006] （1）提取待检样品的总RNA；

[0007] （2）将步骤（1）提取的总RNA反转录成cDNA；

[0008] （3）采用特异性扩增植物乳杆菌的引物对，以步骤（2）所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测，其中所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对为：上游检测引物，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示；下游检测引物，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示；

[0009] （4）通过比较待检样品的Ct值和定量外标准品的标准曲线测定样品中植物乳杆菌的数量。

[0010] 本发明所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）也可简写为植物乳杆菌（L.plantarum），其余乳杆菌命名规则与之相同。

[0011] 其中步骤（1）所述提取待测样品总RNA的方法为本领域常规的总RNA提取方法。所述总RNA的提取较佳地为通过本领域各种商用的RNA提取试剂盒进行。

[0012] 其中步骤（2）所述RNA反转录成cDNA的方法为本领域常规的反转录方法。所述反转录较佳地为利用各种商用反转录试剂盒进行。

[0013] 其中步骤（3）所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对包括上游测序引物和下游测序引物，其中：

[0014] 上游测序引物：5’-GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示；

[0015] 下游检测引物：5’-AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3’，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示。所述引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为通过人工合成途径即得，可以委托服务商进行全序列合成即得。

[0016] 其中步骤（3）所述荧光定量PCR扩增为本领域常规的荧光定量PCR扩增技术。所述荧光定量PCR程序较佳地为：（1）94℃～95℃，25～30秒；（2）94℃～95℃，5～15秒，（3）60℃，20～30秒，其中步骤（2）～（3）重复30～45个循环，更佳地为：（1）95℃30S；（2）95℃5S，（3）60℃25S，步骤（2）～（3）重复40个循环；4℃保存。

[0017] 其中步骤（3）所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为本领域常规的植物乳杆菌。本发明所述植物乳杆菌较佳地选自植物乳杆菌（L.plantarum）ST-III、植物乳杆菌（L.plantarum）WCFS1、植物乳杆菌（L.plantarum）P8和植物乳杆菌（L.plantarum）CCTCC No.M206033中的一种或几种。

[0018] 其中步骤（4）所述的定量外标准品较佳地为植物乳杆菌（L.plantarum）ATCC14917的总RNA反转录后所得的总cDNA，其中所述标准曲线较佳地是将外标准品采用10倍梯度水稀释，以稀释后的外标准品作为底物进行定量PCR反应得到Ct值，根据稀释后标准品的拷贝数和其相对应的Ct值绘制而得。

[0019] 荧光染料产生的荧光信号可以被荧光定量PCR仪内的荧光信号采集系统检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量成正比例关系。对植物乳杆菌的定量可以通过与定量标准品的循环阈值（Ct,Threshold Cycle）相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数。Ct值与起始模板数成一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多；相反，Ct值越大，起始模板数越少。因此，利用梯度稀释标准品的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可以准确测出该样品的起始拷贝数。

[0020] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种特异性扩增植物乳杆菌的引物对，所述引物对中的上游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:1所示；其中下游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:2所示。

[0021] 其中所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对的序列分别为：

[0022] 上游测序引物：5’-GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示；

[0023] 下游检测引物：5’-AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3’，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示。所述引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为通过人工合成途径即得，可以委托服务商进行全序列合成即得。

[0024] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：一种植物乳杆菌定量检测试剂盒，所述定量检测试剂盒包括：SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、无菌双蒸水，上游检测引物和下游检测引物，其中所述上游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:1所示，所述下游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:2所示。

[0025] 其中所述SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、无菌双蒸水均为本领域常规实验试剂，均市售可得。

[0026] 其中所述植物乳杆菌定量检测试剂盒，较佳地还包括定量外标准品。所述定量外标准品是本领域常规的外标准品，较佳地是植物乳杆菌ATCC14917的总RNA反转录后所得总cDNA。

[0027] 其中所述植物乳杆菌定量检测试剂盒，较佳地还包括RNA提取试剂和/或反转录试剂。所述RNA提取试剂较佳地为：Trizol、RNA酶抑制剂。其中所述反转录试剂较佳地为：逆转录酶（AMV）、AMV缓冲液。其中所述AMV缓冲液较佳地包括：dNTPs、随机引物、RNA酶抑制剂和无菌双蒸水。其中所述RNA提取试剂和/或反转录试剂均市售可得。

[0028] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：所述植物乳杆菌定量检测试剂盒在检测样品中植物乳杆菌数量中的应用。

[0029] 本发明所述应用较佳地为：利用所述植物乳杆菌定量检测试剂盒提取植物乳杆菌（L.plantarum）ATCC14917的总RNA，紫外分光光度计测定吸光度值（260nm）后，反转录得到cDNA，根据基因组大小计算出拷贝数，进行稀释，所述稀释的倍数较佳地为10倍梯度稀释，以稀释后所得cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR反应。以不同拷贝数的阳性模板数量的对数为横坐标，以实时荧光定量PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct值)为纵坐标得到植物乳杆菌（L.plantarum）ATCC14917RT-PCR标准曲线，并得到回归方程。以待测样品中乳酸杆菌的总cDNA为模板，利用所述试剂盒中的上游检测引物和下游检测引物，以相同的体系进行植物乳杆菌特征片段的荧光定量PCR扩增，测得Ct值，将待测样品的Ct值带入前述标准曲线，即得出样品中植物乳杆菌的数量。

[0030] 本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

[0031] 相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

[0032] 1、检测速度快、特异性强

[0033] 对于微生物的普通生化鉴定一般需要2～3天，而本发明所述植物乳杆菌定量检测方法鉴定只需要2～3小时；并且能够区分普通生化鉴定方法无法区分的近缘乳酸杆菌。本发明所述PCR引物对根据编码植物乳杆菌菌株的CAAX家族蛋白酶基因的特异性标志片段设计，该引物对可以在植物乳杆菌中扩增出相应的DNA片段，并且只特异性扩增植物乳杆菌基因，而不会在其他菌中扩增出相应片段，包括植物乳杆菌近缘菌戊糖乳杆菌、副植物乳杆菌等。因此，以该基因片段为基础设计的PCR反应系统具有良好的微生物种属特异性。

[0034] 2、检测灵敏度高、成本低

[0035] 本发明所述植物乳杆菌定量检测方法灵敏度高，能将皮克级的起始待测模板扩增到微克水平：即使待测样品中只含有3个目标细菌也可以检出。普通生化鉴定方法所用检测试剂种类繁多，步骤复杂，而本发明所述植物乳杆菌定量检测方法使用的鉴定试剂种类少，操作简单，成本较低。此外，与通过全基因组测序的鉴定方法相比较，所述植物乳杆菌定量检测方法费用较低、实验周期也大为缩短，方便投入实际应用。

[0036] 综上所述，本发明的优势在于，所述植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒采用的检测引物只对植物乳杆菌的特征片段进行扩增，从而有效排除了其他细菌特别是近缘菌对检测的干扰；同时以RNA为基础的荧光定量PCR方法可以有效排除样品中已死亡的植物乳杆菌污染，只检测样品中存活的植物乳杆菌数量。

附图说明

[0037] 图1为植物乳杆菌的引物特异性验证结果图。其中1.植物乳杆菌（L.plantarum）ATCC14917作为阳性对照；2.H2O作阴性对照；3.植物乳杆菌（L.plantarum）ST-III；4.植物乳杆菌（L.plantarum）WCFS1；5.植物乳杆菌（L.plantarum）P8；6.植物乳杆菌（L.plantarum）CCTCC No.M206033；7.戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)ATCC8041；
8.副植物乳杆菌(L.paraplantarum)ATCC700211；9.干酪乳杆菌(L.casei)ATCC334；
10.嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)ATCC4356；11.发酵乳杆菌(L.fermentum)1.1880；M为
500bp Marker。

[0038] 图2为植物乳杆菌（L.plantarum）ATCC14917RT-PCR标准曲线。

[0039] 图3为实时荧光定量PCR方法与平板记数法测量植物乳杆菌（L.plantarum）ATCC14917数量的相关性示意图。

具体实施方式

[0040] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC14917购自美国ATCC；

[0041] 戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)ATCC8041，购自美国ATCC；

[0042] 副植物乳杆菌(L.paraplantarum)ATCC700211，购自美国ATCC；

[0043] 干酪乳杆菌(L.casei)ATCC334，购自美国ATCC；

[0044] 嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)ATCC4356，购自美国ATCC；

[0045] 发酵乳杆菌(L.fermentum)CGMCC1.1880，购自中国普通微生物保藏管理中心；

[0046] 植物乳杆菌(L.plantarum)ST-III，光明乳业，专利公开号：CN1467290；

[0047] 植 物 乳 杆 菌(L.plantarum)WCFS1，荷 兰 瓦 赫 宁 恩NIZO食 品 研 究 所（请 参 见：Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1.Kleerebezem M,Boekhorst J,van Kranenburg R,et.al Proc Natl Acad Sci U S A.2003,18:1990-1995）；

[0048] 植 物 乳 杆 菌(L.plantarum)P8，内 蒙 古 农 业 大 学，专 利 申 请 号：CN201210062159.7；

[0049] 植物乳杆菌(L.plantarum)CCTCC No.M206033，江南大学，专利公开号：CN1928071。

[0050] 实施例1特异性引物的设计

[0051] 本发明所得植物乳杆菌特异性检测引物如下所示：

[0052] 上游检测引物：5’-GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’；

[0053] 下游检测引物：5’-AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3’；

[0054] 其中上游检测引物序列如序列表中SEQ ID No:1所示，下游检测引物序列如序列表中SEQ ID No:2所示，所述引物由上海生工生物工程有限公司合成。

[0055] 使用不同菌株的cDNA作为模板，利用上述引物进行PCR扩增，选用30株植物乳杆菌株和50株非植物乳杆菌株（主要为其近缘菌）进行引物特异性验证，部分实验结果如图1所示。

[0056] 实验结果表明本发明所提供的引物仅能扩增出植物乳杆菌，而对其他近缘菌株特别是戊糖乳杆菌和副植物乳杆菌等均无相应扩增。

[0057] 实施例2自制乳制品中植物乳杆菌的快速定量检测

[0058] a.自制乳酸菌酸奶产品

[0059] 将植物乳杆菌ATCC14917菌株在试管中活化，2%接种量接种于100mL质量分数为12%脂牛乳（添加1%的蛋白胨）进行培养。37℃培养6～8小时至凝乳，结束发酵，置冰箱备用。

[0060] b.植物乳杆菌乳制品的总RNA制备

[0061] 采用Trizol法提取：分别取上述酸奶七个不同时期（距离发酵结束日期分别为1、3、5、7、9、11、13天）的样品，置于盛有液氮的研钵中研磨，然后迅速加入1mL Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书（ Plus RNA Purification System，美国invitrogen公司，货号12183-555）提取样品RNA，然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样本，检测浓度后，上述RNA样本完整性通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

[0062] c.反转录扩增

[0063] 依据反转录试剂盒（M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit,大连宝生物工程有限公司，货号D6130）说明书进行将上述RNA样本反转录扩增，获得cDNA模板。

[0064] d.荧光定量PCR方法

[0065] 取实施例1制备所得植物乳杆菌种属特异性检测引物，其序列如下所述：

[0066] 上游引物5’-GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’（如序列表中SEQ ID No:1所示）；

[0067] 下游引物5’-AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3’（如序列表中SEQ ID No:2所示），所述引物扩增片段长度为107bp。

[0068] 荧光定量PCR按照 PrimeScriptTMRT-PCR Kit（大连宝生物工程有限公司，货号DRR063A）说明书进行。反应体系为25.0μL，各反应物终浓度为：1× Premix TMEx Taq ，0.2μmol/L上下游引物（SEQ ID No:1、SEQ ID No:2），1.0ng/μL的cDNA模板，用ddH2O补足25.0μL。

[0069] 荧光定量PCR反应程序为：（1）95℃30S；（2）95℃5S，（3）60℃25S，步骤（2）-（3）重复40个循环；4℃保存。

[0070] e.定量外标准品的制备和标准曲线的绘制

[0071] 按照步骤b所述方法提取植物乳杆菌ATCC14917的总RNA，经紫外分光光度计测定吸光度值（260nm），测定总RNA浓度为920ng/μL，根据植物乳杆菌ATCC14917的基因组8
大小计算出拷贝数为2.26×10CFU/mL。通过步骤c所述方法反转录得到cDNA，做10倍系列稀释，以此稀释后的cDNA模版进行步骤d所述荧光定量PCR反应。以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以荧光定量PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct值)为纵坐标得到植物乳杆菌ATCC14917的RT-PCR标准曲线，其回归方程为Y=-3.36lgX+40.67，
2
R=0.996，如图2所示。

[0072] 其中植物乳杆菌ATCC14917稀释的最低浓度是2.26×102CFU/mL，低于此浓度，荧2
光信号杂乱，因此本发明所述植物乳杆菌定量检测方法的稀释下限为2.26×10CFU/mL。

[0073] f.植物乳杆菌数量检测结果

[0074] 利用步骤c所述方法制备待测样品的cDNA模板，利用步骤d所述特异性检测引物，以相同的方法进行植物乳杆菌特征片段的荧光定量PCR扩增，检测待测样品的Ct值。依据回归方程：Y=-3.36lgX+40.67和待测样品的Ct值，可以计算出样品中植物乳杆菌ATCC14917的数量，检测结果如表1所示：

[0075] 表1产品中植物乳杆菌ATCC14917含量的定量结果

[0076]

[0077] 将上述样品通过平板计数法检测植物乳杆菌ATCC14917的数量，其结果如表1所示（所述平板计数方法请参考：赵建新，田丰华，陈卫，等.酸奶中嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌检测方法的研究[J].中国乳品工业，2005,33(2):54-57.）。

[0078] 将荧光定量PCR法测得的植物乳杆菌数量同平板计数法测定的植物乳杆菌数量进行分析可知：两种方法检测结果相近(±10%)，在平板计数的正常误差范围内，相关性显示呈明显的正相关（R2＝0.994，回归方程为：Y=0.95X+0.45），其结果如图3所示。两种细菌数检测方法相比，采用常规平板计数方法耗时为2～3天，而采用本发明所述定量检测方法只需半天时间，从而极大地节约了时间成本。

[0079] 实施例3市售益生菌乳制品中植物乳杆菌ST-III的定量检测方法

[0080] a.样品总RNA的制备

[0081] 将市场上购买的含有植物乳杆菌ST-III发酵乳饮料（光明畅优植物乳酸菌饮品）作为实施样品，分别是距离生产日期为10天，15天和20天的三个样品，置于盛有液氮的研钵中研磨，按照RNA提取试剂盒（康为世纪Liquid Sample RNA Reagent，货号CW0534）提取样品RNA，然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样本，测浓度，RNA完整性通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

[0082] b.反转录扩增

[0083] 依据反转录试剂盒（HiFi-MMLV cDNA Kit，北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0744）说明书进行将上述RNA样本反转录扩增，获得cDNA模板。

[0084] c.实时荧光定量PCR方法

[0085] 取实施例1所得植物乳杆菌种属特异性检测引物，其序列如下所述：

[0086] 上游引物5’-GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’（如序列表中SEQ ID No:1所示）；

[0087] 下游引物5’-AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3’（如序列表中SEQ ID No:2所示），所述引物扩增片段长度为107bp。

[0088] 荧光定量PCR按照Power Green PCR Master Mix（美国invitrogen公司，货号4367659）说明书进行。反应体系为20.0μL，各反应物终浓度为：1× PCR Master mix，0.25μmol/L上下游引物（SEQ ID No:1、SEQ ID No:2），2.0ng/μL的cDNA模板，用ddH2O补足20.0μL。

[0089] 荧光定量PCR反应程序为：（1）94℃30S；（2）94℃5S，（3）60℃20S，步骤（2）～（3）重复30个循环；4℃保存。

[0090] d.植物乳杆菌数量检测结果

[0091] 按照实施例2的方法进行定量外标准品的制备和标准曲线的绘制，以待测样品和标准品的cDNA为模板，用植物乳杆菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行植物乳杆菌特征片段基因片段的荧光定量PCR扩增。依据回归方程：Y=-3.33lgX+39.56和待测样品的Ct值，可以计算出样品中植物乳杆菌ST-III的数量，检测结果如表2所示：

[0092] 表2样品中植物乳杆菌ST-III含量的检测结果

[0093]距生产日期（天） Ct值 计数结果（CFU/mL）
10 16.37 9.20×106
6
15 17.81 3.40×10
20 19.9 8.02×105

[0094] 实施例4混合样品中植物乳杆菌的定量检测

[0095] 为了验证该方法是否受其他近缘菌的干扰，本实施例将三种已知菌体浓度的单菌发酵乳混合后，测定其中植物乳杆菌的菌数。三种菌株分别是：植物乳杆菌CCTCC No.M206033、副植物乳杆菌ATCC700211和戊糖乳杆菌ATCC8041。三种单菌发酵乳按不同浓度的比例混合，如表3所示：

[0096] 表3各菌种混合比例

[0097]

[0098] 按照前述方法测定其中植物乳杆菌的数量，反应体系为30.0μL，各反应物终浓度为：1× PCR Master mix，0.3μmol/L上下游引物（如序列表中SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示），2.0ng/μL的DNA模板，用ddH2O补足30.0μL。

[0099] 荧光定量PCR反应程序为：（1）95℃，25S，（2）95℃，15S，（3）60℃，30S，步骤（2）～（3）重复45个循环；4℃保存。荧光定量PCR结果如表4所示：

[0100] 表4植物乳杆菌检出率表

[0101]计量值(CFU/mL) 实测值(CFU/mL) 检出率（%）
比例1(%) 5.31×107 5.26×107 0.99
比例2(%) 1.45×108 1.56×108 1.08
比例3(%) 8.05×107 8.75×107 1.09
比例4(%) 8.05×106 8.64×106 1.07

[0102] 从表4数据可以看出：植物杆菌数量检测误差都在10%以内，表明本发明所述乳杆菌定量检测方法可以排除近缘菌的干扰，有效可行。

[0103] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。