微流体细胞仪及制作方法

摘要

本发明涉及医学检测领域，具体为一种微流体细胞仪及制作方法。解决了目前传统的血细胞仪体积庞大、价格昂贵，特别是互染率高的技术问题。一种微流体细胞仪，主要包括微流体芯片和特制的外部检测部件，所述微流体芯片上设有样本通道、聚焦检测通道和鞘流储液池；样本通道集成有对待测细胞液进行浓缩处理的样本预处理区域和缓冲区域；所述样本预处理区域设有微柱阵列。一种微流体细胞仪的制作方法，包括以下步骤：微流体沟道的制作、微流体芯片的盖片制作以及键合。本发明所述产品整体呈微型化，成本低廉，能够在芯片内部实现对待测细胞液的浓缩处理，且为一次性使用，针对每一个样本进行一次测量，彻底避免了样本之间相互影响的问题。

权利要求

1.一种微流体细胞仪，其特征在于，包括一个带有可开合盖子的外壳，外壳内底面上设有微位移平台，所述微位移平台上设有一个微流体芯片；所述微流体芯片包括由聚二甲基硅氧烷制成的底板（12）以及与底板（12）相配合的由聚二甲基硅氧烷制成的盖片（13）；底板（12）的表面开有微流体沟道；所述微流体沟道包括纵向设置的样本通道（2），样本通道（2）的两侧以样本通道（2）的纵向中心线为对称轴分别设有一个鞘流储液池（1）；样本通道（2）的两侧以样本通道（2）的纵向中心线为对称轴还分别设有一个鞘流通道（4）；所述两个鞘流通道（4）各通过一端和与其同侧的鞘流储液池（1）相连接；两个鞘流通道（4）的另一端与样本通道（2）的输出端共同连接有聚焦检测通道（6）；所述聚焦检测通道（6）与样本通道（2）处于同一直线上；聚焦检测通道（6）的横截面尺寸与包绕待测细胞液的鞘流及细胞液所形成的流束的横截面直径相配合，以使进入聚焦检测通道（6）的待检样品中的细胞全部为单行排列且被鞘液所包绕；所述鞘流通道（4）与样本通道（2）所成角度为30~45°；聚焦检测通道（6）不与样本通道（2）连接的一端设有出口；底板（12）通过上表面与盖片（13）键合；所述盖片（13）的下部与样本通道（2）相对应的位置还设有微柱阵列（3），所述微柱阵列（3）包括若干个平行排列、相互间距一定且与样本通道（2）底面垂直的柱体；微柱阵列（3）的排列方向与样本通道（2）纵向中心线相垂直；所述微柱阵列（3）最外侧的柱体与样本通道（2）的侧壁的间距不大于相邻柱体之间的间距；外壳内还设有激光光源（7），所述激光光源（7）位于微流体芯片的聚焦检测通道（6）的正上方，激光光源（7）与聚焦检测通道（6）之间还设有位于激光光源（7）出射光路上的聚焦透镜（14）；外壳内与出射光路呈90°角的位置设有目镜镜头（15），所述的目镜镜头（15）后部设有滤光片（16），滤光片（16）的后部设有电荷耦合元件（17）；电荷耦合元件（17）连接有计算机系统（18）；外壳内部靠近聚焦检测通道（6）的前端还设有光电探头；光电探头与计算机系统相连接；盖片（13）的上部与鞘流储液池（1）及微柱阵列（3）相对应的位置上方均设有由电机（8）驱动的电磁器件（10）；所述电机（8）设在外壳的内部；外壳的外表面设有与计算机系统（18）相连接的显示屏；外壳表面设有外接电源插口；所述激光光源（7）、电荷耦合器件（17）、计算机系统（18）、电机（8）、显示屏和光电探头均与外接电源插口连接。

2.如权利要求1所述的微流体细胞仪，其特征在于，所述样本通道（2）包括顺次连接的样本预处理区域和缓冲区域；缓冲区域的一端与样本预处理区域相连接，缓冲区域的另一端与聚焦检测通道（6）相连接；所述缓冲区域高于样本预处理区域，聚焦检测通道（6）与缓冲区域位于同一高度；缓冲区域与样本预处理区域相连接的部位呈一个斜面（5）；所述斜面（5）与底板（12）底面所成角度为30~45°。

3.一种微流体细胞仪的制作方法，用于制作如权利要求2所述的微流体细胞仪；所述的聚二甲基硅氧烷简称为PDMS；其特征在于，包括以下步骤：第一部分：微流体沟道的制作；

步骤1：对硅片（19）表面进行预处理；

步骤2：在硅片（19）上甩第一层胶SU-8 100，甩胶机转速为530~550rpm，得到

590~610μm的光刻胶层（20）；

步骤3：前烘；将表面附着有光刻胶层（20）的硅片（19）放在烘箱里进行烘烤，首先由室温缓慢升温至60~68℃，在此温度范围内保持15~17min，然后加热至90~95℃，在此温度范围内保持50~65min；最后降温至60~68℃，然后再降温到20~25℃；

步骤4：曝光；对SU-8光刻胶层（20）执行紫外光斜曝光，曝光时采用与斜面（5）相配合的掩膜板（21）进行掩膜，所用紫外光与硅片（19）所成角度为30~45°，曝光过程要充分，得到与斜面（5）位置对应的隐斜面；

步骤5：后烘；将已斜曝光的光刻胶层（20）放在烘箱内加热，由室温升温至60~70℃，在此温度范围内保持20~25min，再升温至90~98℃，在此温度范围保持40~45min，最后降温至

60~65℃，再降温到20~25℃；

步骤6：甩第二层胶；旋涂SU-8 100胶，速度为1490~1520rpm，获得第二层795~810μm厚的第二光刻胶层（23）；

步骤7：二次前烘；首先由20~25℃升温至60~66℃，在此温度范围内保持15~17min，然后加热至90~98℃，在此温度范围保持85~100min，最后再降温至60~68℃，然后再降温到

20~25℃；

步骤8：垂直曝光；在第二光刻胶层（23）上放置与微流体沟道相配合的第二掩模板（22），第二掩模板（22）的放置位置与隐斜面的位置相配合从而形成样本预处理区域与缓冲区域之间的斜面，然后进行垂直曝光，曝光出底板（12）上所有的SU-8边墙；所述边墙即微流体沟道的侧壁；曝光过程要充分；

步骤9：后烘；在烘箱上加热，由20~25℃升温至60~68℃，在此温度范围内保持

8~10min，然后升温至90~95℃，并保持50~60min，最后降温至60~68℃，再降温到20~25℃； 步骤10：显影；用SU-8显影液显影，并用异丙醇和去离子水清洗，空气中干燥；得到SU-8制作的微流体沟道；

步骤11：配制PDMS，按照预聚物：固化剂=10：1的比例配置PDMS，并抽真空；

步骤12：倒出微流体沟道的负模；将制作好的SU-8的微流体沟道上浇注配置好的PDMS，抽真空，加热至60~65℃，并保存110~130min，PDMS固化后，将PDMS从SU-8结构上剥离，形成原结构的反模，即微流体沟道的负模； 步骤13：倒出PDMS正模，得到与SU-8模具一致的PDMS微流体沟道；对PDMS负模表面进行表面处理后，浇注已配置好的PDMS，抽真空，加热至60~70℃，并保存110~130min，PDMS固化后，将PDMS从PDMS负模上剥离，得到PDMS的正模；

以上所有步骤中的升降温速度均为8~10℃/min；曝光所用紫外光波长为300~400nm；

第二部分：微流体芯片的盖片制作；

步骤1：对硅片的预处理；

步骤2：甩胶；在硅片上甩胶SU-8 100，转速为1690~1720rpm，得到95~105μm的第三光刻胶层；

步骤3：前烘；把表面附着有第三光刻胶层的硅片放在烘箱里进行烘烤，首先由室温缓慢升温至60~68℃，在此温度范围内保持15~17min，然后加热至90~98℃，在此温度范围内保持15~20min，最后降温至60~65℃，再降温到20~25℃；

步骤4：垂直曝光；在前烘好的硅片上垂直曝光，得到用于样本浓缩预处理的微柱阵列（3）；曝光过程要充分；

步骤5：后烘；在烘箱上加热，由室温升温至60~68℃，在此温度范围内保持15~17min，然后加热至90~98℃，在此温度范围内保持15~20min，最后降温至60~65℃，再降温到

20~25℃；

步骤6：显影；用SU-8显影液显影，用异丙醇和去离子水清洗，空气中干燥；

步骤7：配制PDMS，按照预聚物：固化剂=10：1比例配置PDMS，并抽真空；

步骤8：倒模；

将配制好的PDMS浇注在SU-8模具上，脱模，得到带有微柱状阵列的PDMS盖片（13）；

上述所有步骤中的升降温速度均为8~10℃/min；曝光所用紫外光波长为300~400nm；

第三部分：键合，得到微流体芯片；

将PDMS制成的与底板（12）相配合的盖片（13）在显微镜下对准底板（12）后，将其盖合，并采用63~65°C真空加热2~3小时后，得到不可逆键合。

说明书

微流体细胞仪及制作方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医学检测领域，具体为一种微流体细胞仪及制作方法。

背景技术

[0002] 流式细胞仪是使用流式细胞术进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)，是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。传统的流体细胞仪的结构主要包括流动室，流动室的两侧对称设有一对鞘液管；两个鞘液管的一端均与流动室的一端共同连接有一个检测通道；流体细胞仪的工作原理是：首先将待测细胞经荧光染色后制成单细胞悬液，然后用一定压力将单细胞悬液压入至流动室，另外将不含细胞的磷酸缓冲液（又称为鞘液）从鞘液管中压出，并使得鞘液与单细胞悬液汇合；鞘液管入口方向与待测样品流（即单细胞悬液流）成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着单细胞悬液流高速流动，形成一个截面呈圆形的流束，一般该截面的直径为10~20μm。单细胞悬液中的待测细胞在鞘液的包绕下呈单行排列，并依次通过检测通道；流式细胞仪的检测通道上通常设有激光光源，激光光源发射的激光经过聚焦整形后垂直照射在被鞘液包绕的样品流上，被荧光染色的细胞在激光的照射下，产生散射光和激发荧光，这两种信号分别被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收；所述90°方向是指激光在照射到样品流上后，产生激发荧光，激发荧光与入射激光的方向垂直同时与样品流的流动方向垂直；光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号与光电倍增管之间还设有一系列双色性反射镜和带通滤光片；荧光信号经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机通过专门的软件对所测量到的各种信号进行处理，并将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

[0003] 以上所述的流式细胞仪广泛应用于细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究等的科学研究，同时也应用于肿瘤学、血液学、免疫学等中的临床应用中。但是，现在市场上的传统的血细胞仪大多体积庞大、价格昂贵，特别是使用中每个被测试的细胞样本均通过同一个流动室及检测通道，导致互染率高，检测结果不够准确，每次检测完毕后必须进行相关医学处理，费时费力，影响检测的效率。

[0004] 近年来发展起来的微流控芯片制造技术由于具有体积小、试样及试剂消耗少、散热性好、灵活方便等优点，受到了分析化学界的重视，并取得了很多有意义的研究成果。但迄今关于它的研究主要集中于毛细管电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动色谱及PCR 检测等分离分析方面。微流控芯片的设计和研制也主要针对样品引入、分离以及柱前及柱后反应等方面；制作中多利用高分子聚合物的光刻、模塑等工艺形成三维空间的流体通道以满足分析检测的要求。而对于细胞及其它微粒物质在微芯片上的计数及分选的研究却未得到应有的重视，研究成果也十分有限。相关的制作工艺还达不到生物细胞检测的要求。

[0005] 本发明的目的在于解决传统的流动细胞仪体积庞大、价格昂贵、互染率高，以及在检测之前还需对样本使用另外装置进行特殊预处理的技术问题，通过采用微流控芯片制造技术，制造一种集成有样本预处理单元的体积小巧、成本低廉、且不存在相互感染的高效的细胞检测装置。

发明内容

[0006] 本发明为解决目前传统的血细胞仪大多体积庞大、价格昂贵、样本预处理过程繁琐，特别是互染率高的技术问题，提供一种微流式细胞仪及制作方法。

[0007] 本发明所述的微流式细胞仪是采用以下技术方案实现的：一种微流体细胞仪，包括微流体芯片，所述微流体芯片包括由聚二甲基硅氧烷制成的底板以及与底板相配合的由聚二甲基硅氧烷制成的盖片；底板的表面开有微流体沟道；所述微流体沟道包括纵向设置的样本通道，样本通道的两侧以样本通道的纵向中心线为对称轴分别设有一个鞘流储液池；样本通道的两侧以样本通道的纵向中心线为对称轴还分别设有一个鞘流通道；所述两个鞘流通道各通过一端和与其同侧的鞘流储液池相连接；两个鞘流通道的另一端与样本通道的输出端共同连接有聚焦检测通道；所述聚焦检测通道与样本通道处于同一直线上；聚焦检测通道的横截面尺寸与包绕待测细胞液的鞘流及细胞液所形成的流束的横截面直径相配合，以使进入聚焦检测通道的待检样品中的细胞全部为单行排列且被鞘液所包绕；所述鞘流通道与样本通道所成角度为30~45°；聚焦检测通道不与样本通道连接的一端设有出口；底板通过上表面与盖片键合；所述盖片的下部与样本通道相对应的位置还设有微柱阵列，所述微柱阵列包括若干个平行排列、相互间距一定且与样本通道底面垂直的柱体；微柱阵列的排列方向与样本通道纵向中心线相垂直；所述最外侧的柱体与样本通道的侧壁的间距不大于相邻柱体之间的间距。

[0008] 聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， 简称PDMS)是一种高分子有机硅化合物，通常被称为有机硅。是一种非易燃性、透明弹性体。二甲基硅氧烷的制程简便且快速，材料成本远低于硅晶圆，且其透光性良好、生物相容性佳、易与多种材质室温接合、以及因为低杨氏模量（Young’s modulus）导致的结构高弹性（structural flexibility）等特点，广泛运用在生物微机电中的微流道系统、填缝剂、润滑剂、隐形眼镜。聚二甲基硅氧烷在液态时为一种黏稠液体，称做硅油，是一种具有不同聚合度链状结构的有机硅氧烷混合物；在固态时为一种硅胶。实验室中通常用主剂与固化剂以一定比例（10:1、20:1或者根据具体要求的其它比例）混合均匀后，利用抽真空的方式使混合液中的气泡浮至表面并破裂，再在一定温度下烘烤一定时间后使其固化，主剂和固化剂的比例、加热温度、加热时间等参数的不同将会制作出不同硬度的PDMS。

[0009] 鞘流储液池内预先灌注有磷酸缓冲液；工作时，首先将待测样品经荧光染色后制成单细胞悬液，然后通过压力将待测样品压入样本通道，一般使用注射器穿过盖片将由待测样品制得的单细胞悬液注射至样本通道。通过对盖片上方与两个鞘流储液池相对应的位置施加压力，鞘流储液池中的磷酸缓冲液在外界压力的作用下从鞘流储液池中流出；鞘流储液池及鞘流通道对称排列在样本通道的两侧，鞘流通道入口方向与待测样品流所成角度为30~45°，这些设计能够保证鞘液包绕着单细胞悬液高速流动，组成一个截面呈圆形的流束；所述待测样品在鞘液的包围下进入聚焦检测沟道，由于不同种类的细胞大小不一致，所以在进行检测时，需要根据待检测的细胞大小来选择相应的微流体芯片；由于聚焦检测通道的横截面尺寸与包绕待测细胞液的鞘流及细胞液所形成的流束的横截面直径相配合，以使进入聚焦检测通道的待检样品中的细胞全部为单行排列且被鞘液所包绕(聚焦检测通道横截面的尺寸不能太大，以保证进入聚焦检测通道的细胞在鞘液的包裹下呈单行排列；同时聚焦检测通道的横截面的尺寸也不能太小，应该保证单行排列的细胞在进入聚焦检测通道以后四周被鞘液所包围；达到上述条件以后，所述的流束方能满足检测要求)；通过在特定位置设置相应的光学检测器件，即可得到待检测样品的相关信息。被鞘液包绕的样品由聚焦检测通道的出口流出。

[0010] 本发明所设置的微柱阵列能够对待测细胞液进行预浓缩处理。检测前要对待测细胞液进行浓缩，以满足检测时对待测细胞液浓度的要求；微柱阵列的排列方向与样本通道纵向中心线相垂直，微柱阵列的设置，可以在样本通道内对待测样本进行浓缩；微柱阵列各个柱体之间的间隙可依待检测的细胞的大小来制作，需要检测某种细胞，就选用适合于这种细胞的微流体芯片；使用时是通过外部压力使盖片上方与微柱阵列相对应的位置下移，使微柱阵列与样本通道的底面接触，样品通道就形成一端有梳状柱体的腔室，柱体挡住待检测颗粒，被挡住的细胞就逐渐聚集起来，而液体则流走。外力撤去后，这些被聚集的细胞颗粒被后续注入到样本流中的稀释液带走并流过样本通道，完成浓缩，并在两边鞘流的作用下，在聚焦检测通道中排成单行队列，依次通过聚焦检测通道。图4a为未施加外力时的微柱阵列，图4b显示微柱阵列下移，挡住待测细胞，而液体可以流过，箭头所指方向为样品流的流动方向；图4c显示微柱阵列前富集了众多的待测细胞；图4d显示微柱阵列上移，聚集的细胞被后续注入的稀释液带走完成浓缩。所述最外侧的柱体与样本通道的侧壁的间距不大于相邻柱体之间的间距，是为了确保待测样品在进行浓缩时，细胞不至于从最外侧的柱体与样本通道的侧壁之间的间隙进入聚焦检测通道。

[0011] 目前常用的流动细胞仪不能对待测细胞液进行浓缩处理，需要将待测细胞液预先浓缩处理后再进行检测，操作较为繁琐。而本发明实现了在微流体芯片内对待测细胞液进行浓缩的过程，且实现方法简单巧妙，且几乎不增加生产成本。

[0012] 针对每个待检测的细胞样品，使用一个微流体细胞仪，避免了过去传统的流式细胞仪容易出现的相互感染的技术问题，检测结果更加准确可靠；本发明将待检测液与缓冲液的汇合过程集约在一个很小的生物芯片上完成，整体呈微型化，成本低廉，携带使用都非常方便。

[0013] 使用中保持微柱阵列一直处于与样品通道底面接触的位置，还可以阻止直径大于待检测细胞的杂质细胞进入到聚焦检测通道，进一步保证检测结果的精确度。

[0014] 本发明所述的微流体细胞仪的制作方法是采用如下技术方案实现的：一种微流体细胞仪的制作方法，所述的聚二甲基硅氧烷简称为PDMS；包括以下步骤：

[0015] 第一部分：微流体沟道的制作；

[0016] 步骤1：对硅片表面进行预处理；

[0017] 步骤2：在硅片上甩第一层胶SU-8 100，甩胶机转速为530~550rpm，得到590~610μm的光刻胶层；

[0018] 步骤3：前烘；将表面附着有光刻胶层的硅片放在烘箱里进行烘烤，首先由室温缓慢升温至60~68℃，在此温度范围内保持15~17min，然后加热至90~95℃，在此温度范围内保持50~65min；最后降温至60~68℃，然后再降温到20~25℃；

[0019] 步骤4：曝光；对SU-8光刻胶层执行紫外光斜曝光，曝光时采用与斜面相配合的掩膜板进行掩膜，所用紫外光与硅片所成角度为30~45°，曝光过程要充分，得到与斜面位置对应的隐斜面；

[0020] 步骤5：后烘；将已斜曝光的光刻胶层放在烘箱内加热，由室温升温至60~70℃，在此温度范围内保持20~25min，再升温至90~98℃，在此温度范围保持40~45min，最后降温至60~65℃，再降温到20~25℃；

[0021] 步骤6：甩第二层胶；旋涂SU-8 100胶，速度为1490~1520rpm，获得第二层795~810μm厚的第二光刻胶层；

[0022] 步骤7：二次前烘；首先由20~25℃升温至60~66℃，在此温度范围内保持15~17min，然后加热至90~98℃，在此温度范围保持85~100min，最后再降温至60~68℃，然后再降温到20~25℃；

[0023] 步骤8：垂直曝光；在第二光刻胶层上放置与微流体沟道相配合的第二掩模板，第二掩模板的放置位置与隐斜面的位置相配合，从而形成样本预处理区域与缓冲区域之间的斜面，然后进行垂直曝光，曝光出底板上所有的SU-8边墙；所述边墙即微流体沟道的侧壁；曝光过程要充分；

[0024] 步骤9：后烘；在烘箱上加热，由20~25℃升温至60~68℃，在此温度范围内保持8~10min，然后升温至90~95℃，并保持50~60min，最后降温至60~68℃，再降温到20~25℃； [0025] 步骤10：显影；用SU-8显影液显影，并用异丙醇和去离子水清洗，空气中干燥；得到SU-8制作的微流体沟道；

[0026] 步骤11：配制PDMS，按照预聚物：固化剂=10：1比例配置PDMS，并抽真空；

[0027] 步骤12：倒出微流体沟道的负模；将制作好的SU-8的微流体沟道上浇注配置好的PDMS，抽真空，加热至60~65℃，并保存110~130min，PDMS固化后，将PDMS从SU-8结构上剥离，形成原结构的反模，即微流体沟道的负模；

[0028] 步骤13：倒出PDMS正模，得到与SU-8模具一致的PDMS微流体沟道；对PDMS负模表面进行清洁处理后，浇注已配置好的PDMS，抽真空，加热至60~70℃，并保存110~130min，PDMS固化后，将PDMS从PDMS负模上剥离，得到PDMS的正模；

[0029] 以上所有步骤中的升降温速度均为8~10℃/min；曝光所用紫外光波长为300~400nm；

[0030] 第二部分：微流体芯片的盖片制作；

[0031] 步骤1：对硅片的预处理；

[0032] 步骤2：甩胶；在硅片上甩胶SU-8 100，转速为1690~1720rpm，得到95~105μm的光刻胶层；

[0033] 步骤3：前烘；把表面附着有第三光刻胶层的硅片放在烘箱里进行烘烤，首先由室温缓慢升温至60~68℃，在此温度范围内保持15~17min，然后加热至90~98℃，在此温度范围内保持15~20min，最后降温至60~65℃，再降温到20~25℃；

[0034] 步骤4：垂直曝光；在前烘好的硅片上垂直曝光，得到用于样本浓缩预处理的微柱阵列；曝光过程要充分；

[0035] 步骤5：后烘；在烘箱上加热，由室温升温至60~68℃，在此温度范围内保持15~17min，然后加热至90~98℃，在此温度范围内保持15~20min，最后降温至60~65℃，再降温到20~25℃；

[0036] 步骤6：显影；用SU-8显影液显影，用异丙醇和去离子水清洗，空气中干燥；

[0037] 步骤7：配制PDMS，按照预聚物：固化剂=10：1比例配置PDMS，并抽真空；

[0038] 步骤8：倒模；

[0039] 将配制好的PDMS浇注在SU-8模具上，脱模，得到带有微柱状阵列的PDMS盖片；

[0040] 上述所有步骤中的升降温速度均为8~10℃/min；曝光所用紫外光波长为300~400nm；

[0041] 第三部分：键合，得到微流体芯片；

[0042] 将PDMS制成的与底板相配合的盖片在显微镜下对准底板后，将其盖合，并采用63~65°C真空加热2~3小时后，得到不可逆键合。

[0043] SU-8胶为微光刻领域最常见的用于制模的一种胶，其专门用于在非常厚的底层上光刻出具有高深宽比的微结构。此光刻胶在近紫外光范围内光吸收率低，这使得它在整个光刻胶厚度上都有较好的曝光均匀性。即使膜厚达1000μm，所得到的图形边缘仍近乎垂直，深宽比可达50:1。

[0044] 对SU-8胶进行的甩胶是通过甩胶机来实现的；甩胶机是指利用旋转产生离心力的原理，将胶液均匀甩开，平铺到材料表面的一种机械装置。由于PDMS材料的性质不适合直接加工成底板和盖片，因此需要先采用SU-8胶制出底板和盖片的模型，再通过相关工艺制作出微流体沟道的PDMS负模，并进一步制作出PDMS的正模。所述的硅片表面预处理、甩胶、前烘、曝光、后烘、显影、倒模、键合等工艺均为本领域技术人员的公知技术，是易于实现的；所述的充分曝光是指曝光后的SU-8胶在显影后被曝光部分能够全部留下，而未曝光部分则被去除；所述隐斜面是指在显影后能够形成斜面的光刻胶层部分；本发明所采用的PDMS是由美国Dow Corning Corp生产的SYLGARD 184型硅橡胶，它是由液体组分组成的双组分套件产品，包括预聚物与固化剂；使用时，按照预聚物：固化剂为10:1的比例配制好PDMS液体，然后将其倾倒在SU-8胶制成的微流体沟道上，倒出负模，然后再倒出正模。

[0045] 采用本发明公开的工艺可以制作出各项性能指标均符合医学检测标准的微流体细胞仪。

[0046] 在进行第二层甩胶时，由硅片表面到光刻胶层的表面的垂直高度为795~810μm；图5~图10为整个微流体芯片的制作流程图。图5为倾斜曝光的示意图，经过倾斜曝光后，斜面的形状已经确定；图7为垂直曝光，经过垂直曝光后就获得了微流体沟道的全部结构；
垂直曝光时，先前已经制出的斜面由于已经进过显影而固化，不会再受到曝光的影响，因此斜面仍然保持原先的结构，并与垂直曝光后的结构一同形成微流体沟道。图8为得到全部微流体沟道的底板结构示意图，图9为盖片的结构示意图，图10为整个微流体芯片装配后的结构示意图。

[0047] 本发明所述方法在现有光刻技术的基础上制作出了符合相关检测要求的微流体芯片，制作出的芯片经检测能够很好的完成细胞检测的工作要求，实现了流式细胞以的微型化，从根本上避免了检测过程中待测样品的相互感染。

附图说明

[0048] 图1微流体芯片的用于检测时的结构示意图。

[0049] 图2 微流体芯片的俯视结构示意图。

[0050] 图3微流体芯片的立体结构示意图。

[0051] 图4微流体芯片中使用微柱阵列进行样本预处理的原理图。图a为样本流通道微柱阵列的截面图，图b为微柱阵列受到挤压后，开始截断符合要求的样本的直视图，图c为富集了相当多的符合要求的样本，图d为松开微柱阵列，样本通过样本通道。

[0052] 图5 倾斜曝光，制作出斜面的结构示意图。

[0053] 图6 斜面的结构示意图。

[0054] 图7垂直曝光结构示意图。

[0055] 图8负胶垂直曝光后得到全部微流体沟道的底板结构示意图。

[0056] 图9 带有微柱阵列的PDMS盖板结构示意图。

[0057] 图10整个微流体芯片装配后的结构示意图。

[0058] 1-鞘流储液池，2-样本通道，3-微柱阵列，4-鞘流通道，5-斜面，6-聚焦检测通道；7-激光光源，8-电机，9-输送软管，10-电磁器件，11-注射泵，12-底板，13-盖片，14-聚焦透镜，15-目镜镜头，16-滤光片，17-电荷耦合器件，18-计算机系统，19-硅片，20-光刻胶层，21-掩模板，22-第二掩膜板，23-第二光刻胶层。

具体实施方式

[0059] 一种微流体细胞仪，包括微流体芯片，所述微流体芯片包括由聚二甲基硅氧烷制成的底板12以及与底板12相配合的由聚二甲基硅氧烷制成的盖片13；底板12的表面开有微流体沟道；所述微流体沟道包括纵向设置的样本通道2，样本通道2的两侧以样本通道2的纵向中心线为对称轴分别设有一个鞘流储液池1；样本通道2的两侧以样本通道2的纵向中心线为对称轴还分别设有一个鞘流通道4；所述两个鞘流通道4各通过一端和与其同侧的鞘流储液池1相连接；两个鞘流通道4的另一端与样本通道2的输出端共同连接有聚焦检测通道6；所述聚焦检测通道6与样本通道2处于同一直线上；聚焦检测通道6的横截面尺寸与包绕待测细胞液的鞘流及细胞液所形成的流束的横截面直径相配合，以使进入聚焦检测通道6的待检样品中的细胞全部为单行排列且被鞘液所包绕；所述鞘流通道4与样本通道2所成角度为30~45°（可选择30°、35°、40°、45°）；聚焦检测通道6不与样本通道2连接的一端设有出口；底板12通过上表面与盖片13键合；所述盖片13的下部与样本通道2相对应的位置还设有微柱阵列3，所述微柱阵列3包括若干个平行排列、相互间距一定且与样本通道2底面垂直的柱体；微柱阵列3的排列方向与样本通道2纵向中心线相垂直；所述最外侧的柱体与样本通道2的侧壁的间距不大于相邻柱体之间的间距。

[0060] 所述样本通道2包括顺次连接的样本预处理区域和缓冲区域；缓冲区域的一端与样本预处理区域相连接，缓冲区域的另一端与聚焦检测通道6相连接；所述缓冲区域高于样本预处理区域，聚焦检测通道6与缓冲区域位于同一高度；缓冲区域与样本预处理区域相连接的部位呈一个斜面5；所述斜面5与底板12底面所成角度为30~45°（可选择30°、35°、40°、45°）。缓冲区域与样本预处理区域之间的斜面能够使样品流及鞘液在流动中的速度相对较缓慢，更易于控制；缓冲区域高于样本预处理区域，这样可以防止待测样品还未经过浓缩以及被鞘液包绕就进入聚焦检测通道，影响检测结果。

[0061] 还包括一个带有可开合盖子的外壳，外壳内底面上设有微位移平台，所述微流体芯片设置在微位移平台上；外壳内还设有激光光源7，所述激光光源7位于微流体芯片的聚焦检测通道6的正上方，激光光源7与聚焦检测通道6之间还设有位于激光光源出射光路上的聚焦透镜14；外壳内与出射光路呈90°角的位置设有目镜镜头15，所述的目镜镜头15后部设有滤光片16，滤光片16的后部设有电荷耦合元件17；电荷耦合元件17连接有计算机系统18；外壳内部靠近聚焦检测通道6的前端还设有光电探头；光电探头与计算机系统相连接；盖片13的上部与鞘流储液池1及微柱阵列3相对应的位置上方均设有由电机8驱动的电磁器件10；所述电机8设在外壳的内部；外壳的外表面设有与计算机系统18相连接的显示屏；外壳表面设有外接电源插口；所述激光光源7、电荷耦合器件17、计算机系统18、电机8、显示屏和光电探头均与外接电源插口连接。

[0062] 一种微流体细胞仪的制作方法，所述的聚二甲基硅氧烷简称为PDMS；包括以下步骤：

[0063] 第一部分：微流体沟道的制作；

[0064] 步骤1：对硅片19表面进行预处理；

[0065] 步骤2：在硅片19上甩第一层胶SU-8 100，甩胶机转速为530~550rpm（可选用530 rpm、535 rpm、540 rpm、545 rpm、550 rpm），得到590~610μm（可选择590μm、595μm、
600μm、605μm、610μm）的光刻胶层；

[0066] 步骤3：前烘；将表面附着有光刻胶层20的硅片19放在烘箱里进行烘烤，首先由室温缓慢升温至60~68℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃），在此温度范围内保持15~17min（可选择15 min、16 min、17 min），然后加热至90~95℃（可选择90℃、91℃、92℃、
93℃、94℃、95℃），在此温度范围内保持50~65min（可选择50 min、55 min、60 min、65 min）；
最后降温至60~68℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃），然后再降温到20~25℃（可选择20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃）；

[0067] 步骤4：曝光；对SU-8光刻胶层执行紫外光斜曝光，曝光时采用与斜面5相配合的掩膜板21进行掩膜，所用紫外光与硅片19所成角度为30~45°（可选择30°、35°、40°、45°），曝光过程要充分，得到与斜面5位置对应的隐斜面；

[0068] 步骤5：后烘；将已斜曝光的光刻胶层20放在烘箱内加热，由室温升温至60~70℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃），在此温度范围内保持20~25min（可选择20 min、21 min、22 min、23 min、24 min、25 min），再升温至90~98℃（可选择90℃、92℃、94℃、96℃、98℃），在此温度范围保持40~45min（可选择40 min、41 min、42 min、43 min、
44 min、45 min），最后降温至60~65℃（可选择60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃），再降温到20~25℃（可选择20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃）；得到斜面5；

[0069] 步骤6：甩第二层胶；旋涂SU-8 100胶，速度为1490~1520rpm（可选择1490 rpm、1495 rpm、1500 rpm、1505 rpm、1510 rpm、1515 rpm、1520 rpm），获得第二层795~810μm（可选择795μm、800μm、805μm、810μm）厚的第二光刻胶层23；

[0070] 步骤7：二次前烘；首先由20~25℃（可选择20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃）升温至60~66℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃），在此温度范围内保持15~17min（可选择15 min、16 min、17 min），然后加热至90~98℃（可选择90℃、92℃、94℃、96℃、98℃），在此温度范围保持85~100min（可选择85 min、90 min、95 min、100 min），最后再降温至60~68℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃），然后再降温到20~25℃（可选择20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃）；

[0071] 步骤8：垂直曝光；在第二光刻胶层23上放置与微流体沟道相配合的第二掩模板22，第二掩模板22的放置位置与隐斜面的位置相配合，从而形成样本预处理区域与缓冲区域之间的斜面，然后进行垂直曝光，曝光出底板12上所有的SU-8边墙；所述边墙即微流体沟道的侧壁；曝光过程要充分；

[0072] 步骤9：后烘；在烘箱上加热，由20~25℃（可选择20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃）升温至60~68℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃），在此温度范围内保持8~10min（可选择8 min、9 min、10 min），然后升温至90~95℃（可选择90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、
95℃），并保持50~60min（可选择50 min、52 min、54 min、56 min、58 min、60 min），最后降温至60~68℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃），再降温到20~25℃（可选择20℃、21℃、
22℃、23℃、24℃、25℃）；

[0073] 步骤10：显影；用SU-8显影液显影，并用异丙醇和去离子水清洗，空气中干燥；得到SU-8制作的微流体沟道；

[0074] 步骤11：配制PDMS，按照预聚物：固化剂=10：1比例配置PDMS，并抽真空；

[0075] 步骤12：倒出微流体沟道的负模；将制作好的SU-8的微流体沟道上浇注配置好的PDMS，抽真空，加热至60~65℃（可选择60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃），并保存110~130min（可选择110 min、120 min、130 min），PDMS固化后，将PDMS从SU-8结构上剥离，形成原结构的反模，即微流体沟道的负模；

[0076] 步骤13：倒出PDMS正模，得到与SU-8模具一致的PDMS微流体沟道；对PDMS负模进行表面处理后，浇注已配置好的PDMS，抽真空，加热至60~70℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃），并保存110~130min（可选择110 min、120 min、130 min），PDMS固化后，将PDMS从PDMS负模上剥离，得到PDMS的正模；

[0077] 以上所有步骤中的升降温速度均为8~10℃/min（可选择8℃/min、9℃/min、10℃/min）；曝光所用紫外光波长为300~400nm（可选择300 nm、320 nm、340 nm、360 nm、380 nm、400 nm）；

[0078] 第二部分：微流体芯片的盖片制作；

[0079] 步骤1：对硅片的预处理；

[0080] 步骤2：甩胶；在硅片上甩胶SU-8 100，转速为1690~1720rpm（可选择1690 rpm、1700 rpm、1710 rpm、1720rpm），得到95~105μm（可选择95μm、100μm、105μm）的第三光刻胶层；

[0081] 步骤3：前烘；把表面附着有第三光刻胶层的硅片放在烘箱里进行烘烤，首先由室温缓慢升温至60~68℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃），在此温度范围内保持15~17min（可选择15 min、16 min、17 min），然后加热至90~98℃（可选择90℃、92℃、94℃、
96℃、98℃），在此温度范围内保持15~20min（可选择15 min、16 min、17 min、18 min、19 min、20 min），最后降温至60~65℃（可选择60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃），再降温到
20~25℃（可选择20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃）；

[0082] 步骤4：垂直曝光；在前烘好的表面附着有第三光刻胶层的硅片上垂直曝光，得到用于样本浓缩预处理的微柱阵列；曝光过程要充分；

[0083] 步骤5：后烘；在烘箱上加热，由室温升温至60~68℃（可选择60℃、62℃、64℃、66℃、68℃），在此温度范围内保持15~17min（可选择），然后加热至90~98℃（可选择90℃、
92℃、94℃、96℃、98℃），在此温度范围内保持15~20min（可选择15 min、16 min、17 min、18 min、19 min、20 min），最后降温至60~65℃（可选择60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃），再降温到20~25℃（可选择20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃）；

[0084] 步骤6：显影；用SU-8显影液显影，用异丙醇和去离子水清洗，空气中干燥；

[0085] 步骤7：配制PDMS，按照预聚物：固化剂=10：1比例配置PDMS，并抽真空；

[0086] 步骤8：倒模；

[0087] 将配制好的PDMS浇注在SU-8模具上，脱模，得到带有微柱状阵列的PDMS盖片13；

[0088] 上述所有步骤中的升降温速度均为8~10℃/min（可选择8℃/min、9℃/min、10℃/min）；曝光所用紫外光波长为300~400nm（可选择300 nm、320 nm、340 nm、360 nm、380 nm、400 nm）；

[0089] 第三部分：键合，得到微流体芯片；

[0090] 将PDMS制成的与底板12相配合的盖片13在显微镜下对准底板12后，将其盖合，并采用63~65℃（可选择60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃）真空加热2~3小时（可选择2小时、2.5小时、3小时）后，得到不可逆键合。

[0091] 向样本通道内注射待测样品时，可以采用注射泵11进行注射，注射泵11通过输送软管9将待测样品注射入样本通道2。

[0092] 斜面5的设置可以减缓待检测样本的流速，从而保证待检测细胞在进入聚焦检测沟道6时细胞间排列的更加均匀，使得检测结果更为准确可靠。

[0093] 将微流体细胞仪以及相关检测装置设置在一个外壳内，使整个检测装置仪器化，小型化；方便携带；外壳的表面设有用于控制计算机系统18、电机8、电荷耦合器件17、激光光源7、显示屏的开关或按钮；外壳插头与外部电源接通后，整个装置就可以工作；微流体芯片检测结束后，可以取出换一个新的芯片；电机驱动电磁器件上下运动，以实现对鞘流储液池1以及样本通道2的压力；计算机系统采用相应的软件对微流体芯片内的待检测样本进行检测，所述相应软件是现有公知技术，是易于编写的。