阳离子对称两亲性自组装多肽及其应用

摘要

本发明公开了阳离子对称两亲性自组装多肽及其应用，其氨基酸序列的通式如下：Ac-X1-Leu-Ile-X2-X3-Val-X3-X2-Ile-Leu-X1-NH2，其中X1、X2、X3为极性带正电荷的氨基酸，且正电荷以Val为中心点两边对称，序列中的氨基酸全为L型氨基酸。本发明阳离子对称的两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，可用于研制新型纳米抗菌药物。此外，本发明所述的阳离子对称两亲性自组装多肽可作为分子传感器用于检测微环境的变化。

权利要求

1.一类阳离子对称的两亲性自组装多肽，其特征在于，其氨基酸序列为Ac-RLIRKVKRILR-NH2。

2.权利要求1中所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物中的应用。

3.权利要求1中所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用。

说明书

阳离子对称两亲性自组装多肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于自组装多肽领域，具体涉及一类阳离子对称两亲性自组装多肽及其作为抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物及检测微环境变化的分子传感器的应用。

背景技术

[0002] 肽分子自组装技术是近年来的研究热点，通过分子设计和固相合成等手段可以得到成千上万种结构相异的肽分子，肽分子自组装后形成的纳米尺寸材料具有广泛的潜在用途。国内外已有多肽材料应用于纳米生物医学领域的报道，包括用于3D细胞培养、组织修复、药物运输以及止血等，但目前现有技术公开的能自组装形成纳米尺寸材料用于上述领*域的多肽在结构上多具有全程或半程电荷匹配的特点（唐丽丽，何道航 ．广东化工，2011，
38(1)：76-79.）。对于阳离子多肽，作为具有抗菌作用的多肽有望克服临床上日益严重的细菌耐药性，国内外报道多用于构建抗菌剂。本发明设计出了一类阳离子对称两亲性自组装多肽，它们的一级结构与上述多肽不同，具有阳离子对称性，具有抗菌作用，还可以应用于检测微环境变化。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一类能够自组装的阳离子对称两亲性多肽。

[0004] 本发明第二目的在于提供阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物中的应用。

[0005] 本发明第三目的在于提供阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用。

[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：

[0007] 一类阳离子对称的两亲性自组装多肽，其氨基酸序列的通式如下:

[0008] Ac-X1-Leu-Ile-X2-X3-Val-X3-X2-Ile-Leu-X1-NH2，其中Ac表示N端乙酰化，NH2表示C端氨基化，X1、X2、X3为极性带正电荷的氨基酸，且正电荷以Val为中心点两边对称，序列中的氨基酸全为L型氨基酸。X1、X2、X3为相同或不同氨基酸均可。

[0009] 所述极性带正电荷的氨基酸为Arg、Lys或His。

[0010] 所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽氨基酸序列优选为Ac-RLIRKVKRILR-NH2、Ac-KLIRKVKRILK-NH2、Ac-KLIKKVKKILK-NH2、Ac-HLIKKVKKILH-NH2、Ac-HLIHKVKHILH-NH2、Ac-HLIHRVRHILH-NH2、Ac-HLIRRVRRILH-NH2、Ac-KLIRRVRRILK-NH2、Ac-KLIKRVRKILK-NH2或Ac-RLIRRVRRILR-NH2。

[0011] 所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物中的应用。

[0012] 所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用。

[0013] 相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

[0014] （1）本发明多肽自组装是其分子间通过非共价键相互作用自发组合形成一种结构明确、构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构。

[0015] （2）实验表明，本发明所述阳离子对称的两亲性自组装多肽在不同的环境条件下会发生不同的结构变化，因此，此种多肽可以在制备检测微环境变化的分子传感器中应用。不同的环境条件主要指为不同肽浓度、温度、NaCl浓度、Na2SO4浓度、SDS浓度及TFE体积分数的溶液。

[0016] （3）实验表明，本发明所述阳离子对称的两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，因此，可以用于研制适于临床上使用的新型纳米抗菌药物。

[0017] （4）本发明提供了一类新型结构的自组装多肽，增加了自组装多肽的类型。

[0018] （5）本发明提供了一类新型的分子传感器、一类新型的抗菌药物，有利于感染疾病的预防和治疗。

附图说明

[0019] 图1是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的三维分子结构示意图。

[0020] 图2是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的高效液相（HPLC）色谱图，结果显示它的纯度是97.4％。

[0021] 图3是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的质谱（MS）图，结果显示它的分子量为1491.9。

[0022] 图4是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽在超纯水溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5的浓度是0.4mg/ml。

[0023] 图5是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽在0.1M NaCl溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5的浓度是0.4mg/ml。

[0024] 图6是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明肽浓度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。

[0025] 图7是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明温度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。

[0026] 图8是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同NaCl浓度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。

[0027] 图9是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同Na2SO4浓度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。

[0028] 图10是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同十二烷基硫酸钠（SDS）浓度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。

[0029] 图11是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同三氟乙醇（TFE）体积分数对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。

[0030] 图12是本发明所述不同浓度的阳离子对称两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小示意图，图中，1、2处的阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5的浓度分别为0.1mg/ml、1mg/ml，3处是空白对照水溶液。

具体实施方式

[0031] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

[0032] 实施例1

[0033] 当X1为Arg，X2为Arg，X3为Lys时，自组装多肽①序列如下：

[0034] CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2

[0035] 自组装多肽①的合成：

[0036] 1、材料

[0037] Fmoc-Arg(pbf)-OH(N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸)、Fmoc-Leu-OH（N-芴甲氧羰酰基-亮氨酸）、Fmoc-Ile-OH（N-芴甲氧羰酰基-异亮氨酸）、Fmoc-Lys(Boc)-OH(N-芴甲氧羰酰基-N′-叔丁氧羰酰基-赖氨酸)、Fmoc-Val-OH（N-芴甲氧羰酰基-缬氨酸）、Rink Amide-MBHA Resin（树脂）、HBTU（O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂）和HOBT（1-羟基苯并三氮唑）购自杭州中肽生化有限公司；哌啶、醋酸酐、DMF（N、N-二甲基甲酰胺）、TFA（三氟乙酸）、NMM（N-甲基吗啉）、乙醚、甲醇、DCM（二氯甲烷）购自天津市富宇精细化工有限公司。

[0038] 2、制备方法

[0039] 采用Fmoc（芴甲氧羰酰基）保护的固相合成法，其工艺步骤如下：

[0040] （1）称取20g 0.5mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin于肽合成器皿中，取200mlDMF溶涨树脂30min，然后抽滤，再取用300mlDMF洗涤树脂，分三次进行，每次的洗涤时间为2min，抽滤干洗涤液后向肽合成器中加入100ml20％哌啶/DMF（V∶V）震荡反应30min，反应结束后，再抽滤出反应液，再用400mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕后取少量树脂做茚三酮检测试验，树脂呈阳性，向肽合成器皿中加入以下原料：

[0041]

[0042] 上述原料加完后，震荡反应30min，反应结束后，用300mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮试验检测，树脂呈阴性。

[0043] （2）向肽合成器皿中加入5ml 20％哌啶/DMF（V∶V）震荡反应30min，反应结束后抽滤出反应液，再用40ml DMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮试验检测，结果树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：

[0044] （a）Fmoc-Leu-OH 14.14g

[0045] （b）HBTU 15.16g

[0046] （c）HOBT 5.40g

[0047] （d）NMM 4.39ml

[0048] （e）DMF 160ml

[0049] 上述原料加完后，震荡反应40min，反应结束后，用40mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间为2min，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

[0050] （3）变换步骤（2）中的（a）原料，（b）（c）（d）（e）原料及加入量不变，重复步骤（2）的操作；（a）原料依次替换为Fmoc-Ile-OH（14.14g）、Fmoc-Arg（pbf）-OH（25.95g）、Fmoc-Lys(Boc)-OH（18.74g）、Fmoc-Val-OH（13.58g）、Fmoc-Lys(Boc)-OH（18.74g）、Fmoc-Arg（pbf）-OH（25.95g）、Fmoc-Ile-OH（14.14g）、Fmoc-Leu-OH（14.14g）、Fmoc-Arg（pbf）-OH（25.95g）。即每重复一次步骤（2）的操作，变换一种（a）原料，直至将上述原料都使用一次为止；

[0051] （4）再重复一次（1）（2）（3）步骤的操作，各步骤的原料及所用原料的量均不变；最后一个Arg合成结束后，脱出Fmoc-保护基，加入20％哌啶/DMF（V∶V）反应30min，洗净树脂，加入160ml 50％醋酸酐/DMF（V∶V）反应30min，用40ml DMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂8次，除去DMF。氮气吹干后，用TFA（三氟乙酸）/DCM强酸裂解液，裂解3小时，将合成多肽从树脂上裂解下来，同时脱去所有保护基团，收集溶有合成肽的裂解液，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在滤液中的多肽，再抽滤得到白色固体，即得合成肽的粗品。合成肽粗品经HPLC（高效液相色谱）纯化，收集主峰，经过冷冻干燥后，即得到目标合成肽。

[0052] 3、本发明所述其他的阳离子对称两亲性自组装多肽可以通过替换上述1中的氨基酸，按照上述2所述制备方法合成纯化得到。在此过程中不同的合成实验参数如下表1所示：

[0053] 表1本发明所述部分阳离子对称两亲性自组装多肽的不同合成实验参数[0054]

[0055] 实施例2：自组装多肽①CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制

[0056] 将实施例1制备的自组装多肽①采用高效液相色谱（HPLC）检测，检测结果见图2，根据图2中的结果确定其纯度达到97.4％。

[0057] 将实施例1制备的自组装多肽①采用质谱（MS）检测，检测结果见图3，结果显示其分子量为1491.9。

[0058] 对实施例1制备的自组装多肽①经分子模拟即基于能量最低原则绘制三维分子模型示意图，所绘制的示意图如图1所示，图中可见，多肽N端乙酰化，C端氨基化，序列中氨基酸残基及正电荷以Val为中心点两边对称。通过该图可知其氨基酸侧链的空间分布。

[0059] 本发明所述部分阳离子对称两亲性自组装多肽的高效液相色谱和质谱检测数据见表2：

[0060] 表2本发明所述部分阳离子对称两亲性自组装多肽的纯度和分子量

[0061]

[0062] 实施例3：原子力显微镜（AFM）检测自组装多肽①的纳米结构

[0063] 1、原子力显微镜（AFM）检测自组装多肽①在超纯水溶液中形成的纳米结构取储存于4℃的自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至0.4mg/ml，进行AFM检测。

[0064] （1）取10μl样品溶液均匀置于新揭云母片上；

[0065] （2）每个样品在云母片表面停留约30～60s以便吸附；

[0066] （3）使用100μl Milli-Q超纯水冲洗云母片表面以除去未吸附样品；

[0067] （4）置于有盖培养皿中空气干燥，同时避免污染，放置过夜；

[0068] （5）在室温下，使用Nanoscope Illa(Digital Instruments，USA)在轻敲模式下扫描云母表面观察样品的纳米形貌。

[0069] AFM的形态图见图4，表明本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽①在超纯水溶液中可以形成球形聚集体。

[0070] 2、原子力显微镜（AFM）检测自组装多肽①在盐溶液中自组装形成的纳米结构[0071] 实验操作如上述1，只是在测试溶液中加入一定量的NaCl，使得最终的溶液中NaCl浓度为0.1M，多肽的浓度为0.4mg/ml。

[0072] AFM的形态图见图5，表明本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽①在0.1M NaCl溶液中可以自组装形成球形纳米粒。

[0073] 实施例4：自组装多肽①在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用[0074] 通过圆二色性（CD）检测发现，本发明所述阳离子对称的两亲性自组装多肽的结构对溶液环境的变化比较敏感，在不同的环境条件下会发生不同的结构变化，因此可用于制备检测微环境变化的分子传感器。不同溶液环境下的CD检测步骤及其结果如下：

[0075] 1、利用CD检测自组装多肽①在不同肽浓度溶液中的结构变化

[0076] 采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的自组装多肽①CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2进行CD检测，步骤如下：

[0077] (1)取储存于4℃的自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至不同的浓度，浓度范围0.01～1.0mg/ml；

[0078] (2)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(1)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

[0079] (3)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

[0080] 测定结果如图6所示，表明随着肽浓度的升高，自组装多肽①逐渐呈现出β-折叠的变化倾向。

[0081] 2、利用CD检测自组装多肽①在不同温度下的结构变化

[0082] 采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的自组装多肽①CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2进行CD检测，步骤如下：

[0083] (1)取储存于4℃的自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至0.4mg/ml；

[0084] (2)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(1)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

[0085] (3)CD扫描的数据采集范围是190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，以2℃/min的速率升温，在25～95℃温度范围内进行扫描，每10℃扫描一次，在每一温度下允许30s的平衡时间，误差0.1℃。升温之后，冷却降回25℃再次测试。

[0086] 测定结果如图7所示，表明随着温度的升高，自组装多肽①逐渐变得更加有序。

[0087] 3、利用CD检测自组装多肽①在不同NaCl浓度溶液中的结构变化

[0088] 采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的自组装多肽①CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2进行CD检测，步骤如下：

[0089] (1)取储存于4℃的自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液；

[0090] (2)先用容量瓶配制成0.5mol/l的NaCl溶液，再加Milli-Q超纯水(18.2MΩ)进行稀释，与多肽样品溶液混合，配成如下的浓度：0.01mol/l，0.02mol/l，0.05mol/l，0.1mol/l，0.2mol/l和0.3mol/l，不同NaCl浓度的溶液中多肽样品的浓度均为0.4mg/ml；

[0091] (3)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(2)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

[0092] (4)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

[0093] 测定结果如图8所示，表明不同浓度的NaCl(如0.01mol/l，0.02mol/l，0.05mol/l，0.1mol/l，0.2mol/l和0.3mol/l)对本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽①的构象变化的影响不明显，也就是说，在NaCl的作用下自组装多肽①的二级结构相对稳定。

[0094] 4、利用CD检测自组装多肽①在不同Na2SO4浓度溶液中的结构变化

[0095] 采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的自组装多肽①CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2进行CD检测，步骤如下：

[0096] (1)取储存于4℃的自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液；

[0097] (2)先用容量瓶配制成0.5mol/l的Na2SO4溶液，再加Milli-Q超纯水(18.2MΩ)进行稀释，与多肽样品溶液混合，配成如下的浓度：0.01mol/l，0.02mol/l，0.05mol/l，0.1mol/l，0.2mol/l和0.3mol/l，不同Na2SO4浓度的溶液中多肽样品的浓度均为0.4mg/ml；

[0098] (3)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(2)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

[0099] (4)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

[0100] 测定结果如图9所示，表明不同浓度的Na2SO4(如0.01mol/l，0.02mol/l，0.05mol/l，0.1mol/l，0.2mol/l和0.3mol/l)对阳离子对称两亲性自组装多肽①的构象变化的影响不明显，也就是说，在Na2SO4的作用下自组装多肽①的二级结构相对稳定。

[0101] 5、利用CD检测自组装多肽①在不同十二烷基硫酸钠（SDS）浓度溶液中的结构变化

[0102] 采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的自组装多肽①CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2进行CD检测，步骤如下：

[0103] (1)取储存于4℃的自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液；

[0104] (2)先用容量瓶配制成0.3mol/l的SDS溶液，再加Milli-Q超纯水(18.2MΩ)进行稀释，与多肽样品溶液混合，配成如下的浓度：1mmol/l，2mmol/l，4mmol/l，8mmol/l，10mmol/l，30mmol/l，60mmol/l和180mmol/l，不同SDS浓度的溶液中多肽样品的浓度均为
0.4mg/ml；

[0105] (3)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(2)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

[0106] (4)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

[0107] 测定结果如图10所示，表明在1mmol/l的SDS溶液当中，所述阳离子对称两亲性自组装多肽①主要以无规卷曲的形式存在，随着SDS浓度升高，自组装多肽①出现无规卷曲到a-螺旋的结构变化，且在不同高浓度的SDS溶液中，自组装多肽①的a-螺旋二级结构谱线形状也有所区别，说明本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽①的构象变化对SDS很敏感，同时可以抵抗SDS对蛋白的变性作用。

[0108] 6、利用CD检测自组装多肽①在不同三氟乙醇（TFE）浓度溶液中的结构变化[0109] 采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的自组装多肽①CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2进行CD检测，步骤如下：

[0110] (1)取储存于4℃的自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液；

[0111] (2)吸取不同体积的TFE溶液，再加Milli-Q超纯水(18.2MΩ)进行稀释，与多肽样品溶液混合，配成如下不同的体积分数：10％、20％、30％、40％、50％和60％，不同TFE体积分数的溶液中多肽样品的浓度均为0.4mg/ml；

[0112] (3)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(2)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

[0113] (4)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

[0114] 测定结果如图11所示，表明在10％的TFE溶液当中，所述阳离子对称两亲性自组装多肽①主要以无规卷曲的形式存在，随着TFE体积分数的升高，自组装多肽①出现无规卷曲到a-螺旋的结构变化，说明本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽①的构象变化对TFE敏感。

[0115] 上述所有测定结果提示，所述阳离子对称两亲性自组装多肽①在盐溶液中具有一定的稳定性，不会发生盐析，同时对其他的溶液环境变化比较敏感，可以根据不同的溶液环境发生不同的结构变化，因此，此种多肽可望在制备检测微环境变化的分子传感器中应用。

[0116] 实施例5：阳离子对称两亲性自组装多肽在制备新型纳米抗菌药物中的应用[0117] 1、自组装多肽①CH3CO-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2在制备新型纳米抗菌药物中的应用

[0118] （1）试验菌株

[0119] 金黄色葡萄球菌CMCC26003（广东微生物种质资源库）。

[0120] （2）试验方法

[0121] 采用牛津杯法测定本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽对受试菌的抑菌圈，根据抑菌圈大小判断其抑菌活性强弱。抑菌圈直径≥12mm表明样品有抗菌活性。

[0122] 本试验中所用的自组装多肽①溶液使用无菌Milli-Q超纯水(18.2MΩ)新鲜配制，浓度分别为0.1mg/ml、lmg/ml，备用。

[0123] 本试验中所用的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，受试菌液终浓度约为106CFU/ml，备用。

[0124] （3）测定受试菌的抑菌圈

[0125] 将约15ml的牛肉膏蛋白胨培养基倾倒入直径为9cm的灭菌培养皿内，待冷却后，用移液枪吸取0.1ml上述步骤（2）中制备的受试菌液，加入培养皿中，用涂布棒轻轻均匀地涂抹于各琼脂平皿表面。待菌液干后，在琼脂平皿表面放上直径为6mm(内径)的不锈钢牛津小杯并做好标记。用移液枪吸取200μl上述配制好的受试样品溶液，分别滴加入牛津杯中，每个浓度作三个平行样，以无菌Milli-Q超纯水作为空白对照。

[0126] 样品加完后，将各琼脂平皿盖好，置于37℃孵育24小时，观察不同浓度的各受试药液周围有无抑菌圈，将每个抑菌圈按三个不同方向测量其直径，三次测量的平均值即为该抑菌圈直径的大小。各药物的三组数据统计完后，取其抑菌圈大小的平均值作为该浓度下受试药液的抑菌能力大小判断数值。按药物敏感实验判定标准和受试样品自组装多肽①的抑菌圈大小判断其抑菌活性强弱。

[0127] （4）判断标准

[0128] 待测样品周围出现清晰抑菌圈，抑菌圈直径≥12mm为敏感，表明样品有抗菌活性。

[0129] 药物敏感实验判定标准见表3。

[0130] 表3药物敏感实验判定标准

[0131]

[0132] （5）对金黄色葡萄球菌的测试结果

[0133] 图12是不同浓度的阳离子对称两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小示意图，图中，1、2处的阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5的浓度分别为0.1mg/ml、lmg/ml，3处是空白对照水溶液。如图12所示，根据抑菌圈大小可知，不同浓度的自组装多肽①对金黄色葡萄球菌CMCC26003均具有很强的抗菌活性。自组装多肽①浓度为0.1mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为21mm；自组装多肽①浓度为1mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为25mm。结果表明，自组装多肽①对受试的金黄色葡萄球菌的抑菌作用很强。当自组装多肽①的浓度为O.Omg/ml，即以无菌Milli-Q超纯水作为空白对照测试时，受试的金黄色葡萄球菌未出现清晰的抑菌圈。

[0134] 2、自组装多肽②CH3CO-Lys-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Lys-NH2在制备新型纳米抗菌药物中的应用

[0135] 抑菌活性实验操作如上述1，将自组装多肽①换为自组装多肽②，测试其抑菌圈大小。

[0136] 根据抑菌圈大小可知，不同浓度的自组装多肽②对金黄色葡萄球菌CMCC26003均具有较强的抗菌活性。

[0137] 自组装多肽②浓度为0.1mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为20mm；自组装多肽②浓度为1mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为23mm。结果表明，自组装多肽②对受试的金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌作用。

[0138] 当自组装多肽②的浓度为0.0mg/ml即以无菌Milli-Q超纯水作为空白对照测试时，受试的金黄色葡萄球菌未出现清晰的抑菌圈。

[0139] 3、部分阳离子对称两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌敏感度部分阳离子对称两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌敏感度结果见表4。

[0140] 表4部分阳离子对称两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌敏感度[0141]

[0142] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。