一种通过花药培养获得百脉根再生植株的方法

摘要

本发明涉及一种通过花药培养获得百脉根再生植株的方法，属于牧草育种技术领域。本方法的步骤为：A)取单核靠边期花蕾，用冰盒带至实验室后4℃冷藏2-3d；B)次氯酸钠消毒后利用体式显微镜剥离后置于愈伤组织诱导培养基上培养；C)暗培养20d后，继代3-4次，每次间隔15d。将继代后的愈伤组织置于不定芽诱导培养基上培养，诱导愈伤组织形成芽；D)芽复壮培养后，置于生根培养基上培养15-20d，诱导根；E)炼苗后移栽可获得再生苗。以上操作中，B)-D)均在无菌环境中进行，C)中的暗培养需借助生化培养箱，C)中不定芽的形成和D)中根的形成均需要人工气候箱。

权利要求

1.一种通过花药培养获得百脉根再生植株的方法，包括外植体的准备、愈伤组织的诱导、愈伤组织的分化培养、芽生根的步骤，其特征在于：a.外植体的准备：选单核靠边期的花药灭菌处理备用；

b.愈伤组织的诱导：无菌环境下剥出花药，接种于愈伤组织诱导培养基上，该培养基的配方为NB+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L +KT 2.0 mg/L，蔗糖90 g/L，琼脂6 g/L，pH

5.8；接种密度为40-50个/皿，用封口膜封口后，放置于生化培养箱25 ℃暗培养至长出愈伤组织，然后利用NB+NAA 0.3 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH 5.8继代培养，培养条件：温度25±2 ℃，16 h光照、8 h黑暗，湿度50-70 %，光照强度1500-2000 lx；

c.愈伤组织的分化培养：将愈伤组织继代2-3次，每次15 d；然后转入愈伤组织分化培养基，诱导芽的分化；分化培养基的配方为MS+ KT 1.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH 5.8；培养条件：温度25±2 ℃，16 h光照、8 h黑暗，湿度50-70%，光照强度

2000-2500 lx；

d.生根培养：分化培养30 d后，将产生的不定芽转入MS基本培养基进行不定芽复壮培养；不定芽长至2-3 cm时转入1/2 MS+0.5 mg/L NAA，蔗糖10 g/L，琼脂6 g/L，pH 5.8的培养基进行生根培养；培养条件为：温度25±2 ℃，16 h光照、8 h黑暗，湿度50-70 %，光照强度2500-3000 lx。

说明书

一种通过花药培养获得百脉根再生植株的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种通过花药培养获得百脉根(Lotus corniculatus Linn)再生植株的方法，属于牧草育种技术领域。

背景技术

[0002] 百脉根(Lotus corniculatus Linn)原产于欧、亚温暖地带，是豆科百脉根属多年生牧草。具有产草量高、绿期长、蛋白含量高（孕蕾期粗白质含量在26.15%）、营养丰富、适口性好且家畜采食后不发生鼓胀等优点。百脉根具有耐热、耐水淹、耐瘠薄、耐酸等特点，是我国温暖湿润地区极有希望的优良牧草。因此，开展百脉根的育种研究工作对于南方草地畜牧业的发展具有十分重要的意义。

[0003] 栽培百脉根为同源四倍体，自交不亲和，具有高度的杂合性，采用常规育种进程缓慢、效率差。利用花药培养技术不仅可以缩短育种周期、提高选择效率且可以得到性状丰富的单倍体或纯合二倍体材料。Guha(1964)、Maheshwari（1966)以毛曼陀罗（Datura innoxia mill.）的花药为外植体获得了再生植株，至此花药培养在植物细胞遗传学、遗传学和育种等方面得到了广泛应用。近年来，花药培养已与常规杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，形成了一套行之有效的育种技术体系，已经成为工程育种的重要组成部分，利用花药培养产生的DH（加倍单倍体）群体也是构建遗传图谱的优良群体。本发明以百脉根花药为材料，建立了一套适合百脉根简单、快速、稳定的花药培养体系，为百脉根的单倍体育种及其遗传作图群体DH群体的构建等提供前期准备工作。这对百脉根的遗传改良、新品种的选育及南方草地畜牧业的发展都有着极其重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种获得百脉根(Lotus corniculatus Linn)单倍体植株的方法，即以百脉根花药为外植体，进行离体培养，花药内的小孢子发育成单倍体植株。

[0005] 本发明方法包括外植体的准备、愈伤组织的诱导、愈伤组织的分化培养、芽生根的步骤，其具体如下：

[0006] a.外植体的准备：选单核靠边期的花药灭菌处理备用；

[0007] b.愈伤组织的诱导：无菌环境下剥出花药，接种于愈伤组织诱导培养基上，该培养基的配方为NB+2,4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L+KT2.0mg/L，蔗糖90g/L，琼脂6g/L，pH5.8；接种密度为40-50个/皿，用封口膜封口后，放置于生化培养箱25℃暗培养至长出愈伤组织，然后利用NB+NAA0.3mg/L+2,4-D0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.8继代培养，培养条件：温度25±2℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度1500-2000lx。其中NB为培养基代号，表1为配方成分；2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸；NAA为α-萘乙酸；KT为激动素。

[0008] c.愈伤组织的分化培养：将愈伤组织继代2-3次，每次15d；然后转入愈伤组织分化培养基，诱导芽的分化；分化培养基的配方为MS+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.8；培养条件：温度25±2℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度2000-2500lx；

[0009] d.生根培养：分化培养30d后，将产生的不定芽转入MS基本培养基进行不定芽复壮培养；不定芽长至2-3cm时转入1/2MS+0.5mg/L NAA，蔗糖10g/L，琼脂6g/L，pH5.8的培养基进行生根培养；培养条件为：温度25±2℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度2500-3000lx。其中MS为培养基代号，表2为配方成分。

[0010] f.再生苗的获得：转入生根培养基15-20d后，开始炼苗。先将封口揭开，在人工气候箱中炼苗3d，保证每天浇适量蒸馏水；然后在光照培养间（温度（25±2）℃，16h光照、8h黑暗，湿度60-80%，光照强度2500-3000lx）炼苗3d后开始移栽，移栽前将苗根部残留的培养基冲洗干净，移栽到已经过灭菌的基质（蛭石：珍珠岩：营养土=5:3:2，可加少许0.5%的标典3721生根液）上室内培养10-15d后便可移栽到大田。

[0011] 本发明以豆科重要牧草百脉根的花药为外植体，进行离体培养，从而快速高效获得具有亲本遗传基因的单倍体植株。单倍体植株加倍后，不仅可以缩短育种周期、提高选择效率且可以得到性状丰富、纯合原倍性材料。近年来分子生物学的发展，将单倍体作为转基因受体可以较少多倍体的复杂程度，更好的验证和分析基因功能；利用基因组学研究百脉根的特异性状也表现的越来越重要，花药培养构建DH纯系或DH群体是基因组学研究的理想材料。

附图说明

[0012] 图1是本发明方法示意图。

[0013] 图2是培养各步骤的照片。A接种花药；（B-C）暗培养20d的愈伤组织；D愈伤组织的继代培养；E胚状体的诱导；F不定芽；G芽的复壮培养；（H-J）芽的生根培养；（K-L）再生苗的获得。

具体实施方式

[0014] 实施例1、以百脉根(Lotus corniculatus Linn)单核靠边期的花药为外植体，离体培养获得百脉根再生植株。

[0015] 操作过程如图1，具体过程如下：

[0016] a.百脉根单核靠边期花药的选择

[0017] 1）、所选百脉根市售品种“里奥”为材料，于10月初播种，次年4月下旬开始，在晴天上午9:00点-11:00点采集2mm左右、绿色、苞片与花蕾等长、呈刀尖状的花蕾（使用醋酸洋红染色压片法，观察、确定发育时期）。此时的花蕾大都处于单核靠边期。

[0018] 2）、将上述花蕾装入小牛皮纸袋，用冰盒迅速带至实验室，放入4℃冰箱中2-3d。

[0019] b.外植体的灭菌及接种

[0020] 1）、将上述低温处理过的花蕾包入纱布，放入超净工作台灭过菌的培养皿中，然后用无菌水冲洗3次，酒精30s，无菌水冲洗3次，再用5%的次氯酸钠灭菌15min，无菌水冲洗3次。

[0021] 2）、在超净工作台中，将灭过菌的材料转至灭好菌的培养皿（垫灭菌的滤纸）置于体式显微镜下，用灭菌的一次性注射器（5ml）剥离花药，接种于愈伤组织诱导培养基上。

[0022] c.愈伤组织的诱导与继代：

[0023] 1）、愈伤组织诱导培养基的配方为NB+2,4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L+KT2.0mg/L，蔗2
糖90g/L，琼脂6g/L，pH5.8。培养基灭菌条件：压力1.0kg/cm 以上，121℃灭菌22min。

[0024] 2）、愈伤组织诱导培养基接种密度为40-50个/皿（图2A），用美国Parafilm封口膜封口后，放置于生化培养箱25℃暗培养20d左右（图2B，2C）。

[0025] 3）、等长出愈伤组织后利用NB+NAA0.3mg/L+2,4-D0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/2
L，pH5.8继代培养（图2D）。培养基灭菌条件：压力1.0kg/cm 以上，121℃灭菌22min。培养条件：温度（25±2）℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度1500-2000lx。

[0026] d.愈伤组织的分化培养：

[0027] 1）、将愈伤组织继代2-3次，每次15d。然后转入愈伤组织分化培养基，诱导芽的分化（图2E）。

[0028] 2）、分化培养基的配方为MS+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/2
L，pH5.8。培养基灭菌条件：压力1.0kg/cm 以上，121℃灭菌22min。培养条件：温度（25±2）℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度2000-2500lx。

[0029] 3）、上述分化培养一般需要30d左右，就会有不定芽产生（图2F）。

[0030] e.生根培养：

[0031] 1）、将上述产生的不定芽转入MS基本培养基进行不定芽复壮培养（图2G）。复壮培2
养的培养基为MS+20g/L蔗糖，琼脂6g/L，pH5.8。培养基灭菌条件：压力1.0kg/cm 以上，
121℃灭菌22min。培养条件：温度（25±2）℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度
2000-2500lx。

[0032] 2）、不定芽长至2-3cm时转入生根培养基（图2H，2I），这个过程一般需要6-9d。

[0033] 3）、上述2）中的生根培养基为1/2MS+0.5mg/LNAA，蔗糖10g/L，琼脂6g/L，pH5.82
的培养基。培养基灭菌条件：压力1.0kg/cm 以上，121℃灭菌22min。培养条件为：温度（25±2）℃，16h光照、8h黑暗，湿度50-70%，光照强度2500-3000lx。

[0034] 4）、在生根培养基中培养15-20d后，便可以产生大量根系（图2H，2I，2J）。

[0035] f.再生苗的获得：

[0036] 1）、将产生根系的再生苗封口膜揭开，在人工气候箱中培养3d，保证每天浇适量蒸馏水。培养条件：培养间温度（25±2）℃，16h光照、8h黑暗，湿度60-80%，光照强度2500-3000lx

[0037] 2）、经过1）的步骤后，转入光照培养间培养3d，保证每天浇适量蒸馏水。培养条件：温度（25±2）℃，16h光照、8h黑暗，湿度60-80%，光照强度2500-3000lx。

[0038] 3）、经过2）的步骤后，将苗根部残留的培养基冲洗干净，移栽到已经过灭菌的基质（蛭石：珍珠岩：营养土=5:3:2，可加少许0.5%的标典3721生根液）上室内培养10-15d后便可移栽到大田（图2K，2L）。

[0039] 其中，①.醋酸洋红染色过程：将花蕾用卡诺固定液固定20-24h，保存在70%的酒精中，1%的醋酸洋红染色，染色1-5min。显微观测。（卡诺固定液：无水乙醇3份，冰醋酸1份；1%的醋酸洋红洋红1g，45%醋酸100ml。）

[0040] ②.以上操作中b-d需在无菌环境下进行。

[0041] ③.无菌水制作过程：超纯水压力1.0kg/cm2以上，121℃灭菌25分钟。在操作者2
双手需75%酒精消毒（75%的酒精用无水乙醇配制）。反复使用的器皿同样需压力1.0kg/cm以上，121℃灭菌25min。

[0042] ④.培养基配方如表1，表2；1/2MS即为在MS的基础上大量元素减半，其他成分不变。大量元素、微量元素及有机成分均订购于上海国药集团，激素为Sigma进口分装。

[0043] 表1NB培养基配方

[0044]

[0045] 表2MS培养基配方

[0046]

[0047] ⑤结果统计方法：

[0048] 愈伤组织诱导率（%）=诱导愈伤组织数/接种花药数×100

[0049] 分化率（%）=愈伤组织分化数/接种愈伤组织数×100

[0050] 生根率（%）=生根苗数/接种苗数×100

[0051] 成活率（%）=移栽苗数/成活苗数×100。

[0052] 该激素水平下愈伤组织诱导率为84.48%，分化率为59.57%，生根率：91.83%。（5）的方法移栽成活率为90.47%。

[0053] 实施例2

[0054] 本实施例与实施例1的不同之处在于：

[0055] ①采用愈伤组织诱导培养基的配方为NB+2,4-D1.0mg/L+NAA0.6mg/L+KT2.0mg/L，蔗糖90g/L，琼脂6g/L，pH5.8。

[0056] ②分化培养基的配方为MS+KT1.0mg/L+NAA0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH58。

[0057] ③生根培养基为1/2MS中+NAA0.3mg/L，蔗糖10g/L，琼脂6g/L，pH5.8.[0058] ④将移栽灭菌基质移栽基质换为大田土。

[0059] 该激素水平下愈伤组织诱导率为29.17%，分化率为13.21%，生根率：68.89%。④的方法移栽成活率为34.21%。

[0060] 实施例3

[0061] 本实施例与实施例1的不同之处在于：

[0062] ①采用愈伤组织诱导培养基的配方为NB+2,4-D1.5mg/L+NAA0.6mg/L+KT2.0mg/L，蔗糖90g/L，琼脂6g/L，pH5.8。

[0063] ②分化培养基的配方为MS+KT1.5mg/L+NAA1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.8。

[0064] ③生根培养基为1/2MS中+NAA0.7mg/L，蔗糖10g/L，琼脂6g/L，pH5.8.[0065] ④将移栽灭菌基质配方移栽基质换为全营养土。

[0066] 该激素水平下愈伤组织诱导率为51.2%，分化率为15.68%，生根率：55.81%。④的方法移栽成活率为60.97%。

[0067] 本发明所涉及的培养基配方及操作模式能高效获得百脉根花药离体培养单株，对每项操作过程和具体实施方案都做了详尽的描述。在实际应用中，只要采用了本发明提供的如百脉根花药培养外植体准备、培养基配方、培养条件及生根移栽的方法，只要构思相似，进行同等变换或者修饰，都将在本发明的保护范围之内。