北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途转让专利
申请号 : CN201210467137.9
文献号 : CN103006741B
文献日 : 2014-05-07
发明人 : 余江南 , 奚超群 , 徐希明 , 童姗姗 , 易承学 , 曹霞
申请人 : 江苏大学
摘要 :
本发明公开了北葶苈子提取物抗肿瘤有效组分及其制备方法和抗肿瘤方面的应用，北葶苈子(炒)通过水提取，依次用乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取，收集水饱和的正丁醇萃取物，用硅胶（200-300目）柱进行分离，以不同比例的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，其二氯甲烷-甲醇（5:1）洗脱部位为北葶苈子抗肿瘤有效部分。该部位具有明显的抑制U251（胶质瘤细胞）、HepG2（人肝癌细胞）、SGC（人胃癌细胞）、mcf-7（人乳腺癌细胞）、SCLC（肺癌细胞）的作用，可以用于制备抗肿瘤药物。
权利要求 :
1.北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物，其特征是：它是由炒制的北葶苈子粉碎后，用水于90-100℃加热提取，提取液浓缩，醇沉，离心除去沉淀，减压浓缩除去乙醇，用乙酸乙酯及水饱和正丁醇依次萃取，收集水饱和正丁醇部位，过硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，收集二氯甲烷与甲醇体积比为5:1的洗脱液，蒸去溶剂，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。
2.一种制备上述北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物的方法，其特征是它包括如下步骤：
步骤1. 将炒制的北葶苈子粉碎，用水回流提取，冷却，离心，浓缩提取液，用95%乙醇进行醇沉，离心除去沉淀，浓缩除去乙醇，得提取液；
步骤2.将步骤1所得的提取液依次用乙酸乙酯、水饱和的正丁醇溶液进行萃取，收集水饱和正丁醇萃取液，用硅胶柱进行层析，洗脱剂为不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷与甲醇体积比为5∶1比例的洗脱液，旋转蒸发回收有机溶剂后，即得北葶苈子抗肿瘤有效部位提取物。
3.根据权利要求1所述的北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物为抗U251，HepG2、SGC、mcf-7或SCLC肿瘤细胞的药物。
说明书 :
北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物及其药物组合物。
背景技术
[0002] 目前由于环境污染的加剧，生活节奏的加快，生活压力的增大，癌症的发生率处于上升的趋势，据世界卫生组织最新数据显示，到2020年前，全球癌症发病率将增加50%,而近几年我国癌症发病率则以每年2.5%的速度增加，所以加快抗癌药物的研究显得更为紧迫。
[0003] 目前临床上抗肿瘤的药物主要为化学合成药物，虽对肿瘤疾病的治疗大有改善，但这些抗肿瘤治疗化学药物普遍存在毒副作用大，易产生耐药性等缺点。与之相比，中药在临床上所表现的不良反应相对较小，治疗费用相对较低，并且能保持用药的连续性，在预防和治疗肿瘤方面有较明显的优势。自20世纪50年代，逐渐出现中医药防治肿瘤的文献报道，规范的药物实验研究，中医药开始广泛应用于恶性肿瘤的防治。近年来，国内外对来源于天然的抗肿瘤药物的研究高度重视，对现有的中药资源进行了体内外抗肿瘤筛选试验研究，实验结果显示，很多中药具有不同程度的抗肿瘤作用。
[0004] 葶苈子（Semen Descurainiae.Semen Lepidii）为十字花科（Cruciferae）两种[0005] 基源植物，即独行菜（Lepidium apetalum Wild）和播娘蒿(Descurainia Sophia L.Webb ex Prantl)的干燥成熟种子。前者习称为北葶苈子，主要分布在我国的东北、河北、山东、山西、四川、内蒙古等地；后者习称为南葶苈子或华东葶苈子，主要分布在我国的东北、河南、山东、浙江、甘肃、内蒙古等地。临床上主要用于治疗痰涎壅肺、喘咳痰多、胸胁胀满、不得平卧、胸腹水肿、小便不利、肺源性心脏病心力衰竭等（中华人民共和国卫生部药典委员会.《中国药典》.北京：化学工业出版社，2010.）。
[0006] 现代药理研究表明，葶苈子具有止咳平喘、强心、利尿、抗菌、抗癌（国家医药管理中草药情报中心站.植物药有效成分手册：119，411，556-557，962-963，998.）、调血脂（刘忠良.药学实践杂志，2000，18（1）：15-17.）等作用。其中白芥子为止咳有效成分，苄基芥子油具有广谱抗菌作用，而其强心、利尿作用主要与其含有的强心苷类：毒毛旋花子配基(strophanthidine)、伊夫双苷(evobioside)、伊夫单苷(evomonoside)、葶苈苷（helveticoside）及糖芥苷(erysimoside) 有关（陈毓群，李荣芷，王云雯. 药学学报，
1981，16（1）：62-64. C.A.：1974：81，166395.）。葶苈子对人鼻咽癌细胞和千田子宫颈癌细胞株有极强的抑制作用，对艾氏腹水癌小鼠的癌细胞有明显的抑制作用，且几乎无毒副反应（常敏毅.抗癌中药：482-483；湖南科学技术出版社.）。孙凯研究发现毒毛旋花子配基对人体鼻咽癌（9KB）细胞具有明显的抑制作用，ED50﹤1μg/ml（孙凯.南葶苈子的化学成分研究[D] .沈阳药科大学，2005）。中国专利200810226062.9《葶苈子提取物在制备抗肿瘤药物中的应用》涉及了葶苈子提取物的提取溶剂及功效但未涉及葶苈子抗肿瘤作用具体有效部位及详细品名。
1981，16（1）：62-64. C.A.：1974：81，166395.）。葶苈子对人鼻咽癌细胞和千田子宫颈癌细胞株有极强的抑制作用，对艾氏腹水癌小鼠的癌细胞有明显的抑制作用，且几乎无毒副反应（常敏毅.抗癌中药：482-483；湖南科学技术出版社.）。孙凯研究发现毒毛旋花子配基对人体鼻咽癌（9KB）细胞具有明显的抑制作用，ED50﹤1μg/ml（孙凯.南葶苈子的化学成分研究[D] .沈阳药科大学，2005）。中国专利200810226062.9《葶苈子提取物在制备抗肿瘤药物中的应用》涉及了葶苈子提取物的提取溶剂及功效但未涉及葶苈子抗肿瘤作用具体有效部位及详细品名。
[0007] 发明内容
[0008] 本发明的目的之一是，提供北葶苈子(炒)抗肿瘤有效组分提取物及其制备方法。
[0009] 本发明的目的之二是，提供所说有效组分提取物在制备抗肿瘤及相关药物中的应用。
[0010] 本发明的技术方案如下：
[0011] 北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物，它是由炒制的北葶苈子粉碎后，用水于90-100℃加热提取，提取液浓缩，醇沉，离心除去沉淀，减压浓缩除去乙醇，用乙酸乙酯及水饱和正丁醇依次萃取，收集水饱和正丁醇部位，过硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，收集二氯甲烷与甲醇体积比为5:1的洗脱液，蒸去溶剂得到的北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。
[0012] 一种制备上述北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物的方法，它包括如下步骤：
[0013] 步骤1. 将炒制的北葶苈子粉碎，用水回流提取，冷却，离心，浓缩提取液，用95%乙醇进行醇沉，离心除去沉淀，浓缩除去乙醇，得提取液；
[0014] 步骤2.将步骤1所得的提取液依次用乙酸乙酯、水饱和的正丁醇溶液进行萃取，收集水饱和正丁醇萃取液，用硅胶柱进行层析，洗脱剂为不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷与甲醇体积比为5:1比例的洗脱液，旋转蒸发回收有机溶剂后，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。
[0015] 本发明进一步提供了北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。以抑制U251、HepG2、SGC、mcf-7、SCLC增殖能力为活性指标进行抗肿瘤活性实验。实验结果表明，在体外细胞毒实验中，可以明显抑制U251、HepG2、SGC、mcf-7、SCLC的增殖，具有细胞毒作用，可用于制备抗肿瘤治疗药物。
[0016] 有益效果 [0017] 1、本发明的优点和效果在于采用溶剂提取、萃取等常规方法，从北葶苈子中提取得到了新的具有抗肿瘤作用的有效部位，该有效部位经实验证明具有体外抑制U251、HepG2、SGC、mcf-7、SCLC生长的活性。
[0018] 2、本发明拓展了抗肿瘤药物的原料来源，扩大了北葶苈子的用途，使北葶苈子发展成为抗肿瘤药物的新原料，可显著提高葶苈子的附加值。
具体实施方式
[0019] 以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0020] 实施例1.北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物的制备
[0021] 将中药材北葶苈子(炒)粉碎，用10倍质量的水回流提取3h，离心后的残渣重复提取1次，离心，合并所有水提取液，浓缩提取液至原药材质量数（克）的80%的体积（ml），加95%乙醇进行醇沉，药液中乙醇的浓度约为60%~70%，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，加等体积的乙酸乙酯萃取至有机相接近无色，剩下的水液用水饱和的正丁醇萃取6次，回收正丁醇，得水饱和正丁醇提取物。取适量水饱和正丁醇提取物过硅胶柱，以不同体积比例的二氯甲烷-甲醇（100:0，50:1，20:1，10:1，5:1，1:1及0:100）进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液体积为4倍柱体积，收集体积比为5:1的二氯甲烷-甲醇洗脱液，浓缩，真空干燥，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。
[0022] 取北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物进行高效液相色谱分析。具体条件为：色谱柱为岛津shimpack C18柱（4.6×150mm），流速为1.0ml/min。梯度洗脱：A相：0.01%甲
酸-水；B相：甲醇，洗脱程序为0.0min～45.00min：B：2%～50%。北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在此色谱条件下，主要出现5个保留峰，保留时间分别为：t1=2.8min，t2=9.6min，t3=30.4min，t4=39.6min，t3=41.2min。
酸-水；B相：甲醇，洗脱程序为0.0min～45.00min：B：2%～50%。北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在此色谱条件下，主要出现5个保留峰，保留时间分别为：t1=2.8min，t2=9.6min，t3=30.4min，t4=39.6min，t3=41.2min。
[0023] 实施例2.北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物的制备
[0024] 将北葶苈子(炒)粉碎，用8倍质量的水回流提取2h，离心后的残渣重复提取2次，离心，合并所有水提取液，浓缩提取液至原药材质量数（克）的体积（ml），加95%乙醇进行醇沉，药液中乙醇的浓度约为60%，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，加等体积的乙酸乙酯萃取至有机相接近无色，剩下的水液用正丁醇萃取至有机相接近无色，收集正丁醇萃取部分。取适量正丁醇提取物过硅胶柱，以不同比例的二氯甲烷-甲醇（20:1，10:1，5:1，1:1）进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液体积为4倍柱体积，收集5:1的洗脱液，浓缩，真空干燥，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。
[0025] 取北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物进行高效液相色谱分析，色谱条件同实施例1。结果表明，北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在高效液相色谱上的保留情况与实施例1的一致。
[0026] 实施例3.北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物的制备
[0027] 将北葶苈子(炒)粉碎，用8倍质量的水回流提取2h，离心后的残渣重复提取2次，离心，合并所有水提取液，浓缩提取液至原药材质量数（克）的体积（ml），加95%乙醇进行醇沉，药液中乙醇的浓度约为60%，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，加等体积的乙酸乙酯萃取至有机相接近无色，剩下的水液用正丁醇萃取至有机相接近无色，收集正丁醇萃取部分。取适量正丁醇提取物过硅胶柱，以不同比例的二氯甲烷-甲醇（100:0，10:1，5:1，1:1）进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液体积为4倍柱体积，收集5:1的洗脱液，浓缩，真空干燥，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。
[0028] 取北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物进行高效液相色谱分析，色谱条件同实施例1。结果表明，北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在高效液相色谱上的保留情况与实施例1的一致。
[0029] 实施例4. 抗肿瘤活性实验
[0030] 以实施例1得到的北葶苈子有效部位为受试药物，体外培养U251、HepG2、SGC、-1mcf-7、SCLC，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500r﹒min 离心5min，将细胞重悬
4
于培养基中，细胞浓度调至2×10 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置
细胞培养箱（37℃，5%CO2）中培养24h，之后加入受试药物20μl，阴性对照组加入终浓度为-1
0.5%DMSO，各组均设3个复孔。在加药48h后，每孔加入5mg﹒ml MTT试剂20μl，继续置
于37℃培养4h。每孔加入DMSO100μl，振荡混匀，测定各孔在波长570nm处的吸光度值。
计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。
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于培养基中，细胞浓度调至2×10 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置
细胞培养箱（37℃，5%CO2）中培养24h，之后加入受试药物20μl，阴性对照组加入终浓度为-1
0.5%DMSO，各组均设3个复孔。在加药48h后，每孔加入5mg﹒ml MTT试剂20μl，继续置
于37℃培养4h。每孔加入DMSO100μl，振荡混匀，测定各孔在波长570nm处的吸光度值。
计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。
[0031] 表1 北葶苈子提取物对U251的抑制作用
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