一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒及检测方法转让专利
申请号 : CN201310000433.2
文献号 : CN103014181B
文献日 : 2014-04-09
发明人 : 曾令兵 , 孟彦 , 徐进 , 张辉 , 周勇 , 范玉顶
申请人 : 中国水产科学研究院长江水产研究所
摘要 :
本发明公开了一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒及检测方法，一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：10×ThermoPolReaction缓冲液；BstDNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，1000×SYBRGreenI。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的GSIV，能检测GSIV感染的病鱼组织，能检测GSIV感染的细胞，非常适用于GSIV的现场快速检测。
权利要求 :
1.一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
10×ThermoPol Reaction缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，1000×SYBR Green I; F3：5’-CGACTTGGCCACTTATGACA-3’； B3：5’-TTGACCTCGGGGGTCTTG-3’；
FIP:5’-GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT-3’； BIP:5’-AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT-3’。
说明书 :
一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法。
背景技术
[0002] 大鲵(Andrias davidianus)俗称娃娃鱼，属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科、大鲵属，1988年被列为国家二级保护动物，2007年《濒危野生动植物物种国际贸易公约》（CITEJ）第
14届缔约国大会被列为Ⅰ类濒危物种。大鲵不仅具有一定的药用和科研价值，而且还可以作为观赏动物和食用佳肴。20世纪80年代以来，我国各地陆续进行了大鲵的人工养殖和繁殖，目前已成为水产养殖中高效养殖的优良品种之一。然而随着养殖规模的扩大，大鲵病害问题日益突出，尤其是近年来暴发的大鲵病毒性出血病，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失，严重制约了其健康养殖的发展。
14届缔约国大会被列为Ⅰ类濒危物种。大鲵不仅具有一定的药用和科研价值，而且还可以作为观赏动物和食用佳肴。20世纪80年代以来，我国各地陆续进行了大鲵的人工养殖和繁殖，目前已成为水产养殖中高效养殖的优良品种之一。然而随着养殖规模的扩大，大鲵病害问题日益突出，尤其是近年来暴发的大鲵病毒性出血病，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失，严重制约了其健康养殖的发展。
[0003] 为了及早发现和确诊大鲵病毒性出血病病原，大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus，GSIV)，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为大鲵养殖业的健康发展提供技术保障。
[0004] 环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。
发明内容
[0005] 本发明的一个目的是在于提供了一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的GSIV毒株的MCP基因编码区序列(JN615141.1)，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在线软件设计特异性引物，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对大鲵虹彩病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。
[0006] 本发明的另一个目的是在于提供了一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的GSIV，能检测GSIV感染的病鱼组织，能检测GSIV感染的细胞（例如EPC细胞），非常适用于GSIV的现场快速检测。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：
[0009] 该试剂盒包括以下成分：10×ThermoPol Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl2，1000×SYBR Green I（Invitrogen）。
[0010] F3：5，-CGACTTGGCCACTTATGACA-3，；
[0011] B3：5，-TTGACCTCGGGGGTCTTG-3，；
[0012] FIP：5，-GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT-3，；
[0013] BIP：5，-AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT-3，。
[0014] 一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，其步骤是：
[0015] 1、病毒DNA的获取：
[0016] 采用 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA。
[0017] 2、LAMP扩增：
[0018] 采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl22-10mM，Bst DNA聚 合酶8U，模 板DNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，余量去离子水补足。选择55-65℃的温度范围和
30－120分钟的时间范围进行LAMP反应之后，80℃灭活2分钟。
30－120分钟的时间范围进行LAMP反应之后，80℃灭活2分钟。
[0019] 3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定：
[0020] 1）发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
[0021] 2）每25μl体系的反应管加1000×SYBR Green I（Invitrogen）1-2μl，1-5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
[0022] 3）取扩增产物，用2%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
[0023] 一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法（最佳条件），其步骤是：
[0024] 1、病毒DNA的获取:
[0025] 采用 试剂或Viral DNA Kit试剂盒提取样本总DNA，模板DNA在95℃5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。
[0026] 2、LAMP扩增:
[0027] 采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各 0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl28mM，Bst DNA 聚 合 酶 8U，模 板 DNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，去离子水补足至25μl。反应管于65℃温育60分钟进行LAMP反应之后，80℃灭活2分钟。
[0028] 3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定：
[0029] 1）发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
[0030] 2）每25μl体系的反应管加1000×SYBR Green I（Invitrogen）1-2μl，1-5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
[0031] 3）取扩增产物，用2%（w/v,以下相同）的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0033] 1、本发明公开了一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒；
[0034] 2、特异性好，能有效检测出大鲵虹彩病毒；
[0035] 3、灵敏度高，够检测到10fg的GSIV。
[0036] 4、快速高效，检测时间约1小时，非常适用于GSIV的现场快速检测；
[0037] 5、不需要特殊试剂与设备，检测成本低；
[0038] 6、鉴定简单，通过从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，经肉眼就可判断结果，通过加入1000×SYBR Green I，可提高结果的灵敏度。
附图说明
[0039] 图1为一种大鲵虹彩病毒LAMP试剂盒检测结果的特异性的示意图。
[0040] 从左至右的泳道依次为100bp DNA Ladder Marker、GSIV、KHV、LCDV、Ah、Cf、水的空白对照。
[0041] 图2为一种大鲵虹彩病毒LAMP试剂盒检测结果的灵敏度的示意图。
[0042] 从左至右的泳道依次为100bp DNA Ladder Marker、1ngGSIV、100pgGSIV、10pgGSIV、1pgGSIV、100fgGSIV、10fgGSIV、1fgGSIV。
具体实施方式
[0043] 下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。若无特别说明，本发明所用试剂均为上海生工生物工程公司生产。
[0044] 实施例1：
[0045] 一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：
[0046] 该试剂盒它包括以下成分：10×ThermoPol Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl2，1000×SYBR Green I（Invitrogen）。
[0047] F3：5，-CGACTTGGCCACTTATGACA-3，；
[0048] B3：5，-TTGACCTCGGGGGTCTTG-3，；
[0049] FIP：5，-GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT-3，；
[0050] BIP：5，-AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT-3，。
[0051] 实施例2：
[0052] 大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒不同浓度的Mg2+的优化
[0053] 一、取待检样品提取病毒DNA:
[0054] 培养鲤上皮乳头瘤细胞（EPC细胞）至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为0.1的剂量，接种1ml经4000r/min离心5min除去细胞碎片的大鲵虹彩病毒细胞毒材料（武汉大学保藏中心保藏号CCTCC V201134），添加10μl的Polybrene（终浓度10μg/ml），置于26℃培养箱中吸附1h，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附1h后，吸弃病毒液，加入5ml2%胎牛血清（V/V）的培养液，置26℃培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于-80℃至室温（20-25℃）反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。
[0055] 二、LAMP扩增的反应体系:
[0056] 采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl2，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl（1μgml），
10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，余量去离子水补足。
10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，余量去离子水补足。
[0057] 其中Mg2+的浓度分别为2、4、6、8和10mM。
[0058] 三、LAMP扩增的反应条件:
[0059] 反应管于65℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。
[0060] 四、检测结果判定:
[0061] 取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图2+
片显示Mg 的浓度为8mM时结果最好。
片显示Mg 的浓度为8mM时结果最好。
[0062] 实施例3：
[0063] 大鲵虹彩病毒LAMP检测方法反应温度的优化:
[0064] 一、取待检样品提取病毒DNA:
[0065] 待GSIV感染的EPC细胞出现90%病变后收获（制备方法同实施例2），于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。
[0066] 二、LAMP扩增的反应体系:
[0067] 采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各 0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl28mM，Bst DNA 聚 合 酶 8U，模 板 DNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，余量去离子水补足。
[0068] 三、LAMP扩增的反应条件:
[0069] 反应管分别置于60、61、62、63、64、65℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。
[0070] 四、检测结果判定:
[0071] 取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示65℃时结果最好。
[0072] 实施例4：
[0073] 大鲵虹彩病毒LAMP检测方法的特异性
[0074] 一、取待检样品提取病毒DNA:
[0075] GSIV感染的EPC细胞、KHV（朱霞,李新伟,王好,等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报,2011,33(5):340-343.）感染的Koi-Fin细胞、LCDV（宋晓玲，黄捷，杨冰,等.牙鲆Paralichthys olivaceus淋巴囊肿病毒的分离[J].中国水产科学,2003,10(2):117-120.）感染的CIK细胞出现90%病变后收获（上述病毒的制备方法同GSIV），于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。
[0076] 另外培养分离自大鲵的两种致病菌：嗜水气单胞菌（Ah）（孟彦,曾令兵,杨焱清,肖汉兵，大鲵腹水病病原菌的分离与鉴定研究.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2009,37（3）：77-81.）常规细菌培养和弗氏柠檬酸杆菌（Cf）（高正勇，曾令兵，孟彦，刘小玲，张波，患病大鲵中弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定.微生物学报，2012，52(2):169-176.）常规细菌培养，直接以菌液（109CFU/ml）作为模板检测。
[0077] 二、LAMP扩增的反应体系:
[0078] 采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl28mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl（1μgml），
10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，余量去离子水补足。
10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，余量去离子水补足。
[0079] 三、LAMP扩增的反应条件:
[0080] 反应管于65℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。
[0081] 四、检测结果判定:
[0082] 取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示针对GSIV设计的特异LAMP引物组能保证对GSIV的特异性检测，只检测出GSIV，而KHV、LCDV、Ah、Cf和水的空白对照均无法检出（图1）。
[0083] 实施例5：
[0084] 大鲵虹彩病毒LAMP检测方法的灵敏度
[0085] 一、取待检样品提取病毒DNA:
[0086] GSIV感染的EPC细胞出现90%病变后收获（上述病毒的制备方法同前），于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。临用前测定样品浓度，用灭菌水调整并制备10倍稀释的系列模板：0.2ng/μl至0.2fg/μl。
[0087] 二、LAMP扩增的反应体系:
[0088] 采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各 0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl28mM，Bst DNA 聚 合 酶 8U，模 板 DNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，余量去离子水补足。
[0089] 三、LAMP扩增的反应条件:
[0090] 反应管于65℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。
[0091] 四、检测结果判定:
[0092] 取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示针对GSIV设计的特异LAMP引物组能够检测到10fg的GSIV（图2）。