一种海南大风子抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途

摘要

一种海南大风子抗肿瘤有效组分提取物，它是由海南大风子果实粉碎后用70%-95%的乙醇加热提取，提取液蒸馏回收乙醇，然后加水分散，乙酸乙酯萃取，萃取物过硅胶柱分离，以不同比例的二氯甲烷和甲醇洗脱。在二氯甲烷-甲醇20∶1部位得海南大风子抗肿瘤有效组分提取物。该提取物具有明显的抑制人神经胶质瘤细胞U251的作用，可以用于制备抗肿瘤药物。本发明公开了其制法。

权利要求

1.一种海南大风子抗肿瘤有效组分提取物，其特征是：它是由海南大风子果实粉碎后除油，用70%-95%的乙醇加热回流提取，提取液蒸馏回收乙醇，然后加水分散，用乙酸乙酯萃取，萃取物过硅胶柱，依次以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合溶剂洗脱，在二氯甲烷-甲醇比例20∶1 部分的洗脱液经蒸去溶剂得海南大风子抗肿瘤有效组分提取物。

2.一种制备权利要求1 所述海南大风子抗肿瘤有效组分提取物的方法，其特征是它包括如下步骤：步骤1.将海南大风子果实粉碎后除油；

步骤2.将步骤1 所得的大风子药材以70%-95%的乙醇加热回流提取，冷却，过滤，浓缩提取液得浸膏；

步骤3.将步骤2 的浸膏加水分散，以乙酸乙酯萃取，萃取液蒸馏回收溶剂后，得乙酸乙酯萃取物；

步骤4.将步骤3 的乙酸乙酯萃取物过硅胶柱，以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合溶剂洗脱，在二氯甲烷-甲醇比例为20∶1 部分的洗脱液经蒸去溶剂得海南大风子抗肿瘤有效组分提取物。

3.根据权利要求2 所述的制备海南大风子抗肿瘤有效组分提取物的方法，其特征是：步骤1所述的除油是果肉压榨除油或果肉用石油醚提取除油。

4.权利要求1 所述的海南大风子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4 所述的海南大风子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是：所述的抗肿瘤药物是抗人神经胶质瘤细胞U251 药物。

说明书

一种海南大风子抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及海南大风子抗肿瘤有效组分提取物、含有它的药物组合物及其制法和用途。

背景技术

[0002] 肿瘤是当今世界上危害人类健康的最严重疾病之一，世界各国的专家学者都在积极研究寻找治疗肿瘤的方法和药物，尤其对中药中抗肿瘤物质的研究十分活跃，有关这方面的动物实验及初步临床观察表明中药中多种物质对动物移植肿瘤有较强的抑制作用，能增强机体的免疫功能，减轻放疗、化疗的毒性反应。

[0003] 大风子科植物全世界约有86属850种，主要分布于热带和亚热带地区，极少数延至温带地区，在我国分布有6族12属45种6变种。大风子科植物的生物活性主要有抗癌和抗病毒活性，水提物和醇提物也表现出较好的降血糖、降血脂及中和神经毒的作用(柴兴云,陆亚男,任宏燕，等.中国中药杂志，2006，31(4):269．)。大风子在我国主要分布于海南及广西部分地区，具有祛风湿、攻毒杀虫之功效，临床多用于麻风、疹癣、杨梅疮等症。

[0004] 印度学者Sharma DK等较早地从印度大风子Hydnocarpus wightiana中分离得到3个黄酮木脂素类成分:hydnowightin,hydnocarpin和neohydnocarpin。(Sharma DK,Ranganathan KR,Parthasarathy MR,et al.Plant Med,1979,37(1):79)这三种黄酮木脂素均有降低血清甘油三酸酯的作用，Hydnocarpin具有明显的抗炎作用。此外，这三3
种化合物均有抗鼠类L-1210淋巴白血病，KB鼻咽肿瘤，结肠腺癌，HeLa-S，和骨肉瘤的作用。三种均不能抑制肺癌细胞。Hydnocarpin可以抑制神经胶质瘤细胞。Hydnocarpin和neohydnocarpin可以抑制Tmolt3白血病。

[0005] 中国专利申请CN03138732.2《一种治疗癌症的药物》，CN200810146656.9《一种治疗癌症的药物》，CN200910143487.8《治疗子宫颈癌的中药制剂》，CN200910134392.X《治疗肿瘤中药方》涉及了大风子联合其他中药的共同抗肿瘤作用，但均将大风子作为传统中药方剂中的某一味药，未涉及大风子自身抗肿瘤活性部位。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一是，提供一种海南大风子抗肿瘤有效组分提取物及其制备方法。

[0007] 本发明的目的之二是，提供所述有效组分提取物在制备抗肿瘤及其相关药物中的应用。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 一种海南大风子抗肿瘤有效组分提取物，它是由海南大风子果实粉碎后除油，用70%-95%的乙醇加热回流提取，提取液蒸馏回收乙醇，然后加水分散，用乙酸乙酯萃取，萃取物过硅胶柱，依次以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合溶剂洗脱，在二氯甲烷-甲醇比例
20∶1部分的洗脱液经蒸去溶剂得海南大风子抗肿瘤有效组分提取物。该部位具有明显的抑制人神经胶质瘤细胞U251的作用，可以用于制备抗肿瘤药物。

[0010] 一种制备上述海南大风子抗肿瘤有效组分提取物的方法，它包括如下步骤：

[0011] 步骤1.将海南大风子果实粉碎后除油；

[0012] 步骤2.将步骤1所得的大风子药材以70%-95%的乙醇加热回流提取，冷却，过滤，浓缩提取液得浸膏；

[0013] 步骤3.将步骤2的浸膏加水分散，以乙酸乙酯萃取，萃取液蒸馏回收溶剂后，得乙酸乙酯萃取物；

[0014] 步骤4.将步骤3的乙酸乙酯萃取物过硅胶柱，以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合溶剂洗脱。在二氯甲烷-甲醇比例为20∶1部分的洗脱液经蒸去溶剂得海南大风子抗肿瘤有效组分提取物。

[0015] 上述的制备海南大风子抗肿瘤有效组分提取物的方法，步骤1所述的除油可以是果肉压榨除油或果肉用石油醚提取除油。

[0016] 上述的制备海南大风子抗肿瘤有效组分提取物的方法，所述的果肉用石油醚提取除油是将步骤2所得浸膏加水分散后用石油醚萃取。

[0017] 本发明进一步提供了海南大风子抗肿瘤有效部位在制备抗肿瘤药物中的应用。以抑制人神经胶质瘤细胞U251的增值能力作为活性指标进行抗肿瘤活性实验。实验结果表明，在体外细胞毒试验中，可以明显抑制U251的增值，具有细胞毒作用，可用于制备抗肿瘤治疗药物。

[0018] 有益效果

[0019] （1）本发明的优点和效果在于采用溶剂提取、萃取，硅胶柱等常规方法，从海南大风子中提取得到了具有抗肿瘤作用的有效组分。该有效组分经实验证明具有体外抑制人神经胶质瘤细胞U251生长的活性。

[0020] （2）本发明以海南大风子作为抗肿瘤药物，具体到其抗肿瘤的活性部位，为更好研究其抗肿瘤机制奠定思路，为中药现代化起了推动作用。

具体实施方式

[0021] 以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0022] 实施例1.海南大风子抗肿瘤有效组分提取物的制备

[0023] 将海南大风子果实5kg脱壳，果肉以压榨机去油，果壳粉碎后与去油后药渣合并。用95%乙醇回流提取2小时，乙醇量为大风子质量的3倍，过滤后的残渣重复提取1次，过滤，合并两次乙醇提取液30L，回收乙醇至近无醇味，继续浓缩至600ml，加水分散，加等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液2400ml，回收乙酸乙酯，约得乙酸乙酯提取物约100g。取20g乙酸乙酯提取物,过硅胶柱，依次以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇（100∶1，
50∶1，20∶1）作为洗脱剂进行洗脱。各洗脱液减压浓缩后至60℃真空干燥箱中烘干，得二氯甲烷-甲醇比例为20∶1的洗脱部分为大风子抗肿瘤有效组分提取物。

[0024] 实施例2.海南大风子抗肿瘤有效组分提取物的制备

[0025] 将海南大风子果实5kg粉碎，以石油醚（60-90℃）冷浸2小时，石油醚用量为大风子质量的2倍。取下层药渣，再次以石油醚冷浸2小时。下层药渣用80%乙醇回流提取3小时，乙醇量为大风子质量的3倍，过滤后的残渣重复提取1次，过滤，合并两次乙醇提取液，回收乙醇至近无醇味，继续浓缩至600ml，加水分散，加等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液2400ml，回收乙酸乙酯，约得乙酸乙酯提取物约100g。取20g乙酸乙酯提取物,过硅胶柱，依次以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇（100∶1，50∶1，20∶1）作为洗脱剂进行洗脱。各洗脱液减压浓缩后至60℃真空干燥箱中烘干，得二氯甲烷-甲醇比例为20∶1的洗脱部分为大风子抗肿瘤有效组分提取物。

[0026] 海南大风子抗肿瘤有效部位提取物经过液相制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，初步判定主要含有大风子素及其他未知物。

[0027] 实施例3.海南大风子抗肿瘤有效组分提取物的制备

[0028] 将海南大风子果实5kg粉碎，用95%乙醇回流提取2小时，乙醇量为大风子质量的3倍，过滤后的残渣重复提取1次，过滤，合并两次乙醇提取液，回收乙醇至近无醇味，继续浓缩至600ml，加水分散，加等体积的石油醚萃取3次。水层加等体积的乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，约得乙酸乙酯提取物约100g。取20g乙酸乙酯提取物,过硅胶柱，依次以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇（100∶1，50∶1，20∶1）作为洗脱剂进行洗脱。各洗脱液减压浓缩后至60℃真空干燥箱中烘干，得二氯甲烷-甲醇比例为20∶1的洗脱部分为大风子抗肿瘤有效组分提取物。

[0029] 实施例4.海南大风子抗肿瘤有效部位提取物的制备

[0030] 将海南大风子果实100g粉碎，以石油醚冷浸2小时，石油醚量为大风子量的2倍。取下层药渣，再次以石油醚冷浸2小时。下层药渣用95%乙醇回流提取2小时，乙醇量为大风子质量的3倍，过滤后的残渣重复提取1次，过滤，合并两次乙醇提取液，回收乙醇至近无醇味，继续浓缩至50ml，加水分散，加等体积的石油醚萃取2次。加等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，约得乙酸乙酯提取物约10g。取2g乙酸乙酯提取物,过硅胶柱，依次以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇（100∶1，50∶1，20∶1）作为洗脱剂进行洗脱。各洗脱液减压浓缩后至60℃真空干燥箱中烘干，得二氯甲烷-甲醇比例为20∶1的洗脱部分为大风子抗肿瘤有效组分提取物。

[0031] 海南大风子抗肿瘤有效组分提取物经过液相制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，初步判定主要含有大风子素及其他未知物。

[0032] 实施例5.抗肿瘤活性实验

[0033] 以实施例1得到的海南大风子抗肿瘤有效组分提取物为受试药物。

[0034] 体外培养人神经胶质瘤细胞U251，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500r/4
min离心5min,将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至2*10 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，仿制细胞培养箱（37℃，5%CO2）中培养24小时。之后加入受试药物
20μl，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。分别在加药24小时，48小时，72小时时，每孔加入5mg/mlMTT试剂20μl，继续置于37℃培养4小时。每孔加入DMSO100μl，振荡混匀，测定各孔在波长570nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）*100%。

[0035] 表1海南大风子提取物抗肿瘤活性实验（U251）