一种柳穿鱼黄素单体的制备方法

摘要

本发明公开了一种柳穿鱼黄素单体的制备方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。本发明的具体工艺步骤包括以甲醇或乙醇提取总黄酮，加入浓酸硫水解黄酮苷，水解液通过大孔吸附树脂富集黄酮，解吸液通过制备型高效液相色谱分离柳穿鱼黄素单体，于50-80℃减压浓缩制备液，静置析晶，过滤，干燥，得到柳穿鱼黄素单体产品。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现高纯度柳穿鱼黄素单体的工业化分离制备，得到纯度大于99%的柳穿鱼黄素单体。

权利要求

1.一种柳穿鱼黄素单体的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：A 提取总黄酮

取大蓟药材，粉碎成1-4mm的粗粉置于提取容器中，按药材质量：溶液体积1Kg: (6-10)L加入体积分数均为70-90%的甲醇或乙醇，加热回流提取3-5次，每次提取时间为

1-3小时，过滤，滤液合并，并于60-90℃浓缩成相对密度为1.0-1.1的浸膏；

B 水解黄酮苷

将步骤A所得浓缩后的浸膏置于耐酸容器中，加入占浸膏体积1-3%的浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解1.5-3.5小时，水解液放冷至室温；

C 大孔吸附树脂富集黄酮

将步骤B所得水解液通过准备好的大孔吸附树脂柱，然后用2-5倍量柱体积的自来水进行冲洗，再用1-3倍量柱体积的体积分数70-90%的乙醇进行解吸附，解吸液于60-90℃浓缩至相对密度1.02-1.05，浓缩液经孔隙为0.45微米的有机滤膜过滤，收集滤液；

D 制备型高效液相色谱分离

取步骤C所得的滤液进样，进行柳穿鱼黄素单体的制备分离，紫外检测器在线监测针对性收集柳穿鱼黄素的制备流分溶液，得柳穿鱼黄素单体溶液；

E浓缩干燥产品

将步骤D所得柳穿鱼黄素单体溶液，于50-80℃减压浓缩至黄色固形物开始析出，静置析晶，过滤，再将固体物于80-105℃干燥至恒重，收集干品，即得柳穿鱼黄素单体产品；

步骤C所述大孔吸附树脂选自AB-8型、D101型或D104型；

步骤D所述制备型高效液相色谱采用填料为C18的色谱柱、流动相组成为：体积分数

65-85%的甲醇水溶液；

步骤D所述紫外检测器的检测波长为330nm。

2.如权利要求1所述柳穿鱼黄素单体的制备方法，其特征在于步骤D所述高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法或气-质联用、核磁共振碳谱、氢谱方法确定高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形。

3.如权利要求1或2所述柳穿鱼黄素单体的制备方法，其特征在于所述液-质联用方法，采用填料为C18的色谱柱，流动相组成为：体积分数65-85%的甲醇水溶液，柱温为室温，检测波长为330nm，根据质谱正离子检测结果，确定柳穿鱼黄素单体在液相色谱中所对应的峰形及归属。

说明书

一种柳穿鱼黄素单体的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物化合物单体的制备方法，具体涉及从大蓟药材中提取分离柳穿鱼黄素单体的方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。

[0002] 背景技术

[0003] 柳穿鱼黄素主要来源于中药材大蓟，即菊科蓟属植物蓟Cirsium japonicum Fisch. ex DC.的干燥地上部分。大蓟因含多种黄酮及其苷类成分，具有明显的凉血止血、散瘀解毒作用。其中，含量最高的黄酮成分为柳穿鱼叶苷及其苷元柳穿鱼黄素，《中华人民共和国药典》2010年版收载柳穿鱼黄素为大蓟炭的鉴别指标成分。

[0004] 柳穿鱼黄素具有如下结构式

[0005]

[0006] 目前主要采用柱层析及结晶等常规手段进行柳穿鱼黄素单体的分离纯化，效率低，产量少，产品纯度低，工艺不稳定，成本较高。

[0007] 如中国专利CN201110127629.9提供了大蓟炭总黄酮液的提取方法，取大蓟生品，切成段长为1.5-2cm的大蓟饮片，置于恒温炒药机中，表盘温度定为580℃，炒11-13分钟后出锅，喷水灭尽火星，放凉，晾干；取炮制好的大蓟炭，用8-10倍量的石油醚提取6小时，得到药渣用10倍量的70%乙醇提取4-6个小时，得到乙醇提取液后，回收乙醇，水分散溶解得到药液，再用等量的石油醚萃取，得到水溶液，最后上大孔树脂用80%乙醇溶液洗脱，Hcl-Mg检测，得到含有柳穿鱼黄素即5,7-二羟基-6,4’-二甲氧基黄酮的大蓟炭总黄酮提取液。该方法过程繁琐，多次用到石油醚。因石油醚易燃易爆，因而生产过程十分危险。同时，由该工艺方法只能提取得到大蓟炭总黄酮，而从总黄酮到柳穿鱼黄素单体，还需要经历植提行业最关键的分离纯化过程，该过程的技术难度最高。

发明内容

[0008] 本发明旨在克服现有技术的缺陷，提供一种从大蓟药材中快速分离制备柳穿鱼黄素单体的方法。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，产品纯度高，工艺稳定，成本低廉，可实现高纯度柳穿鱼黄素单体的工业化分离制备，得到的柳穿鱼黄素单体的纯度达到99%以上。

[0009] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0010] 一种柳穿鱼黄素单体的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

[0011] A 提取总黄酮

[0012] 取大蓟药材，粉碎成1-4mm的粗粉置于提取容器中，按药材质量：溶液体积1Kg: (6-10)L加入体积分数均为70-90%的甲醇或乙醇，加热回流提取3-5次，每次提取时间为1-3小时，过滤，滤液合并，并于60-90℃浓缩成相对密度为1.0-1.1的浸膏；

[0013] B 水解黄酮苷

[0014] 将步骤A所得浓缩后的浸膏置于耐酸容器中，加入占浸膏体积1-3%的浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解1.5-3.5小时，水解液放冷至室温；

[0015] C 大孔吸附树脂富集黄酮

[0016] 将步骤B所得水解液通过准备好的大孔吸附树脂柱，然后用2-5倍量柱体积的自来水进行冲洗，再用1-3倍量柱体积的体积分数70-90%的乙醇进行解吸附，解吸液于60-90℃浓缩至相对密度1.02-1.05，浓缩液经孔隙为0.45微米的有机滤膜过滤，收集滤液；

[0017] 所述大孔吸附树脂选自AB-8型、D101型或D104型。

[0018] D 制备型高效液相色谱分离

[0019] 取步骤C所得的滤液进样，进行柳穿鱼黄素单体的制备分离，紫外检测器在线监测针对性收集柳穿鱼黄素的制备流分溶液，得柳穿鱼黄素单体溶液；

[0020] 所述制备型高效液相色谱采用填料为C18的色谱柱、流动相组成为：体积分数65-85%的甲醇水溶液。

[0021] 所述紫外检测器检测波长为330nm。

[0022] 本发明在进行高效制备液相色谱分离前，可通过液-质联用或其它本技术领域常用的方法，如气-质联用、核磁共振碳谱、氢谱等确定高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形。

[0023] 以液-质联用（HPLC-MS）方法为例，可采用填料为C18的色谱柱，流动相组成为：体积分数65-85%的甲醇水溶液，柱温为室温，检测波长为330nm，取步骤C所得的澄清透明滤液适量进样，进行柳穿鱼黄素单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定柳穿鱼黄素单体在液相色谱中所对应的峰形及归属。由于制备型高效液相色谱分离柳穿鱼黄素单体也采用C18色谱柱，且流动相组成相同，因而可用于推断在制备型高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的出峰位置及峰形等。

[0024] E浓缩干燥产品

[0025] 将步骤D所得柳穿鱼黄素单体溶液，于50-80℃减压浓缩至黄色固形物开始析出，静置析晶，过滤，再将固体物于80-105℃干燥至恒重，收集干品，即得柳穿鱼黄素单体产品。

[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0027] 1、通过步骤A对所述大蓟药材的粉碎、加热回流提取、浓缩，确保了所得的总黄酮浸膏中主要含有柳穿鱼叶苷等成分。

[0028] 2、通过步骤B硫酸水解，充分将柳穿鱼叶苷转化为柳穿鱼黄素，确保了柳穿鱼黄素的含量。

[0029] 3、通过步骤C大孔吸附树脂富集黄酮，有效保证了水解液中的黄酮类成分最大限度的回收利用，提高了总黄酮组分的纯度。

[0030] 4、采用制备型高效液相色谱系统对柳穿鱼黄素单体进行分离，通过最适宜的前处理方法和色谱条件等，达到良好的分离效果，并且紫外检测器在线监测，针对性收集柳穿鱼黄素单体，目标明确，避免了常规柱层析和先分离后检测造成的资源浪费。

[0031] 5、采用制备型高效液相色谱分离过程直观，目标性强，对产品的质量易于控制，产品纯度可达到99%以上。

[0032] 6、操作简便，生产周期短，分离效率高，收率高，产量大，工艺稳定可靠，重现性好，成本低廉，适合工业化生产。

[0033] 7、由于高效液相色谱对样品溶液的纯度、色泽、酸碱度等要求均较高，通过提取水解等简单处理得到的提取液不能直接作为样品溶液进入高效液相色谱系统，因此若在进行高效液相色谱分离前，不按照本发明方法步骤进行提取、水解、大孔吸附树脂富集，则有可能达不到良好的分离效果，还可能对高效液相色谱系统的色谱柱等配件产生难以逆转的影响，缩短其使用周期；而色谱柱等液相色谱的相关配件成本通常较高，其使用周期的缩短显然将造成最终产品的生产成本大大提高；因而，对进入高效液相色谱的样品溶液要求较高，其前处理过程非常重要。

[0034] 8、由于大蓟药材中除含有黄酮类化合物外，还含有糖类、鞣质、色素、微量元素等非常复杂的成分，其中柳穿鱼黄素单体成分含量较低，大部分以柳穿鱼叶苷形式存在，要获得可直接进入高效液相色谱系统的样品，需要先进行提取及水解处理。针对大蓟药材中存在的各种成分的理化性质，本发明方法通过前述步骤A、B、C的顺序搭配，以及适当的参数组合，可有效提取出柳穿鱼叶苷等成分，并将柳穿鱼叶苷水解转化为柳穿鱼黄素，同时除去大量杂质，获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液（即步骤C得到的澄清滤液），不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约生产成本。

[0035] 9、在高效液相色谱分离过程中，色谱条件的选择非常重要，它对样品溶液中各物质的出峰顺序、峰形、分离效果等起着决定性的作用；色谱条件主要包括色谱柱（包括填料、柱长及内径等）、流动相（包括组成及流速等）、柱温、检测波长、检测器等，各色谱条件的选择及其组合至关重要。本发明通过大量的试验研究及对比分析，确定了如上所述的各色谱条件，使样品溶液中各物质的出峰时间、峰形、分离效果等最佳化，有利于柳穿鱼黄素单体得到充分有效的分离。

附图说明

[0036] 图1是本发明实施例1柳穿鱼黄素单体的高效液相制备色谱图，图中记录为3针样品连续进样色谱图，图中峰1、2、3为柳穿鱼黄素；

[0037] 图2是本发明实施例1柳穿鱼黄素单体产品复检的高效液相分析色谱图具体实施方式

[0038] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明仅限于下述实施例。

[0039] 下述各实施例中，终产品柳穿鱼黄素单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）法，色谱条件如下：

[0040] 流动相组成为：甲醇-水，二者体积比为85:15；流速1.0mL/min；

[0041] 色谱柱填料为C18，粒度为5µm，色谱柱内径为4.6mm，长度为150mm；

[0042] 检测波长为330nm。

[0043] 实施例1

[0044] 一种柳穿鱼黄素单体的快速制备方法，包括如下工艺步骤：

[0045] A 提取总黄酮

[0046] 取大蓟药材100kg，粉碎成1-4mm的粗粉，置于1m3提取罐中，加入体积分数为90%的甲醇600L，加热回流提取3次，每次提取时间为3小时，过滤，滤液合并，并于60℃浓缩成相对密度为1.1的浸膏约70L；

[0047] B 水解黄酮苷

[0048] 将步骤A所得浓缩后的浸膏70L置于搪瓷水解罐中，加入0.7L浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解3.5小时，水解液放冷至室温；

[0049] C 大孔吸附树脂富集黄酮

[0050] 将步骤B所得水解液通过准备好的AB-8型大孔吸附树脂柱，柱床体积约40L，然后用200L自来水进行冲洗，再用100L体积分数70%的乙醇进行解吸附，解吸液于90℃浓缩至相对密度1.05，浓缩液经孔隙为0.45微米的有机滤膜过滤，收集滤液；

[0051] D制备型高效液相色谱分离

[0052] （a）确定高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形及归属

[0053] 通过液-质联用（HPLC-MS），采用填料为C18的色谱柱（C18粒度为5µm，柱长为250mm，内径4.6mm），流动相组成为体积分数65%的甲醇水溶液，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为330nm，取步骤C所得滤液10µl进样，进行柳穿鱼黄素单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定柳穿鱼黄素单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t=16.38min的峰所对应的物质为柳穿鱼黄素单体；

[0054] （b）制备柳穿鱼黄素单体

[0055] 采用填料为C18的色谱柱（内径100mm，C18粒度为10µm），流动相组成为体积分数65%的甲醇水溶液，流速为180mL/min，检测波长为330nm，取步骤C所得的澄清滤液进样，进行柳穿鱼黄素单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤（a）确定的高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形等情况，针对性收集柳穿鱼黄素单体的制备流分溶液（出峰时间为
32-35min），得柳穿鱼黄素单体溶液；

[0056] E 浓缩干燥产品

[0057] 将步骤D所得柳穿鱼黄素单体溶液，于80℃减压浓缩至黄色固形物开始析出，静置析晶，过滤，再将固体物于105℃干燥至恒重，收集干品，得到柳穿鱼黄素单体产品352g。

[0058] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.23%。

[0059] 实施例2

[0060] 一种柳穿鱼黄素单体的快速制备方法，包括如下工艺步骤：

[0061] A提取总黄酮

[0062] 取大蓟药材300kg，粉碎成1-4mm的粗粉，置于3m3提取罐中，加入体积分数为70%的甲醇2400L，加热回流提取4次，每次提取时间为2小时，过滤，滤液合并，并于90℃浓缩成相对密度为1.05的浸膏约250L；

[0063] B水解黄酮苷

[0064] 将步骤A所得浓缩后的浸膏250L置于搪瓷水解罐中，加入5L浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解2.5小时，水解液放冷至室温；

[0065] C孔吸附树脂富集黄酮

[0066] 将步骤B所得水解液通过准备好的D104型大孔吸附树脂柱，柱床体积约100L，然后用400L自来水进行冲洗，再用200L体积分数90%的乙醇进行解吸附，解吸液于80℃浓缩至相对密度1.03，浓缩液经孔隙为0.45微米的有机滤膜过滤，收集滤液；

[0067] D制备型高效液相色谱分离

[0068] （a）确定高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形及归属

[0069] 通过液-质联用（HPLC-MS），采用填料为C18的色谱柱（C18粒度为5µm，柱长为250mm，内径4.6mm），流动相组成为体积分数75%的甲醇水溶液，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为330nm，取步骤C所得滤液10µl进样，进行柳穿鱼黄素单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定柳穿鱼黄素单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t=12.38min的峰所对应的物质为柳穿鱼黄素单体；

[0070] （b）制备柳穿鱼黄素单体

[0071] 采用填料为C18的色谱柱（内径200mm，C18粒度为10µm），流动相组成为体积分数75%的甲醇水溶液，流速为500mL/min，检测波长为330nm，取步骤C所得的澄清滤液进样，进行柳穿鱼黄素单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤（a）确定的高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形等情况，针对性收集柳穿鱼黄素单体的制备流分溶液（出峰时间为
28-34min），得柳穿鱼黄素单体溶液；

[0072] E浓缩干燥产品

[0073] 将步骤D所得柳穿鱼黄素单体溶液，于90℃减压浓缩至黄色固形物开始析出，静置析晶，过滤，再将固体物于95℃干燥至恒重，收集干品，得到柳穿鱼黄素单体产品1030g。

[0074] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.35%。

[0075] 实施例3

[0076] 一种柳穿鱼黄素单体的快速制备方法，包括如下工艺步骤：

[0077] A 提取总黄酮

[0078] 取大蓟药材50kg，粉碎成1-4mm的粗粉，置于1m3提取罐中，加入体积分数为80%的甲醇400L，加热回流提取5次，每次提取时间为1.5小时，过滤，滤液合并，并于70℃浓缩成相对密度为1.0的浸膏约40L；

[0079] B水解黄酮苷

[0080] 将步骤A所得浓缩后的浸膏40L置于搪瓷水解罐中，加入1.2L浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解1.5小时，水解液放冷至室温；

[0081] C大孔吸附树脂富集黄酮

[0082] 将步骤B所得水解液通过准备好的D101型大孔吸附树脂柱，柱床体积约25L，然后用100L自来水进行冲洗，再用75L体积分数80%的乙醇进行解吸附，解吸液于80℃浓缩至相对密度1.02，浓缩液经孔隙为0.45微米的有机滤膜过滤，收集滤液；

[0083] D制备型高效液相色谱分离

[0084] （a）确定高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形及归属

[0085] 通过液-质联用（HPLC-MS），采用填料为C18的色谱柱（C18粒度为5µm，柱长为250mm，内径4.6mm），流动相组成为体积分数85%的甲醇水溶液，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为330nm，取步骤C所得滤液10µl进样，进行柳穿鱼黄素单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定柳穿鱼黄素单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t=8.43min的峰所对应的物质为柳穿鱼黄素单体；

[0086] （b）、制备柳穿鱼黄素单体：

[0087] 采用填料为C18的色谱柱（内径80mm，C18粒度为10µm），流动相组成为体积分数85%的甲醇水溶液，流速为140mL/min，检测波长为330nm，取步骤C所得的澄清滤液进样，进行柳穿鱼黄素单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤（a）确定的高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形等情况，针对性收集柳穿鱼黄素单体的制备流分溶液（出峰时间为23-25min），得柳穿鱼黄素单体溶液；

[0088] E、浓缩干燥产品：

[0089] 将步骤D所得柳穿鱼黄素单体溶液，于60℃减压浓缩至黄色固形物开始析出，静置析晶，过滤，再将固体物于80℃干燥至恒重，收集干品，得到柳穿鱼黄素单体产品178g。

[0090] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.32%。

[0091] 实施例4

[0092] 一种柳穿鱼黄素单体的快速制备方法，包括如下工艺步骤：

[0093] A 提取总黄酮

[0094] 取大蓟药材10kg，粉碎成1-4mm的粗粉，置于100L提取罐中，加入体积分数为75%的乙醇75L，加热回流提取3次，每次提取时间为2小时，过滤，滤液合并，并于60℃浓缩成相对密度为1.05的浸膏约4L；

[0095] B水解黄酮苷

[0096] 将步骤A所得浓缩后的浸膏4L置于10L玻璃三口瓶中，加入0.2L浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解2小时，水解液放冷至室温；

[0097] C大孔吸附树脂富集黄酮

[0098] 将步骤B所得水解液通过准备好的AB-8型大孔吸附树脂柱，柱床体积约1L，然后用5L自来水进行冲洗，再用1L体积分数80%的乙醇进行解吸附，解吸液于60℃浓缩至相对密度1.03，浓缩液经孔隙为0.45微米的有机滤膜过滤，收集滤液；

[0099] D制备型高效液相色谱分离

[0100] （a）确定高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形及归属

[0101] 通过液-质联用（HPLC-MS），采用填料为C18的色谱柱（C18粒度为5µm，柱长为250mm，内径4.6mm），流动相组成为体积分数80%的甲醇水溶液，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为330nm，取步骤C所得滤液10µl进样，进行柳穿鱼黄素单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定柳穿鱼黄素单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t=10.25min的峰所对应的物质为柳穿鱼黄素单体；

[0102] （b）、制备柳穿鱼黄素单体：

[0103] 采用填料为C18的色谱柱（内径50mm，C18粒度为10µm），流动相组成为体积分数80%的甲醇水溶液，流速为80mL/min，检测波长为330nm，取步骤C所得的澄清滤液进样，进行柳穿鱼黄素单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤（a）确定的高效液相色谱中柳穿鱼黄素单体的峰形等情况，针对性收集柳穿鱼黄素单体的制备流分溶液（出峰时间为
23-25min），得柳穿鱼黄素单体溶液；

[0104] E、浓缩干燥产品：

[0105] 将步骤D所得柳穿鱼黄素单体溶液，于60℃减压浓缩至黄色固形物开始析出，静置析晶，过滤，再将固体物于80℃干燥至恒重，收集干品，得到柳穿鱼黄素单体产品36g。

[0106] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.45%。