一种造血干细胞冻存的方法及保护剂

摘要

本发明公开了一种造血干细胞冻存的方法及保护剂，具体是在无菌条件下，将造血干细胞悬液或骨髓液与干细胞保护剂混合冷冻保存即可，所述的干细胞保护剂成分包括：DMSO，1640无菌培养基和血液保存液Ⅰ，三者体积比例：9-10∶5∶5-6。该方法能够减低造血干细胞保护剂的成本，无需程序降温仪等高造价设备，无需添加液氮的繁琐、高风险程序，操作简单，易于在各级医疗机构推广。

权利要求

1.一种造血干细胞冻存的方法，其特征在于，无菌条件下，将造血干细胞悬液或骨髓液与干细胞保护剂混合冷冻保存即可，所述的干细胞保护剂由DMSO，1640无菌培养基和血液保存液Ⅰ组成，三者体积比例：9-10：5：5-6；

所述的干细胞保护剂体积占到造血干细胞悬液或骨髓液与干细胞保护剂的混合物的

19-21%；

先将干细胞保护剂的三种成分DMSO，1640无菌培养基和血液保存液Ⅰ按比例预混完全，之后将预混好的干细胞保护剂直接加入装有造血干细胞悬液或骨髓液的容器内，操作时要不断摇动，充分混匀，之后分装，排净空气，封口，泡沫盒封装，放入-80℃冰箱保存即可。

说明书

一种造血干细胞冻存的方法及保护剂

技术领域

[0001] 本发明涉及一种造血干细胞冻存的方法及保护剂，特别是涉及造血干细胞保护剂配方的组成成分、浓度、温度及冻存的程序。

背景技术

[0002] 近年的研究已证实自体造血干细胞移植支持大剂量化疗，可提高对化疗敏感的肿瘤的疗效；异体造血干细胞移植可以根治白血病等恶性造血系统疾病。造血干细胞的移植作为一种安全有效的方法，越来越被广大医务工作者及患者所接受，这与造血干细胞在体外的合理冻存与复苏是分不开的。造血干细胞移植的成功与否，很重要的一点取决于造血干细胞的冻存以及快速复苏和回输。既往的经典冻存方法要求采用二甲基亚砜(DMSO)10%，羟乙基淀粉(HES)6%和人血白蛋白(HSA)4%作为造血干细胞保护剂，按一定比例配比后，放入程序降温仪逐渐降温，之后转至-80℃深低温冰箱，最后在-196℃液氮保存，这种条件下保存的干细胞持续时间长，可达到几十年，造血干细胞冻存效果好，但存在着一些问题:1.此种方法成本高，人血白蛋白价格高，供应有限；2.程控降温的程序较复杂,需要程序降温仪等高造价设备，需要在有规模的医学中心并在有经验的操作人员指导下才能完成，推广困难；3.供储存用的液氮罐空间较少，且需不断补充液氮，操作繁琐且随着贮存时间的延长，贮存成本在逐渐增加。以上这些不利因素制约了造血干细胞移植在临床的推广。

发明内容

[0003] 本技术方案旨在提供一种简易的造血干细胞冻存的方法以及新的保护剂，能够减低造血干细胞保护剂的成本，无需程序降温仪等高造价设备，无需添加液氮的繁琐、高风险程序，操作简单，易于在各级医疗机构推广。

[0004] 一种造血干细胞冻存的方法：无菌条件下，将造血干细胞悬液或骨髓液与干细胞保护剂混合冷冻保存即可，所述的干细胞保护剂成分包括：DMSO，1640无菌培养基和血液保存液Ⅰ（ACDⅠ），三者体积比例：9-10：5：5-6。

[0005] 所述的干细胞保护剂体积占到造血干细胞悬液或骨髓液与干细胞保护剂的混合物的19-21%。具体操作如下：

[0006] 先将干细胞保护剂的三种成分DMSO，1640无菌培养基和血液保存液Ⅰ按比例预混完全，之后将预混好的干细胞保护剂直接加入装有造血干细胞悬液或骨髓液的容器内，操作时要不断摇动，充分混匀，之后分装，排净空气，封口，泡沫盒封装，放入-80℃冰箱保存即可。

[0007] 一种造血干细胞保护剂成分包括：DMSO，1640无菌培养基和血液保存液Ⅰ，三者体积比例：9-10：5：5-6。

[0008] 本技术方案的核心技术特征是用DMSO，1640无菌培养基和血细胞分离机使用的血液保存液Ⅰ液作为干细胞保护剂，替代传统的造血干细胞保护剂成分，无需使用程序降温仪，因为我们给冻存袋外加了合适大小的泡沫盒，利用冻存袋本身的热量及泡沫盒构建了一个简易的程序降温系统。这种方法可以使造血干细胞直接在-80℃深低温冰箱保存而且在1年内不影响造血干细胞的质量。

[0009] 优点和有益效果

[0010] 1、此方法可有效保存造血干细胞，从检测到的不同时间点(1、3、6、9、12个月)复苏的干细胞回收效率来看，此方法冻存的干细胞的细胞活性、粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM和CD34+细胞回收率与经典方法相比无明显差异(P>0.05)，解冻后的干细胞数量与质量足以保障移植的成功；

[0011] 2、本方法操作简便；

[0012] 3、本方法成本低，使用的仪器设备较简单，易于掌握和推广。

具体实施方式

[0013] 以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0014] 将装有血细胞分离机分离的造血干细胞悬液或手术抽取的骨髓液的无菌采血袋传送到无菌操作间或超净台，选择DMSO，1640无菌培养基和血细胞分离机使用的血液保存液Ⅰ（ACDⅠ）液作为干细胞保护剂，干细胞保护剂与造血干细胞悬液或手术抽取的骨髓液的混合液的最终比例分别是DMSO 9-10%，1640无菌培养基5%，ACDⅠ液5-6%，造血干细胞悬液或骨髓液79-81%，其中造血干细胞悬液或骨髓液无需去红细胞处理。先将干细胞保护剂的三种成分DMSO，1640无菌培养基和ACDⅠ液在无菌瓶内按比例预混完全，操作时要不断摇动无菌瓶，之后将预混好的干细胞保护剂直接加入装有造血干细胞悬液或骨髓液的无菌采血袋内，边加入边摇晃采血袋，将4种成分在无菌采血袋内充分混匀，之后将混匀液分装至医用无菌造血干细胞冻存袋内，排净空气，封口，标签注明采集时间、姓名、采集量，选与冻存袋大小相合适的泡沫盒作为冻存袋外包装，泡沫盒封口，标签注明采集时间、姓名、采集量。将泡沫盒直接放入-80℃冰箱保存即可。

[0015] 我们取10份不同个体的血细胞分离机采得的造血干细胞悬液，每份样品分成2组，再分别分5袋冻存，采用本技术方案和经典的冻存方案在不同时间点进行抽样检测，数据取平均值，结果如下：

[0016] 表一冻存过程中不同时间点细胞活力的检测（%）

[0017]

[0018] 表二冻存过程中不同时间点粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM的检测（每10万个细胞）