一种硫氢根离子的荧光探针及其合成方法

摘要

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种硫氢根离子荧光探针及其合成方法。本发明公开的硫氢根离子荧光探针，化学名为二氯化[8-二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯]合铜（简称BODIPY-DPA-Cu）。该硫氢根离子荧光探针的合成方法是将8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（简称BODIPY-DPA）与CuCl2混合，溶于甲醇中，室温反应5～60min后制得。本发明制备的铜离子荧光探针能够在缓冲溶液以及活体细胞中响应HS-，并伴有绿色荧光恢复的现象，具有毒性低的特点，100μMHepG-2的抑制率小于10%，活体细胞成像实验证明了BODIPY-DPA-Cu系统能够在HepG-2细胞中检测HS-，检测限达到了1.12μM，是一种极灵敏的检测系统,可以在环境保护以及生物体中用于HS-的检测。

权利要求

1.一种合成硫氢根离子荧光探针二氯化[8-二(2-吡啶甲基)胺-3-苯甲基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯]合铜(简称BODIPY-DPA-Cu)的方法，具有如下结构式,其特征在于，反应步骤如下：

A、将2,4-二甲基吡咯与3-氯甲基苯甲酰氯以摩尔比1:3～3:1比例混合后加入CH2Cl2，40℃反应1～8h；

B、接着加入三氟化硼，其中三氟化硼与2,4-二甲基吡咯摩尔比为1:1～1:4，40℃反应

2～10h；

C、向混合体系中依次加入二(2-吡啶甲基)胺和三乙胺，氮气保护，80℃油浴回流4～

16h，其中，二(2-吡啶甲基)胺与2,4-二甲基吡咯摩尔比为1:2～2:1，三乙胺与二(2-吡啶甲基)胺的摩尔比为3:1～1:3；

D、反应结束后用饱和氯化钠水溶液萃取洗涤，水相使用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；

E、将褐色油状物经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体，即为

8-[二(2-吡啶甲基)胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯(简称BODIPY-DPA)；

将8-[二(2-吡啶甲基)胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯与CuCl2以摩尔比为2:1～1:2的比例混合，溶于甲醇中，室温反应5～60min后制得。

说明书

一种硫氢根离子的荧光探针及其合成方法

技术领域

[0001] 本发明属于分析化学技术领域，涉及一种硫氢根离子的荧光探针及其合成方法。

背景技术

[0002] 硫化氢被看做是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种信号分子，据报道在人体血液中内源性的硫化氢含量是10-100μM，内源性的硫化氢参与很多方面的生理过程，例如舒缓血管平滑肌，调节神经传递，抑制胰岛素信号，调节体内炎症以及氧气释放等。考虑到硫-化氢具有很高的扩散性以及活性，硫化氢在生理条件主要以HS 离子的形式存在。

[0003] 近年来发展了很多测试手段来检测即刻产生的HS-，例如比色法，电化学方法，色谱测试 法等等（Szabo C.Hydrogen sulphide and its therapeutic potential.Nat Rev Drug Discov2007;6:917-935.Yang GD;Wu LY,Jiang B,Yang W,Qi JS,Cao K,Meng QH,Mustafa AK,Mu WT,Zhang SM,Snyder SH,Wang R.H2S as a physiologic vasorelaxant:hypertension in mice with deletion of cystathionine gamma-lyase,Science2008;322:587.）。然而，传统的检测手段通常需要大量的生物组织样本以及复杂的处理过程，并且需要昂贵的测试仪器。因此，需要发展一种新的手段来检测有机体内的痕量-HS。发明人发展的荧光染料-铜复合系统可以在模拟生理环境的条件下以及活体HepG-2细胞中检测硫化氢，并且，此方法对于硫化氢反应迅速，现象明显，检测限达到了1.12μM，是一种很好的检测系统。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供一种高灵敏的荧光探针以检测HS-，本发明另外一个目的是提供这种荧光探针的合成制备方法。

[0005] 本发明公开的一种硫氢根离子荧光探针，二氯化[8-二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯]合铜（简称BODIPY-DPA-Cu），其结构式如下：

[0006]

[0007] 本发明所公开的化合物DOBIPY-DPA-Cu的合成反应步骤如下：

[0008] 将8-[ 二（2-吡 啶 甲 基）胺 -3-苯 甲 基]-4,4- 二 氟-1,3,5,7- 四 甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（简称BODIPY-DPA）与CuCl2以摩尔比2:1～1:2比例混合，溶于甲醇中，室温反应5～60min后，得化合物二氯化[8-二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯]合铜。

[0009] 化合物8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯的典型合成反应步骤如下：

[0010] A、将2,4-二甲基吡咯与3-氯甲基苯甲酰氯以摩尔比1:3～3:1比例混合后加入CH2Cl2，40℃反应1～8h；

[0011] B、接着加入三氟化硼，其中三氟化硼与2,4-二甲基吡咯摩尔比为1:1～1:4，40℃反应2～10h；

[0012] C、向混合体系中依次加入二（2-吡啶甲基）胺和三乙胺，氮气保护，80℃油浴回流4～16h，其中，二（2-吡啶甲基）胺与2,4-二甲基吡咯摩尔比为1:2～2:1，三乙胺与二（2-吡啶甲基）胺的摩尔比为3:1～1:3；

[0013] D、反应结束后用饱和氯化钠水溶液萃取洗涤，水相使用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸出溶剂，得褐色油状物；

[0014] E、将褐色油状物经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯洗脱，得到暗红色粘稠固体，即为8-[二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基]-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（简写为DOBIPY-DPA）。

[0015] 8-[ 二（2- 吡 啶 甲 基） 胺 -3- 苯 甲 基 ]-4,4- 二 氟 -1,3,5,7- 四 甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯（简称BODIPY-DPA）与CuCl2摩尔比1:1形成的复合物-
BODIPY-DPA-Cu，能够在缓冲溶液以及活体细胞中响应HS，并伴有绿色荧光恢复的现象。
-
活体细胞成像实验证明了BODIPY-DPA-Cu系统能够在HepG-2细胞中检测HS，因此,探针-
DOBIPY-DPA-Cu可以在环境保护以及生物体中用于HS 的检测。

[0016] DOBIPY-DPA-Cu化合物对HS-的选择性荧光响应见图2，随着NaHS的加入，DOBIPY-DPA-Cu溶液的荧光强度逐渐恢复，而相同情况下其他阴离子没有显著的荧光响应，-所以DOBIPY-DPA-Cu可用于HS 的检测。

[0017] 细胞毒性实验，以BODIPY-DPA为受试化合物：

[0018] 将HepG-2细胞在含10%热灭活的胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养液中，于CO2培4
养箱（37℃，5%CO2、饱和湿度）内连续培养。取对数生长期细胞，消化、计数，以2×10/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔100μl。培养24h后，用浓度为10μM,50μM,100μM,的化合物DOBIPY-DPA作用HepG-2细胞24h。用TS100Nikon倒置相差显微镜观察细胞的生长情况。从细胞形态学观察，可以看出即使使用100μM的化合物DOBIPY-DPA没有观察到显著肿瘤细胞的死亡，100μM化合物对肿瘤细胞的抑制率小于9%，说明化合物具有较低的毒性。

[0019] 本发明所用的溶剂皆为分析纯，用5 分子筛进行除水处理，所用试剂未加特殊说明直接应用而未经任何特殊处理。乙醇（分析纯，上海中试化工总公司）；二氯甲烷（分析纯，上海中试化工总公司）；乙酸乙酯（分析纯，上海中试化工总公司）；三乙胺、氢氧化钠（分析纯，上海化学试剂有限公司）；2,4-二甲基吡咯、3-氯甲基苯甲酰氯、二（2-吡啶甲基）购自-1Sigma公司。美国Nicolet20DXBFR-IR型傅立叶红外光谱仪，KBr压片，400～4000cm ；日本岛津UV-2450型紫外可见分光光度仪，800-190nm；DHG-9140A型电热恒温鼓风干箱（上海-恒科技有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海-恒科技有限公司）；Ti-E2000活细胞工作站显微镜（日本Nikon公司）。

[0020] 有益效果

[0021] 本发明制备的硫氢根离子荧光探针能够在缓冲溶液以及活体细胞中响应HS-，并伴有绿色荧光恢复的现象，具有毒性低的特点，100μM HepG-2的抑制率小于10%，活体-细胞成像实验证明了BODIPY-DPA-Cu系统能够在HepG-2细胞中检测HS，检测限达到了
1.12μM，是一种极灵敏的检测系统,该荧光离子探针可以在模拟生理环境的条件下以及- -
活体HepG-2细胞中检测HS，并且，此方法对于HS 反应迅速，可以在环境保护以及生物体-
中用于HS 的检测。

附图说明

[0022] 图1：DOBIPY-DPA(2μM)的Tris-DMSO((9:1,v/v)溶液随着氯化铜加入荧光变化（(λex=460nm)。

[0023] 其中CuCl2浓度为(a-i:0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,2.4,2.8,4.0μM)。

[0024] 图2：DOBIPY-DPA-Cu(2μM)在Tris-DMSO(pH7.4,9:1,v/v)溶液在各种阴离子(6μM)存在下荧光变化。

[0025] 其 中 阴 离 子：F-,Cl-,I-,SO42-,NO3-,CO32-,HPO42-,HSO3-,PO43-,S2O32-,CH3COO-，λex=460nm。

[0026] 图3：DOBIPY-DPA–Cu的结构式。

具体实施方式

[0027] 下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实施例。

[0028] 实施例1

[0029] 将化合物DOBIPY-DPA（53.5mg,0.1mmol）与CuCl2(13.5mg,0.1mmol)以摩尔比1:1比例混合，溶于甲醇溶液中（30mL），室温反应30min得化合物二氯化[8-二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯]合铜（简写为- +
DOBIPY-DPA-Cu）。产率96%。ES-MS(CH3OH):m/z633.42(100)[(DOBIPT-DPA-Cu)-Cl]。

[0030] 实施例2

[0031] 将化合物DOBIPY-DPA(53.5mg,0.1mmol）与CuCl2(6.8mg,0.05mmol)以摩尔比2:1比例混合，溶于甲醇溶液中（60mL），室温反应60min得化合物二氯化[8-二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯]合铜（简写为DOBIPY-DPA-Cu）。产率，60%。

[0032] 实施例3

[0033] 将化合物DOBIPY-DPA(53.5mg,0.1mmol）与CuCl2(27mg,0.2mmol)以摩尔比1:2比例混合，溶于甲醇溶液中（60mL），室温反应5min得化合物二氯化[8-二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯]合铜（简写为DOBIPY-DPA-Cu）。产率，50%。

[0034] 实施例4

[0035] 将化合物DOBIPY-DPA(53.5mg,0.1mmol）与CuCl2(13.5mg,0.1mmol)以摩尔比1:1比例混合，溶于甲醇溶液中（20mL），室温反应15min得化合物二氯化[8-二（2-吡啶甲基）胺-3-苯甲基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二吡咯]合铜（简写为DOBIPY-DPA-Cu）。产率，72%。

[0036] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。