龙芽草的组织培养与快速繁殖方法

摘要

本发明涉及植物组织培养与快速繁殖方法，尤其涉及一种龙芽草的组织培养与快速繁殖方法。龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，该方法包括以下的步骤：1）外植体的消毒：取刚发育成熟的龙芽草羽状复叶中的较大小叶，清洗后消毒，然后将叶片切成1~3cm2的小块，以正面朝上的水平摆放方式接种到添加不同植物生长调节物质的MS培养基上；2）不定芽诱导：外植体接入的MS培养基中；3）切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3cm高的不定芽，插入到生根培养基中，20~30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，待新叶长出，即可除去烧杯。本发明的优点在于：提高了生根率和生根数，并且根的长度和粗度适中，大大提高了移栽的成活率。

权利要求

1.龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）外植体的消毒：

取刚发育成熟的龙芽草羽状复叶中的较大小叶，加洗涤剂仔细刷洗，再用流水冲洗，在超净台里将叶片转入酒精溶液中浸泡，后转入消毒液中浸泡消毒，用无菌水冲洗，然后将叶2

片切成1~3 cm 的小块，以正面朝上的水平摆放方式接种到添加植物生长调节物质的MS培养基上；

2）不定芽诱导

外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质的组成如下：TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L；

先进行暗培养，温度为25±1℃，培养条件为光/暗小时比为12~16:8~12，光照强度2

30~40 μmol/（ｍ ·s）；

3）不定芽增殖

将于培养基中诱导出的不定芽丛，切成2~3株的小块，接种额外再添加IAA0.2~2.0 mg/L的培养基中；

4）切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到生根培养基中，所述的生根培养基中包括：基本培养基 1/4 MS ~MS

NAA 0.05~0.5 mg/L；

炼苗时微开培养瓶盖进行炼苗，20~30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，初期要做好保湿措施，并置于阴凉处，待新叶长出，即可除去烧杯。

2.根据权利要求1所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤1）消毒液为滴加一滴1 mol/L NaOH的0.2%HgCl2溶液。

3.根据权利要求2所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤1）消毒时间为5~6 min。

4.根据权利要求1所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤4）生根培养基中NAA为 0.08~0.3mg/L。

5.根据权利要求1所述的龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于步骤4）生根培养基为1/4MS+NAA 0.1 mg/L。

说明书

龙芽草的组织培养与快速繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养与快速繁殖方法，尤其涉及一种龙芽草的组织培养与快速繁殖方法。

背景技术

[0002] 龙芽草(Agrimonia pilosa)为蔷薇科(Rosaceae)龙芽草属多年生草本植物，是一种重要的药用植物，其地上部分、带短小根茎的冬芽和根均可入药。其中，地上部分入药称仙鹤草，异名脱力草、狼牙草、金顶龙牙、龙牙草、龙芽草、黄龙尾、刀口药、毛脚茵等，性平，味苦、涩，归肺、肝、脾经，具收敛止血、消炎止痢、杀虫和抗肿瘤之功效，临床用于治疗嗜盐菌感染性食物中毒、滴虫性阴道炎和梅尼埃综合症得到良效；带短小根茎的冬芽入药称鹤草芽，异名狼牙、狼齿、狼牙子、狼牙草根芽、仙鹤草根芽等，其性凉，味苦、涩，具驱虫和解毒消肿之功效，主治绦虫病、阴道滴虫病、疮疡疥癣、疖肿和赤白痢疾。临床治疗绦虫病有良效；根入药名龙芽草根，异名地冻风，其性温，味辛、涩，具解毒和驱虫之功效，主治赤白痢疾、疮疡、肿毒、疟疾、绦虫病和闭经等症。近些年来，对龙芽草的化学成分分析、提取分离、测定方法和功效都有了较深入的研究。目前龙芽的繁殖采用种子和分根方式进行，这两种方法存在淹繁殖系数低、繁殖周期长的缺点，因此建立龙芽草的组培快繁体系，是实现其产业化生产的又一有效途径。

[0003] 已有龙芽草组织培养的报道（《植物生理学通讯》1986年04期 ，龙芽草的组织培养，吴美芬、陈伟东）：以龙芽草实生苗的下胚轴、子叶和叶片为外植体的器官发生途径，叶片和下胚轴需经2,4-D诱导愈伤组织阶段，子叶可经MS+6-BA 2.0 mg/L NAA 0.2 mg/L诱导愈伤组织后分化出不定芽。

发明内容

[0004] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种龙芽草的组织培养与快速繁殖方法， 采用该方法进行龙芽草的组织培养与快速繁殖，提高了生根率和生根数，并且根的长度和粗度适中，大大提高了移栽的成活率。

[0005] 为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

[0006] 龙芽草的组织培养与快速繁殖方法，该方法包括以下的步骤：

[0007] 1）外植体的消毒：

[0008] 取刚发育成熟的龙芽草羽状复叶中的较大小叶，加洗涤剂仔细刷洗，再用流水冲洗，在超净台里将叶片转入酒精溶液中浸泡，后转入消毒液中浸泡消毒，用无菌水冲洗，然2
后将叶片切成1~3 cm 的小块，以正面朝上的水平摆放方式接种到添加不同植物生长调节物质的MS培养基上；

[0009] 2）不定芽诱导

[0010] 外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质的组成包括：

[0011] 6-BA 0.5~5.0 mg/L

[0012] TDZ 0.1~1.0 mg/L；

[0013] 先进行暗培养，温度为25±1℃，培养条件为光/暗小时比为12~16:8~12，光照强度30~40 μmol/ｍ·s；

[0014] 3）切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到生根培养基中，所述的生根培养基中包括：

[0015] 基本培养基 （1/4~1）MS

[0016] NAA 0.05~0.5 mg/L；

[0017] 炼苗时微开培养瓶盖进行炼苗，20~30h后取出并洗净根部附着的培养基，移入土中，初期要做好保湿措施，并置于阴凉处，待新叶长出，即可除去烧杯。

[0018] 作为优选，上述的步骤1）消毒液为滴加一滴1 mol/L NaOH的0.2%HgCl2溶液。作为再优选，上述的消毒时间为10~11 min。

[0019] 作为优选，上述的步骤2）中添加的植物生长调节物质的组成包括：

[0020] 6-BA 1.0~4.0 mg/L

[0021] TDZ 0.1~0.8mg/L。

[0022] 作为最优选，上述的步骤2）中添加的植物生长调节物质选用TDZ 0.3 mg/L +6-BA2.0 mg/L。

[0023] 作为优选，上述的步骤2）植物生长调节物质的组成还包括IAA、NAA或两者的组合，IAA的浓度为0~2.0 mg/L，NAA的浓度为0~0.5 mg/L。

[0024] 作为再优选，上述的步骤2）植物生长调节物质的组成还包括IAA，IAA的浓度为0.5~1.5 mg/L。

[0025] 作为优选，上述的步骤3）生根培养基中NAA为 0.08~0.3mg/L。

[0026] 作为最优选，上述的步骤3）生根培养基为1/4MS+NAA 0.1 mg/L。

[0027] 本发明由于采用了上述的技术方案，采用该方法进行龙芽草的与快速繁殖提高了生根率和生根数，并且根的长度和粗度适中，大大提高了移栽的成活率。该方法建立了龙芽草的组培快繁体系，是实现其产业化生产的有效途径。

具体实施方式

[0028] 材料来源：龙芽草采自浙江省丽水市白云山，移栽种植至中国计量学院网室。

[0029] 外植体材料：龙芽草的叶片。

[0030] 1. 外植体的消毒：取刚发育成熟的龙芽草羽状复叶中的较大小叶，加适量洗涤剂仔细刷洗，再用流水冲洗0.5~1.0 h后，在超净台里将叶片转入70%的酒精溶液中浸泡30 s，后转入滴加了1滴1 mol/L NaOH的0.2%HgCl2溶液内浸泡消毒若干时间，用无菌水冲洗2
4~5次，然后将叶片切成1~3 cm 的小块，以正面朝上的水平摆放方式接种到添加不同植物生长调节物质的MS培养基上。

[0031] 1.1结果：消毒5~6 min达到最佳效果，外植体的污染率和死亡率均低于10%。

[0032] 2.不定芽诱导预实验

[0033] 外植体接入的MS培养基中添加的植物生长调节物质的组成分别为：

[0034] 1) 2,4-D 2.0 mg/L +6-BA 0.5 mg/L；

[0035] 2) 6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L；

[0036] 3) TDZ 0.3 mg/L -1+NAA 0.1 mg/L；

[0037] 4) TDZ 0.05 mg/L +2,4-D 2.0 mg/L；

[0038] 5) TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L。

[0039] 重复3次。所有培养基中蔗糖浓度为3％，琼脂浓度为0.7％，pH 5.8-6.0，下同。先进行暗培养，温度为(25±1)℃，培养条件为14ｈ光/10ｈ暗，光照强度30~40 μmol/ｍ·s，下同。平时观察外植体生长情况并记录，在30 d时随机抽出10瓶进行统计，并筛选出较佳的植物生长调节物质组合以进行优化。

[0040] 2.1 结果：添加2,4-D的培养基(1和4号培养基)中没有诱导出不定芽，而其余3种培养基中均诱导出了不定芽，但不定芽出现的时间不一，以添加TDZ 0.3 mg/L +6-BA
2.0 mg/L的最早(5号培养基)，最早可12 d，诱导率也最高(65.6%)，添加6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L的最晚(2号培养基)，最早时间为20 d，诱导率也最低(12.2%)，故在最佳不定芽诱导的筛选中选择TDZ和6-BA作为侯选植物生长调节物质。同时，在培养过程中观察，添加2,4-D的培养基中只观察到较小的愈组织，而在产生不定芽的培养基中，发现一定时间后其部分叶盘基部膨大，边缘翘起，叶片切口处有类似愈伤组织的绿色物质形成，且基部多于端部，但仔细分辨为小芽点，并随着培养时间的增加而更加明显，出现不定芽最多的部分是着生叶柄处。

[0041] 3. 不定芽诱导的植物生长调节物质组合的优化

[0042] 各设置3个梯度的TDZ(0.1、0.3和1.0 mg/L)和6-BA(0.5、2.0和5.0 mg/L)组合，配制MS培养，将外植体接种于其上，30 d随机抽出10瓶进行统计。

[0043] 3.1 结果：TDZ和6-BA浓度的升高，不定芽诱导率和诱导数表现出快速上升的趋势，但在高浓度时有所下降，各处理的诱导率介于44.1~8.9%之间，诱导出的不定芽数量介于3.3~7.7之间。两个植物生长调节物质的叠加效应也非常明显，尤其是低浓度时，一个植物生长调节物质浓度的提高可快速提高诱导率和诱导数，不定芽诱导率最高可达90%左右，诱导出的不定芽也有8个左右。但高浓度的TDZ和6-BA带来了玻璃化的问题，两者也有叠加效应，最高浓度的TDZ和6-BA组合，其玻璃化最严重。适中的TDZ和6-BA的玻璃化程度较低，且不定芽诱导率和诱导数较高，尤以TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L的组合为佳，诱导率可到85.6%，不定芽数量可达到7.4，且生长良好。

[0044] 4. 不同生长调节物质组合对增殖生长的影响

[0045] MS+TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L虽可以诱导出不定芽，但在继代中发现不定芽虽有增殖，但生长缓慢，30 d时很少高于2 cm，很难用于生根实验，故在增殖生长培养中，再额外加入生长素IAA和NAA进行筛选。将于MS+TDZ 0.3 mg/L +6-BA 2.0 mg/L培养基中诱导出的不定芽丛，切成2~3株的小块，接种额外再添加不同浓度IAA(0、0.2、0.5、1.0和2.0 -1mg/L)或NAA(0、0.05、0.1、0.2和0.5 mg·L )的优化培养基中。30 d随机抽出10瓶进行统计。

[0046] 4.1 结果：随着IAA浓度的升高，不定芽的增殖率提高，生长也同时加快，并在1 mg/L达到稳定，增殖率可从4.03升高到4.39，但NAA对增殖率和不定芽生长的影响均不大，介于4.09~4.14之间。

[0047] 5. 再生植株的生根培养和移栽

[0048] 切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到生根培养基中，各设置3个