猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒及应用

摘要

本发明属于动物病毒学与动物传染病学检测技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒及应用。本发明通过基因工程重组技术得到两株表达猪肺炎支原体p46蛋白和p65蛋白的重组的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65。本发明的试剂盒包括以突变后猪肺炎支原体膜蛋白P46和P65基因表达蛋白共同作为抗原包被的酶标板和其他核心试剂。本发明公开了猪肺炎支原体膜蛋白P46和P65基因的克隆，定点突变以及P46和P65蛋白的表达及纯化方法。还公开了猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法。本发明制备的间接ELISA抗体检测试剂盒可用于猪肺炎支原体抗体的临床大规模检测和流行病学调查，具有广阔的市场前景。

权利要求

1.一种重组的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65，其特征在于，所述的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC NO：M2011294和CCTCC NO：M2011295，所述的大肠杆菌分别表达猪肺炎支原体主要免疫原性膜蛋白p46和p65，其编码的蛋白质的序列分别如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示。

2.一种适用于猪肺炎支原体抗体检测的间接ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括包被板、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、底物显色液A、底物显色液B、终止液，其中所述的包被板包被有由保藏号为CCTCC NO：M2011294和CCTCC NO：M2011295的重组的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65表达的p46和p65蛋白共同包被的抗原，所述的样品稀释液、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、底物显色液A、底物显色液B、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清的成分和制备步骤如下所示：样品稀释液：牛血清白蛋白5g、Tween-200.5ml、氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g和硫柳汞钠0.2g；先用注射用水溶解并定容至1000ml，再用

0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

浓缩洗涤液：NaCl170g，Tween-2010ml；加注射用水溶解并定容至1000ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到20倍浓缩洗涤液，无菌分装后置2～8℃保存备用；

羊抗猪酶标二抗：将羊抗猪IgG-HRP酶标抗体，用保护剂按体积比1:15000稀释成工作浓度，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

底物显色液A：Na2HPO4.12H2O14.6g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH值至5.0～5.4，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

底物显色液B：四甲基联苯胺20mg，加入无水乙醇10ml溶解，再用注射用水定容至

1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

终止液：将2.5ml氢氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

保护剂：BSA0.5g、蔗糖2g，加注射用水溶解并定容至100ml，置2～8℃保存备用。

所述的阳性对照血清是感染猪支原体肺炎的猪血清；

所述的阴性对照血清是未感染猪支原体肺炎的猪血清。

3.权利要求1所述的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65表达的抗原蛋白在制备猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒中的应用。

说明书

猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。具体地说，本发明涉及一种猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒及其在猪群中猪肺炎支原体抗体检测的应用。

背景技术

[0002] 猪支原体肺炎俗称猪喘气病或猪地方流行性肺炎，广泛分布于世界各地，以慢性、接触性、高度传染性、高发病率以及低死亡率等为特点，主要表现为咳嗽和呼吸困难，解剖可见肺组织呈肉变或者大理石样病变。

[0003] 猪肺炎支原体是猪呼吸道疾病综合征的重要病原之一，可继发感染PRRSV、PCV2等，从而导致了多种疫苗的接种失败。猪肺炎支原体可经空气传播，此外还易与其他细菌性疾病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发，对养猪业造成重大经济损失，是当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一。这主要是因为猪肺炎支原体能够穿透黏膜层与纤毛粘在一起，破坏纤毛的完整性，并分泌一些有害因子，而改变纤毛的游走性，致使纤毛大量脱落，这为其它细菌和病毒的入侵创造了条件，也就致使损失加剧。

[0004] 猪肺炎支原体能在猪肺中长期滞留，治疗效果不佳，虽然该病引起的死亡率不高，但是流行的广泛性所造成的经济损失仍然是巨大的。据报道，猪肺炎支原体表面具有纤毛黏附因子，其感染猪的呼吸道后，能与黏膜上皮细胞纤维发生特异性结合，使猪肺炎支原体能够附殖并造成致病性。Raznis(1983)研究发现，猪肺炎支原体的致病力及免疫原性都与其细胞膜上的膜蛋白有关，Gear S J等(1985)从猪肺炎支原体菌株VPP11的细胞膜中分离得到了一种致病蛋白因子，发现其具有明显的免疫原性，并证实细胞膜蛋白是导致猪患猪支原体肺炎的主要因素。根据衣阿华大学的Ross研究发现，猪肺炎支原体感染后淋巴细胞产生抗体的能力下降，细胞免疫力下降，肺泡巨噬细胞对病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T细胞的活动增强，导致呼吸道免疫力减弱，抗病力下降，从而使其它病原体更容易侵入。

[0005] 对标准菌株和野外分离菌株的抗原分析表明，支原体肺炎含有几种主要免疫原，即：胞内具LDH活性的蛋白(P36)(Haldimann A，et al.1993；Stipkovits L，et al.1991)，3种膜蛋白(P46、P65和P70)(Kim M F，et al.1990；Mori Y T，et al.1988)和粘附素(P97)(Zhang Q T，et al.1995)。这些蛋白在急性或初次感染肺炎支原体后，可刺激产生早期和特异抗体。

[0006] 目前关于猪支原体肺炎的诊断方法，国外研究较多，而国内研究较少，而且主要是间接血凝实验(IHA)和单抗原包被的ELISA方法。但是，IHA的检测中存在着检测滴度低、结果和感染的相关性低、凝集终点判定的主观性较强以及本身固有的技术缺陷等问题，因此IHA在商品猪群的Mhp检测中实际应用前景有限。ELISA是目前应用最广泛的检测技术，它具有敏感度高、特异性强和操作简单等特点。通过研究其特异性蛋白而建立的诊断方法是目前研究的热点。但是只选用一种蛋白作为唯一的包被蛋白，对于Mhp感染初期的猪很可能存在假阴性，若将Mhp的功能蛋白组合后再检测该病，可能检测结果更加准确可靠，易于大规模推广应用，具有更加广阔的应用前景。

[0007] 研究发现，p46蛋白是猪肺炎支原体的一种种属特异的膜抗原，高度保守，可以诱导早期免疫应答，并且引起的抗体反应的持续时间最长。其序列中3个TGA密码子编码Trp，而TGA在通用密码子中为终止密码子，需要将TGA突变为TGG才能获得其原核表达的蛋白。S Futo等将P46基因克隆到载体，然后转入大肠杆菌中进行原核表达，收获并纯化该重组蛋白，并且将其成功地应用于检测猪肺炎支原体抗体的ELISA实验，在该实验中可以避免与絮状支原体、猪鼻支原体，猪滑液支原体的交叉反应(Futo S，et al.1995)。M F Kim等研究发现，P65蛋白是猪肺炎支原体的一个重要的免疫原，它的碳端是其主要的抗原区(Kim M F，et al.1990)。P65蛋白是一种解脂酶(lipolytic enzyme)，是猪肺炎支原体主要的具免疫原性的表面蛋白即膜蛋白之一(Jono A，et al.2004)，其功能可能是损害肺组织中表面活性剂，即一种由脂蛋白组成的物质，是由肺部的肺泡细胞分泌的，可以通过减小肺部表面的液体表面张力来维持肺组织的稳定性(Wise K.S.et al.1987)，还可以触发急性或首次感染猪肺炎支原体的断奶仔猪及生长猪的早期免疫应答。P65蛋白序列中也有1个TGA密码子需要进行定点突变才能在大肠杆菌中表达。K.Cheikh Saad Bouh等将P46基因和P65基因克隆到载体上，在大肠杆菌中对其进行原核表达，收获表达产物并对其进行复性后免疫BALB/c小鼠，从而获得相应的单克隆抗体，并对该单克隆抗体进行了交叉反应的研究，结果显示该蛋白具有很高的种间保守性和特异性(Cheikh Saad Bouh K，et al.2003)。
因此，P46蛋白和P65蛋白均可以作为建立Mhp诊断方法的优选抗原。在血清学检测方法中，ELISA方法具有方便、快速、敏感性和特异性高等特点，在动物疾病的检测中得到了广泛的应用。本研究克隆了Mhp P46和P65基因，并以其表达的蛋白共同作为抗原建立了检测Mhp的间接ELISA方法，为临床检测猪肺炎支原体感染和流行病学调查奠定了初步基础。

发明内容

[0008] 本发的的主要目的在于克服现有技术上存在的缺陷，提供一种猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒，以解决猪群中猪肺炎支原体抗体的检测。

[0009] 本发明的第一个目的是获得分别表达猪支原体肺炎主要免疫原性膜蛋白p46蛋白和p65蛋白的重组大肠杆菌菌株，重组菌株pGEX-KG-46中的p46蛋白基因中三个编码色氨酸的TGA密码子均已经定点突变为TGG，重组菌株pGEX-KG-65中的p65蛋白基因中一个编码色氨酸的TGA密码子已经定点突变为TGG，以便于这两种蛋白的原核表达；

[0010] 本发明的第二个目的是利用上述重组菌株建立一种猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法。

[0011] 本发明的第三个目的是组装一种猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒。

[0012] 本发明的第四个目的是利用该试剂盒在猪群中猪肺炎支原体抗体检测中的应用。

[0013] 本发明通过以下技术方案实现：

[0014] 申请人通过基因工程的方法，获得两株分别表达猪支原体肺炎主要免疫原性膜蛋白p46蛋白和p65蛋白的重组的大肠杆菌(Escherichia coli)pGEX-KG-46和pGEX-KG-65，将这两株菌株于2011年08月22日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号分别为CCTCC NO：M2011294；CCTCC NO：M2011295。

[0015] 申请人提供了一种重组的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65的制备方法，它包括下列步骤：

[0016] 1)构建重组质粒pGEX-46和pGEX-65：

[0017] 分别扩增猪肺炎支原体膜蛋白p46和p65的基因片断，并将其亚克隆至原核表达载体pGEX-KG上，构建得到重组质粒pGEX-46和pGEX-65。

[0018] 所用引物对的DNA序列如下所示(引物的下划线部分为酶切位点)：

[0019] p46正向引物：CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA(5′→3′)，

[0020] p46反向引物：CCCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTA(5′→3′)；

[0021] p65正向引物：AAAGGATCCATGGCAAAAGAA(5′→3′)，

[0022] p65反向引物：CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5′→3′)；

[0023] 2)利用三个引物对将猪肺炎支原体的p46蛋白基因片断中210bp、303bp和662bp处的碱基A人工定点突变为碱基G，所用引物对的DNA序列如下所示：

[0024] 正向引物：AATCCTCGATGGATTAGTGCC(5′→3′)，

[0025] 反向引物：CCATCGAGGATTATCCGGAT(5′→3′)；

[0026] 正向引物：CAAAATAACTGGCTCACTCAG(5′→3′)，

[0027] 反向引物：CCAGTTATTTTGTGCATCCTG(5′→3′)；

[0028] 正向引物：TCCCAGGATGGAATTATGGAA(5′→3′)，

[0029] 反向引物：CCATCCTGGGACATAAACAGC(5′→3′)；

[0030] 利用一个引物对将猪肺炎支原体的p65蛋白基因片断633bp处的碱基A人工定点突变为碱基G，所用引物对的DNA序列如下所示：

[0031] 正向引物：CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA(5′→3′)，

[0032] 反向引物：CCCCCAATTTACAATTTCATTAT(5′→3′)；

[0033] 3)用上述突变之后的重组质粒pGEX-46和pGEX-65转化大肠杆菌JM105，进行PCR和酶切鉴定并测序。将突变正确的菌株命名为大肠杆菌(Escherichia coli)pGEX-KG-46和pGEX-KG-65，于2011年08月22日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号分别为CCTCC NO：M2011294；CCTCC NO：M2011295(其详细构建过程参见图2)。

[0034] 将上述重组的大肠杆菌经IPTG诱导后收集菌体进行超声波破碎提取猪肺炎支原体p46蛋白和p65蛋白，所提取的p46蛋白和p65蛋白经过亲和层析纯化后可用于制备检测猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒。

[0035] 申请人获得两种能分别原核表达猪肺炎支原体主要免疫原性膜蛋白p46和p65的基因片段，将编码色氨酸的密码子TGA定点突变为TGG，p46蛋白和p65蛋白的基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，表SEQ ID NO：3所示。

[0036] 申请人利用所述的两株重组菌株pGEX-KG-46和pGEX-KG-65所表达纯化的p46蛋白和p65蛋白为包被抗原制备成间接ELISA核心试剂，组装了一种用于快速检测适用于猪群的猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒。本发明的试剂盒是由包被板、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、底物显色液A、底物显色液B、终止液，其中所述的包被板包被有由保藏号为CCTCC NO：M2011294和CCTCC NO：M2011295的重组的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65表达的p46和p65蛋白共同包被的抗原，所述的样品稀释液、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、底物显色液A、底物显色液B、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清的成分和制备步骤如下所示：

[0037] 样品稀释液：牛血清白蛋白5g、Tween-20 0.5ml、氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g和硫柳汞钠0.2g；先用注射用水溶解并定容至1000ml，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0038] 浓缩洗涤液：NaCl 170g，Tween-20 10ml；加注射用水溶解并定容至1000ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到20倍浓缩洗涤液，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0039] 羊抗猪酶标二抗：将羊抗猪IgG-HRP酶标抗体，用保护剂按体积比1∶15000稀释成工作浓度，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0040] 底物显色液A：Na2HPO4.12H2O 14.6g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH值至5.0～5.4，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0041] 底物显色液B：四甲基联苯胺20mg，加入无水乙醇10ml溶解，再用注射用水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0042] 终止液：将2.5ml氢氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0043] 保护剂：BSA0.5g、蔗糖2g，加注射用水溶解并定容至100ml，置2～8℃保存备用。

[0044] 所述的阳性对照血清是感染猪支原体肺炎的猪血清；

[0045] 所述的阴性对照血清是未感染猪支原体肺炎的猪血清。

[0046] 本发明的主要优点是：

[0047] 1、本发明的试剂盒能直接对猪肺炎支原体进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短的特点，可用于猪肺炎支原体抗体的临床大规模检测和流行病学调查，具有广阔的市场前景。

[0048] 2、本发明将所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒稳定性好、保存期长，在2～8℃条件下放置半年不会影响其敏感性。

[0049] 3、目前国内市场上还没有同时应用Mhp的两种功能蛋白作为包被抗原检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA试剂盒。

[0050] 更详细的技术方案见实施例所述。

附图说明

[0051] 序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪肺炎支原体免疫原性膜蛋白p46的基因片段，序列全长为1260bp，在210bp、303bp和662bp处存在碱基的人工定点突变。

[0052] 序列表SEQ ID NO：2是克隆的猪肺炎支原体免疫原性膜蛋白p46的基因片段编码的蛋白质的序列，它编码419个氨基酸。

[0053] 序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的猪肺炎支原体免疫原性膜蛋白p65的基因片段，序列全长为1803bp，存在一个A633-G633的人工定点突变。

[0054] 序列表SEQ ID NO：4是克隆的猪肺炎支原体免疫原性膜蛋白p65的基因片段编码的蛋白质的序列，它编码600个氨基酸。

[0055] 图1：本发明总体技术路线图。

[0056] 图2：本发明制备的能够原核表达的p46和p65基因片段的流程图。

[0057] 图3：本发明扩增的p46和p65基因片段的PCR鉴定图：其中，图3A：p46片段的PCR扩增的胶图；

[0058] 图3B：p65片段的PCR扩增的胶图。

[0059] 图4：本发明制备的p46基因210bp、303bp和662bp处A-G突变后的PCR鉴定图和p65基因A633突变为G633的PCR鉴定图。其中，图4A：突变后p46片段的PCR扩增的胶图；图4B：突变后p65片段的PCR扩增的胶图。

[0060] 图5：本发明制备的p46基因210bp、303bp和662bp处A-G突变后的重组质粒的酶切鉴定图和p65基因A633突变为G633的重组质粒的酶切鉴定图。其中，图5A：p46经定点突变后的酶切鉴定的胶图；图5B：p65经定点突变后的酶切鉴定的胶图。

[0061] 图6：本发明制备猪肺炎支原体p46基因和p65基因突变前后的BLAST图。其中，图6A：p46经定点突变后的测序结果；图6B：p65经定点突变后的测序结果。

[0062] 图7：本发明制备的p46和p65重组蛋白的表达。其中，图7A：p46蛋白表达的SDS-PAGE分析；图7B：p65蛋白表达的SDS-PAGE分析。

[0063] 图8：本发明制备的p46和p65重组蛋白的亲和层析纯化。其中，图8A：重组p46蛋白的SDS-PAGE分析；图8B：重组p65蛋白的SDS-PAGE分析。

[0064] 图9：本发明制备的p46和p65重组蛋白的Western-blot分析。其中，图9A：Western-blot鉴定p46蛋白的表达；图9B：Western-blot鉴定p65蛋白的表达。

[0065] 图10：本发明克隆的猪肺炎支原体免疫原膜蛋白p46和p65基因片段。括号内显示的是突变的碱基的位置。其中，图10A：p46基因片段；图10B：p65基因片段。

具体实施方式

[0066] 以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，本发明的技术流程如图1所示：

[0067] 实施例1 猪肺炎支原体p46蛋白和p65蛋白的基因片段的克隆

[0068] 1、猪肺炎支原体p46和p65蛋白基因片段的克隆方法见图2所示。

[0069] 制备能够原核表达的p46基因片段所需的引物如表1所述。

[0070] 表1制备能够原核表达的p46基因片段所需的引物

[0071]

[0072] 说明：表1所示引物下划线部分为酶切位点。

[0073] 表2制备能够原核表达的p65基因片段所需的引物

[0074]

[0075] 说明：表2所示引物下划线部分为酶切位点。

[0076] 2、制备能够原核表达的p46和p65基因片段

[0077] 以猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技有限公司，该活疫苗包含有猪肺炎支原体Mhp168株和佐剂)提取基因组DNA(采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，按照该公司提供的试剂盒说明书操作)为模版，分别利用如表1和表2所示的引物p46(BamH I)/p46(HindIII)；p65(BamH I)/p65(HindIII)PCR扩增p46和p65基因片断，扩增体系如下所述：

[0078]

[0079] p46基因片断的PCR扩增条件：94℃预变性5min后，进行如下循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min30s，30个循环，最后72℃10min。

[0080] p65基因片断的PCR扩增条件：94℃预变性5min后，进行如下循环：94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃10min。

[0081] 扩增完成后，取PCR产物8μL，加入1μL10×Loading Buffer，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，观察结果(如图3所示)。电泳后用BioFlux公司胶回收试剂盒进行目的基因的纯化(按照该试剂盒的说明书操作)。将纯化后的p46基因片段与载体pGEX-KG分别进行BamH I和HindIII双酶切后跑胶回收，利用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，经PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆(同样方法进行p65基因的克隆)。

[0082] 从上述阳性克隆菌提取重组质粒pGEX-46为模板，用表1所示的引物p46(a1)/p46(a2)同上体系和条件进行PCR扩增，PCR产物跑胶回收后利用限制性内切酶Dpn I切除模板，再次回收后转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，经PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆，此时第一个TGA已突变为TGG，同样方法对第二个和第三个TGA进行A-G的定点突变(同理用表2所示的引物p65(a1)/p65(a2)同上体系和条件分别进行PCR扩增将p65基因的TGA定点突变为TGG)。用上述突变之后的重组质粒pGEX-46和pGEX-65转化大肠杆菌JM105，进行PCR和酶切鉴定并测序。原核表达的p46基因片段和p65基因片段的制备流程如图2所示。其PCR和酶切鉴定结果如图4和图5所示。测序结果与p46和p65原序列进行BLAST的结果如图6所示。由此可见，在所述的p46基因片段的210bp、303bp和662bp处和p65基因片段的633bp处的碱基A均已定点突变为G，得到能够原核表达的猪肺炎支原体p46基因片段和p65基因片段(其核苷酸序列见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和图10，图10所示序列的括号内为碱基突变位点)。

[0083] 结果表明：所获得的分别含有pGEX-46、pGEX-65质粒的重组的大肠杆菌是正确的，申请人分别将其命名为大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65，将两菌株于2011年08月22日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号分别为CCTCC NO：M2011294和CCTCC NO：M2011295。

[0084] 实施例2 表达p46、p65融合蛋白的重组菌株pGEX-KG-46和pGEX-KG-65的鉴定[0085] 将突变正确的菌株按1∶100的比例(体积比)接种到含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于200r/min，37℃振荡培养3小时后，再次以1∶1000体积比加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mmol/L，诱导表达4小时。收集菌体并用10mL Buffer A(配方：称取6.057g Tris碱、0.1861g乙二胺四乙酸二钠、2.922g氯化钠，甘油50mL，溶解于去离子水后定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤后于2～8℃保存，使用时加0.5mM DTT)重悬。反复冻融三次后进行超声波破碎(UP 200S超声波处理器-德国Dr.Hielscher公司制造，功率：200W、振幅：60％、操作频率：24KHz，超声波破碎时间：30s/次，间隔时间：1min/次)，12000r/min离心15min，上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，观察蛋白是在上清还是在包涵体内表达(图7)。由图7可知，上清和沉淀(包涵体)内目的蛋白均获得表达，但通常从包涵体中纯化的蛋白往往含有杂蛋白，为了保证包被抗原的成分更纯，本发明采用亲和层吸法(纯化步骤见下面的实施例3)纯化上清中的蛋白作为包被抗原。

[0086] 实施例3 抗原的制备及检验

[0087] 1、p46和p65融合蛋白的纯化和检验

[0088] 以可溶形式表达的GST-46和GST-65采用琼脂糖-4B亲和层吸柱纯化：将上清加入盛有约1mL GST-4B原液的离心管中，放在水平摇床于室温或更低条件下缓慢摇动1h后，于2100r/min离心5min，上清转入另一离心管，沉淀加至少10倍体积的pH7.4的PBS(配方：称取8.18g氯化钠、0.20g氯化钾、1.42g磷酸氢二钠、0.245g磷酸二氢钾，溶于去离子水，浓盐酸调节pH至7.4后，用去离子水定容至1000mL，再用0.22μm滤膜过滤后于室温保存。)于摇床摇约10min，2100r/min离心5min，洗涤2次后，加入1ml 10mM pH8.0的还原型谷胱甘肽溶液(配方：称取0.307g还原型谷胱甘肽溶于100mL 50mM Tris-Hcl(pH8.0)中，用0.22μm滤膜过滤后于2～8℃保存。)于摇床上洗脱10min，2100r/min离心5min，收集上清保留，反复用还原型谷胱甘肽溶液洗脱蛋白4-5次。洗脱后用至少10倍体积的PBS于摇床清洗GST-4B原液10min后，2100r/min离心5min，弃上清，反复洗2-3次，加入1～2ml的20％的乙醇覆盖GST-4B原液后于4℃保存备用。用SDS-PAGE电泳测定纯化抗原的纯度，应分别在72kDa和91kDa处有一条明显条带，而没有其他杂带，经凝胶成像系统扫描分析(genetools)软件(为该仪器自带的软件)纯度达90％以上(见图8)。以猪肺炎支原体阳性参考血清作为一抗进行Western blot测定抗原活性，应分别在约72kDa和91kDa处出现一条特异性杂交带(图9A和图9B)。用紫外分光光度计测定蛋白在在280nm-260nm波长时的光吸收值(OD)，按公式1.45×OD280nm-0.74×OD260nm测定纯化蛋白的浓度。根据测定结果用缓冲液PBS稀释蛋白至终浓度为100μg/ml，作为ELISA包被抗原。

[0089] 将上述得到的两个(p46蛋白和p65蛋白)抗原按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍比稀释包被酶标板，并加封闭液(见试剂盒的封闭液配方)进行封闭，阳性对照血清按1∶40稀释，其余步骤按实施例4中第5步进行操作。由此确定抗原效价均应不低于1∶160(检测阳性对照血清的OD630nm值高于判定标准时的抗原最高稀释倍数作为抗原效价)。

[0090] 2、抗原包被板的制备

[0091] 将所制备的p46和p65抗原用包被液(见试剂盒的包被液配方)分别进行体积比1∶160稀释(终浓度均为0.625μg/ml)，p46和p65抗原以1∶1的体积比按每孔100μl的量加到酶标板中，置2～8℃下作用12～15小时；弃去包被液，用洗涤液(见试剂盒的洗涤液配方)洗涤2～3次，每次3min，甩干洗涤液，每孔加封闭液120μl，置37℃下温育
2小时；拍干，再置37℃下干燥30分钟，用锡箔封口膜将抗原包被板封闭，置2～8℃下保存。

[0092] 实施例4 猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法

[0093] 1、核心试剂配制：

[0094] 样品稀释液：牛血清白蛋白5g、吐温20 0.5ml、氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g和硫柳汞钠0.2g，先用注射用水溶解并定容至1000ml，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0095] 浓缩洗涤液：NaCl 170g，Tween-20 10ml，加注射用水溶解并定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤除菌，得到20倍浓缩洗涤液，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0096] 羊抗猪酶标二抗：将羊抗猪IgG-HRP酶标抗体，用保护剂按体积比1∶15000稀释成工作浓度，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0097] 底物显色液A：Na2HPO4.12H2O 14.6g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH值至5.0～5.4，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0098] 底物显色液B：四甲基联苯胺20mg，加入无水乙醇10ml溶解，再用注射用水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0099] 终止液：将2.5ml氢氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0100] 保护剂：牛血清白蛋白(BSA)0.5g、蔗糖2g；加注射用水溶解并定容至100ml；置2～8℃保存备用。

[0101] 2、阴阳性对照血清的制备：

[0102] 阳性对照血清的制备：

[0103] a)制造用动物选用5～6周龄健康仔猪(品种为长白猪，来自华中农业大学试验猪场，为一种公开使用的品种)；

[0104] b)免疫原：西班牙海博莱生物大药厂生产的猪支原体肺炎灭活疫苗(生产批号：00YW-1)；

[0105] c)免疫方法：将西班牙海博莱生物大药厂生产的猪支原体肺炎灭活疫苗(使用方法见该疫苗的使用说明书)在猪的颈部肌肉注射免疫2次，每次1头份/头，两次免疫间隔时间为2周，末次接种后7日，采血检测，得到免疫后的猪血清；

[0106] d)阳性对照血清制备：将上步骤得到的猪血清用本试剂盒检测血清效价，当其达到1∶160以上时，在猪颈部动脉采血，离心分离血清；向所述的血清中加入0.04％硫柳贡钠防腐，56℃水浴条件下灭活30分钟，用0.22μm滤膜过滤除菌，置-70℃下保存，有效期为24个月。将制备的阳性血清用保护剂稀释10倍(体积)，再无菌分装后置4℃下保存，即为本试剂盒的阳性对照血清。

[0107] 阴性对照血清的制备：

[0108] a)生产血清用动物：选用5～6周龄健康仔猪(品种为长白猪，来自华中农业大学试验猪场，为一种公开使用的品种)，用美国爱德士生物科技有限公司猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测抗体为阴性的猪为生产血清用动物；

[0109] b)阴性对照血清制备：在猪颈部动脉采血，离心分离血清，加入0.04％硫柳贡钠防腐，56℃灭活30分钟，用0.22μm滤膜过滤除菌，置-70℃下保存，有效期为24个月。将制备的猪阴性血清用保护剂(见实施例4所示)稀释10倍，无菌分装后置4℃下保存，即为试剂盒的阴性对照血清。

[0110] 3、ELISA检测方法步骤：

[0111] (1)包被抗原(由大肠杆菌(CCTCCNO：M2011294，CCTCCNO：M2011295表达的抗原蛋白)最佳包被浓度、血清最佳稀释度的选择：采用方阵滴定法来确定，试验结果显示包被抗原最佳包被浓度分别为0.625μg/ml，血清最佳稀释度为1∶40(体积)。辣根过氧化物酶标记羊抗猪酶标二抗的最佳稀释浓度为1∶15000。

[0112] (2)酶标板的制备：将所制备的p46蛋白和p65蛋白为包被抗原，用包被液分别进行1∶160稀释(终浓度分别为0.625μg/ml)，两者以1∶1体积比按每孔100μl的量加到酶标板中，置2～8℃下作用12～15小时；弃去包被液，用洗涤液洗涤2～3次，每次3min，甩干洗涤液，每孔加封闭液120μl，置37℃下温育2小时；拍干，再置37℃下干燥30分钟，用锡箔封口膜将抗原包被板封闭，置2～8℃下保存。

[0113] 4、结果判定值的确定：

[0114] 通过对32份已知背景的猪肺炎原体阴性样品进行检测，得到结果，求其平均值标准偏差SD＝0.068，确定阴阳性临界点为 检测样品的OD630值≥0.38则判定为阳性，OD630值＜0.38则判定为阴性。

[0115] 5、猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法的使用步骤：

[0116] (1)包被：以纯化抗原最佳包被浓度包被酶标板为100μl/孔，置2～8℃下作用12～15小时。

[0117] (2)洗板：弃包被液，PBST洗涤液(配方：含0.05％Tween-20的PBS(配方见上，pH7.4))，200μl/孔，洗涤2～3次，每次3min。

[0118] (3)封闭：拍干酶标板，加入封闭液，120μl/孔，37℃孵育2h，封闭非特异性结合位点。

[0119] (4)洗板：弃封闭液，同步骤5(2)。

[0120] (5)加待检样品：拍干酶标板，加入待检样品，100μl/孔，设阴、阳性对照，37℃孵育30min。

[0121] (6)洗板：弃待检样品液，同步骤5(2)。

[0122] (7)加酶标抗体：拍干酶标板后加入HRP标记的羊抗猪酶标二抗(1∶15000倍稀释)，100μl/孔，37℃放置30min。

[0123] (8)洗板：弃酶标抗体，同步骤5(2)。

[0124] (9)显色：每孔加入底物显色液A、底物显色液B各1滴(约50μl)，室温避光显色15min。

[0125] (10)终止反应：每孔加入1滴(约50μl)终止液终止反应；

[0126] (11)测定OD630值：酶标仪测定波长为630nm时的OD值。

[0127] 实施例5猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法的特异性试验和重复性试验[0128] 1、猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法的特异性试验

[0129] 分别将猪繁殖与呼吸综合症病病毒(PRRSV，又称蓝耳病)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)、副猪嗜血杆菌(HSP)等阳性血清做1∶40倍稀释，同时设阴、阳性对照，分别用本发明的方法进行检测，OD630nm结果值均＜0.38，判定为阴性，说明本发明的方法对以上各种血清具有很好的特异性。结果见表3所述。

[0130] 表3：本发明对各种血清的检测结果

[0131]

[0132] 2、猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法的重复性试验

[0133] 用5块不同批次的包被抗原的酶标板同时检测3份阳性血清和2份阴性血清，结果显示：3份阳性血清的变异系数分别为5.4％，4.9％，2.49％，变异系数均小于10％。通过本发明重复性试验，表明本发明的ELISA方法重复性好。结果见表4。

[0134] 表4：(p46+p65)-ELISA的重复性试验

[0135]

[0136] 实施例6 猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法与PCR方法的比较[0137] 用本发明方法和美国爱德士生物科技有限公司研制的ELISA试剂盒同时对临床送检的92份血清进行平行检测，比较两者检测结果，结果见表5所述。

[0138] 表5显示：本发明方法共检出44份阳性样本，48份阴性样本，阳性检出率为47.8％(44/92)。美国爱德士生物科技有限公司研制的ELISA试剂盒共检测出42份阳性样品，50份为阴性样品，阳性检出率45.7％(42/92)；两种方法的总符合率91.3％(84/92)。

[0139] 表5：本发明ELISA检测方法与美国爱德士生物科技有限公司

[0140] 研制的ELISA试剂盒的方法的结果比较

[0141]

[0142] 实施例7 猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒的组装

[0143] 1、猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒包括：

[0144] (1)抗原包被板 2块(96孔/块)

[0145] (2)阴性对照血清 1管(1ml/管)

[0146] (3)阳性对照血清 1管(1ml/管)

[0147] (4)羊抗猪酶标二抗 1瓶(20ml/瓶)

[0148] (5)样品稀释液 1瓶(50ml/瓶)

[0149] (6)底物显色液A 1瓶(10ml/瓶)

[0150] (7)底物显色液B 1瓶(10ml/瓶)

[0151] (8)终止液 1瓶(10ml/瓶)

[0152] (9)20倍浓缩洗涤液 1瓶(30ml/瓶)

[0153] (10)血清稀释板 2块(96孔/块)

[0154] (11)说明书 1份

[0155] 2、相关试剂的配制：

[0156] 样品稀释液：牛血清白蛋白5g、吐温20 0.5ml、氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g和硫柳汞钠0.2g，先用注射用水溶解并定容至1000ml，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0157] 浓缩洗涤液：NaCl 170g，Tween-20 10ml，加注射用水溶解并定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤除菌，得到20倍浓缩洗涤液，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0158] 羊抗猪酶标二抗：将羊抗猪IgG-HRP酶标抗体，用保护剂按体积比1∶15000稀释成工作浓度，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0159] 底物显色液A：Na2HPO4.12H2O 14.6g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH值至5.0～5.4，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0160] 底物显色液B：四甲基联苯胺20mg，加入无水乙醇10ml溶解，再用注射用水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0161] 终止液：将2.5ml氢氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0162] 保护剂：BSA0.5g、蔗糖2g，加注射用水溶解并定容至100ml，置2～8℃保存备用。

[0163] 3、猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤：

[0164] (1)取抗原包被板(根据样品多少，可拆开分次使用)，用稀释好的洗涤液洗板2次，再将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清各取100μl加至抗原包被板中，待检血清设1孔，阴、阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样品，置37℃下温育30分钟。

[0165] (2)弃去板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，洗涤2～3次，每次3min。

[0166] (3)每孔加羊抗猪酶标二抗100μl，置37℃下温育30分钟。

[0167] (4)弃去板孔中的溶液，洗涤3～5次，方法同(2)。

[0168] (5)每个反应孔加入底物显色液A一滴(约50μl)、底物显色液B一滴(约50μl)，混匀，置室温(20～25℃)下避光显色15分钟。

[0169] (6)每个反应空中加入终止液一滴(约50μl)，10分钟内于酶标仪上测定波长为630nm时OD值。

[0170] (7)结果判定：阴、阳性对照的OD值是反应试剂盒质量和试验操作规范的重要标志，申请人选择临床通过IDEXX的ELISA检测试剂盒检测抗体效价达到1∶160以上的阳性血清，解剖后肺脏有明显的猪肺炎支原体病变的猪血清，用保护剂进行10倍稀释即为标准阳性血清。取临床通过IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阴性、解剖后肺脏无任何猪肺炎支原体病变的猪血清，用样品稀释液进行10倍稀释即为标准阴性血清。ELISA试验成立的条件是阳性对照OD630nm值≥0.6，阴性对照OD630nm值＜0.2。阳性对照、阴性对照必须控制在这个范围内，否则检测结果无效。

[0171] 尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。

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