N-酰基神经鞘胺醇类化合物、制备方法及其应用转让专利
申请号 : CN201210563660.1
文献号 : CN103012182B
文献日 : 2015-02-18
发明人 : 谭成玉 , 孔亮 , 李伟 , 李倩 , 孟繁桐
申请人 : 大连海洋大学 , 谭成玉
摘要 :
本发明公开一种可抑制血管紧张素I转换酶活性的N-酰基神经鞘胺醇类化合物，制备方法依次按如下步骤：取粉碎的多枝柽柳，采用体积分数为50~100%的乙醇或甲醇浸泡后加热回流提取，每次提取时间2~3h，提取次数2~3次，合并提取液；将所得的提取液经石油醚、正己烷或环己烷萃取2~4次，萃取溶剂与提取液的体积比为1~2：1~2，合并萃取液，回收溶剂得萃取物；将得到的萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚、乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，收集石油醚与乙酸乙酯体积比为100：0~2的洗脱馏份。
权利要求 :
1.一种N-酰基神经鞘胺醇类化合物的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a. 取粉碎的多枝柽柳，采用体积分数为50~100%的乙醇或甲醇浸泡后加热回流提取，每次提取时间2~3h，提取次数2~3次，合并提取液，减压回收提取液至醇浓度低于5 %，所含生药浓度为50~100g/ml；
b. 将所得的提取液经石油醚、正己烷或环己烷萃取2~4次，萃取溶剂与提取液的体积比为1~ 2 ：1~2，合并萃取液，回收溶剂得萃取物；
c. 将得到的萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚、乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，收集石油醚与乙酸乙酯体积比为100：0~2的洗脱馏份。
2.根据权利要求1所述的N-酰基神经鞘胺醇类化合物的制备方法，其特征在于所述粉碎的多枝柽柳与乙醇或甲醇的用量比为1 Kg：6~20 L。
说明书 :
N-酰基神经鞘胺醇类化合物、制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种N-酰基神经鞘胺醇类化合物、制备方法及其在制备抑制血管紧张素I转换酶活性药物中的应用。
背景技术
[0002] 高血压是最常见的心血管疾病，是威胁成年人健康的一个主要因素。人体内，血管紧张素I-转换酶（Angiotensin I-converting enzyme, ACE）为高血压蛋白酶-血管紧缩素系统（Renin-angiotension system, RAS）最重要的调节枢纽。一方面ACE可将从肝脏分泌的血管紧缩素I（Angiotensin I）切断转化为血管紧缩素II（Angiotensin II），血管紧缩素II促使血管收缩，造成高血压；另一方面，血浆中的激肽释放酶切断激肽原蛋白产生舒缓激肽（Bradykinin），舒缓激肽促进血管扩张，使血压下降，然而ACE却使舒缓激肽分解，钝化血管舒缓激肽；ACE在人体中的这两个方面都造成了血压升高，如果抑制了ACE的活性，就可以抑制高血压的产生。
[0003] 目前的降压药物分为五大类：干扰肾上腺素能神经药物、血管扩张药物、钙拮抗剂药物、利尿降压药物和血管紧张转换酶（ACE）抑制剂。其中血管紧张转换酶（ACE）抑制剂作用于肾素-血管紧张素系统后，能够有效的调节、控制人体血压，已应用于多种心血管疾病的治疗，如充血性心脏病，心肌梗塞，糖尿病肾病及肾功能障碍等，代表药物如卡托普利（captopril）。卡托普利虽然可以阻止ACE的活性，但也存在着不同程度的副作用，如咳嗽、消化不良反应、肝脏损伤、体位性低血压、肾脏损伤、白细胞减少等。天然药物具有疗效稳定、作用温和、毒性小等优点，在治疗糖尿病方面具有西药不可替代的优势。盐生植物是新疆十分宝贵的经济植物资源，但目前对新疆丰富的盐生植物资源还缺乏深入系统的研究，尤其是在药用盐生植物的开发利用方面。
[0004] 柽柳属 Tamarix Linn. 植物是管花肉苁蓉的寄主，是柽柳科分布最广、种类最多的属。同属植物多枝柽柳T. ramosissima Ledeb. 是管花肉苁蓉的主要寄主植物之一，也是分布最广泛的柽柳属植物之一，主要分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海等干旱地区，在产地亦作柽柳使用。据《哈医药》记载，多枝柽柳的枝叶可入药，用于治疗风湿病和黄疸；枝可用作收敛剂，对于感冒，麻疹初起，疹出不透，风湿性疼痛，扭伤，创口坏死等疾病，均有很好的疗效。专利申请号为200910249032.4的中国发明专利申请，公开了一种“从植物中提取 -葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法”，其中公开的具体方法是：将多枝柽柳干燥茎叶剪碎研磨后放入提取器中，加入体积与多枝柽柳茎叶质量比为8~30ml/g的醇-水或丙酮-水溶液浸泡，加热回流提取，提取温度为达至沸腾温度，提取次数为1~3次，每次提取时间为1.0~3.0h，弃去提取液，并将剩下茎叶晾干为提取物；向提取物中加入体积与提取物质量比为5~30ml/g的水进行二次提取，提取温度为达致沸腾温度，提取次数为1~3次，每次提取时间为1.0~3.0h；收集合并冷却后的提取液，减压浓缩，冷冻干燥得植物提取物。该提取物具有抑制 -葡萄糖苷酶活性，可广泛应用于制备降低糖尿病的药品及保健品中。但迄今为止还没有关于从多枝柽柳中分离得到N-酰基神经鞘胺醇类化合物以及其用于抑制血管紧张素I转换酶的相关报道。
发明内容
[0005] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种N-酰基神经鞘胺醇类化合物、制备方法及其在制备抑制血管紧张素I转换酶活性药物中的应用。
[0006] 本发明的技术解决方案是：
[0007] 一种N-酰基神经鞘胺醇类化合物的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：
[0008] a. 取粉碎的多枝柽柳，采用体积分数为50~100%的乙醇或甲醇浸泡后加热回流提取，每次提取时间2~3h，提取次数2~3次，合并提取液，减压回收提取液至醇浓度低于5 %，所含生药浓度为50~100g/ml；
[0009] b. 将所得的提取液经石油醚、正己烷或环己烷萃取2~4次，萃取溶剂与提取液的体积比为1~ 2 ：1~2，合并萃取液，回收溶剂得萃取物；
[0010] c. 将得到的萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚、乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，收集石油醚与乙酸乙酯体积比为100：0~2的洗脱馏份。
[0011] 所述粉碎的多枝柽柳与乙醇或甲醇的用量比为1 Kg：6~20 L。
[0012] 一种上述的N-酰基神经鞘胺醇类化合物，其特征在于在制备抑制血管紧张素I转换酶活性药物中的应用。
[0013] 本发明是利用多枝柽柳的回流提取液，首次从多枝柽柳中分离纯化出一类新的N-酰基神经鞘胺醇化合物，用本发明提供的方法对该类N-酰基神经鞘胺醇化合物进行分离提纯，简单方便、容易操作。所提取的N-酰基神经鞘胺醇化合物来源于常见的天然药物，-1无毒副作用，在浓度为11.7~187 μmol·mL 具有较为明显的抑制血管紧张素I转换酶活性，可在制备辅助调节血压的功能食品及治疗高血压药物中应用。
附图说明
[0014] 图1是N-酰基神经鞘胺醇类化合物的质谱图。
具体实施方式
[0015] 实施例1 N-酰基神经鞘胺醇类化合物的提取分离
[0016] a. 取3.1 kg多枝柽柳（Tamarix.ramosissima Ledeb.）地上部分以粉碎机粉碎，采用24.8L体积分数为100%的乙醇浸泡后加热回流提取，每次提取时间2h，提取次数2次，合并提取液，减压回收提取液至醇浓度低于5 %，所含生药浓度为50~100g/ml；
[0017] b. 将所得的提取液经石油醚萃取3次，萃取溶剂与提取液的体积比为2：1，合并萃取液，回收溶剂得萃取物；
[0018] c. 将得到的萃取物30g经硅胶柱色谱法分离，以石油醚、乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，收集石油醚与乙酸乙酯体积比为100：0~2的洗脱馏份，室温下挥发溶剂，析出白色粉末。
[0019] TLC检测洗脱液中的成分，化学成分相同的合并得到N-酰基神经鞘胺醇类化合物10 mg（式1）。
[0020] 实施例2：
[0021] a. 取4 kg多枝柽柳（Tamarix.ramosissima Ledeb.）地上部分以粉碎机粉碎，采用24体积分数为80%的甲醇浸泡后加热回流提取，每次提取时间2h，提取次数2次，合并提取液，减压回收提取液至醇浓度低于5 %，所含生药浓度为50~100g/ml；
[0022] b. 将所得的提取液经正己烷萃取2次，萃取溶剂与提取液的体积比为1：2，合并萃取液，回收溶剂得萃取物；
[0023] c. 将得到的萃取物30g经硅胶柱色谱法分离，以石油醚、乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，收集石油醚与乙酸乙酯体积比为100：0~2的洗脱馏份，室温下挥发溶剂，析出白色粉末。
[0024] TLC检测洗脱液中的成分，化学成分相同的合并得到N-酰基神经鞘胺醇类化合物。
[0025] 实施例3：
[0026] a. 取1 kg多枝柽柳（Tamarix.ramosissima Ledeb.）地上部分以粉碎机粉碎，采用20L体积分数为50%的甲醇浸泡后加热回流提取，每次提取时间3h，提取次数3次，合并提取液，减压回收提取液至醇浓度低于5 %，所含生药浓度为50~100g/ml；
[0027] b. 将所得的提取液经正己烷萃取4次，萃取溶剂与提取液的体积比为1：1，合并萃取液，回收溶剂得萃取物；
[0028] c. 将得到的萃取物30g经硅胶柱色谱法分离，以石油醚、乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，收集石油醚与乙酸乙酯体积比为100：0~2的洗脱馏份，室温下挥发溶剂，析出白色粉末。
[0029] TLC检测洗脱液中的成分，化学成分相同的合并得到N-酰基神经鞘胺醇类化合物。
[0030] N-酰基神经鞘胺醇类化合物的结构鉴定：
[0031] 实施例1~3得到的白色粉末， EI-MS：给出分子量为535。根据质谱（图1）断裂方式，分子量从535依次减少了28，26，28，18，28，15，27，27，27，16，等，依次断裂的基团为1 13
C=O，C-N，C=O，H2O，C=O，CH3，CH2-CH，CH2-CH，CH2-CH，CH4，等。结合 H NMR谱（DMSO-d6）和 C NMR谱，δ1.15-1.34有强质子信号及δ0.81（3H，q），推测有两个脂肪烷基链；δ7.24（1H，s，NH）和δ174.17（CONH）及δ5.31（1H，m），δ39.60（CH-NH）及连氧碳信号δ77.65，
77.43，76.81，77.23，61.42显示结构中酰胺键和多羟基的存在，以上数据表明该成分为神经酰胺类化合物。
C=O，C-N，C=O，H2O，C=O，CH3，CH2-CH，CH2-CH，CH2-CH，CH4，等。结合 H NMR谱（DMSO-d6）和 C NMR谱，δ1.15-1.34有强质子信号及δ0.81（3H，q），推测有两个脂肪烷基链；δ7.24（1H，s，NH）和δ174.17（CONH）及δ5.31（1H，m），δ39.60（CH-NH）及连氧碳信号δ77.65，
77.43，76.81，77.23，61.42显示结构中酰胺键和多羟基的存在，以上数据表明该成分为神经酰胺类化合物。
[0032] 结构式中带有n，且n是大于0小于4的整数。
[0033] N-酰基神经鞘胺醇类化合物的抑制血管紧张素I转换酶活性：
[0034] 具体的活性测试过程如下：用含有608 mmol·L-1 NaCl的0.2 mol·L-1硼酸盐缓-1冲液，将Hip-His-Leu配成7.6 mmol·L 的溶液；取5μl N-酰基神经鞘胺醇类化合物，置于0.5 mL离心管中，加入ACE 15 μl，37 ℃下反应5 min后，加入25μl Hip-His-Leu溶液，混合37 ℃下反应30 min；用5 μl10 %三氟乙酸终止反应，得到反应液。同时做空白实验，除加等量蒸馏水代替样品外，其它操作相同。该反应液直接在HPLC体系进样分析。
由ACE作用底物得到的马尿酸通过HPLC来定量。流动相：30 %甲醇-1 ml三氟乙酸-0.5 ml冰乙酸（调pH 3.0~3.3），70 %甲醇-1 ml三氟乙酸-0.5 ml冰乙酸（调pH 3.0~3.3）进行梯度洗脱；检测波长：228 nm。
由ACE作用底物得到的马尿酸通过HPLC来定量。流动相：30 %甲醇-1 ml三氟乙酸-0.5 ml冰乙酸（调pH 3.0~3.3），70 %甲醇-1 ml三氟乙酸-0.5 ml冰乙酸（调pH 3.0~3.3）进行梯度洗脱；检测波长：228 nm。
[0035] 抑制率(%)=（A-B）/A×100(%)
[0036] 式中，A为不含抑制剂的马尿酸液相峰面积，B为含抑制剂的马尿酸液相峰面积。
[0037] 通过上述方法分别对浓度为11.7、23.4、46.8、93.6、187μmol·mL-1的N-酰基神经鞘胺醇类化合物的抑制血管紧张素I转换酶活性进行测定，抑制率分别为13 %，57 %，74 %，63%和54%。结果表明该类化合物对血管紧张素I转换酶活性具有较为明显的抑制活性。
[0038] 本发明实施例1~3制备获得的提取物可以作为治疗和预防高血压及其相关心血管疾病药物的各种制剂、抑制血压升高的功能食品以及作为降低血压的食品添加剂等。药品和保健品是与辅料混合形成各种形式的丸剂、散剂、片剂、膏剂，粉剂，针剂、水剂，颗粒剂、胶囊、注射剂等；保健食品形态可以是液体的比如像清凉饮料，碳酸饮料，调味品；作为添加剂可加入到面食类，果冻，冰淇淋，腌制品，火腿，点心中。