中药瑞香及其提取物在制药中的新用途

摘要

本发明公开了中药瑞香及其提取物在制备丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂和治疗丙型肝炎药物中的应用，瑞香及瑞香提取物对丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶具有较强的抑制作用，乙酸乙酯和正丁醇提取物浸膏浓度在100mg/ml时，对丙型肝炎蛋白酶的抑制率分别为70.5%和65.4%，可用于制备丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂和治疗丙型肝炎的药物。

权利要求

1.中药瑞香作为唯一原料药及其提取物在制备丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂和治疗丙型肝炎药物中的应用；所述提取物为中药瑞香的乙酸乙酯和正丁醇提取物。

2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：所述乙酸乙酯和正丁醇提取物的提取方法为：取中药瑞香植物全株，粉碎，用乙醇加热回流提取3次，合并提取液，浓缩成浸膏，用水分散，先用乙酸乙酯萃取，然后用正丁醇萃取，分别浓缩，得乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏，即得。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述乙醇的浓度为80～95%。

4.按照权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于：所述中药瑞香是瑞香科瑞香属植物Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.的全株。

说明书

中药瑞香及其提取物在制药中的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及中药技术领域，特别是涉及中药瑞香及其提取物在制药中的新用途。

背景技术

[0002] 人体感染丙型肝炎病毒所致的丙型肝炎，已成为全球最棘手的健康问题,目前全世界已有1.7亿人感染。若无药物的治疗,长期感染丙型肝炎病毒将发展成为慢性肝炎、
肝坏死、肝癌等疾病。当前最有效的治疗方法是聚乙二醇干扰素联合利津巴韦，该方法对于广大发展中国家普遍存在的I型丙型肝炎治疗有效率低于50%,长期使用干扰素存在许多
副作用，如：白细胞、血小板、嗜中性白血球的减少和抑郁症等；长期使用利津巴韦，也将产生溶血性贫血等副作用，使得患者不能持续治疗，因此发展独特、有效、更安全的丙型肝炎治疗药物尤为紧迫。

[0003] 丙型肝炎病毒蛋白酶NS3/4A 在病毒圆熟过程中起着重要的作用，已被证实是发现丙型肝炎药物的有效靶点之一。目前三种丙型肝炎NS3/4A蛋白酶抑制剂，BILN
2061,VX-950和SCH 503034，已被临床证实疗效显著，但多为肽类抑制剂，合成困难，并有一定的毒副作用。

[0004] 中药瑞香（Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.）系瑞香科瑞香属常绿灌木，又名麝囊，蓬莱花，雪花、夺香花，野梦花、山梦花，雪地开花、红总管、雪冻花。主要分布于四川、贵州、云南等地海拔1000-3100米的山坡灌丛或草坡中，具有治咽喉肿痛，齿痛，风湿痛等功效。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有治疗丙型肝炎的药物合成困难、副作用多的缺陷，提供中药瑞香及其提取物在制备丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂和治疗丙型
肝炎药物中的应用。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

[0007] 本发明提供中药瑞香及其提取物在制备丙型肝炎病毒NS4/4A蛋白酶抑制剂和治疗丙型肝炎药物中的应用。

[0008] 上述的应用中，所述提取物为中药瑞香的有机溶剂提取物。

[0009] 上面所说的有机溶剂提取物是指采用甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷中一种或两种以上溶剂混合提取中药瑞香所得的提取物。优选使用乙酸乙酯和正丁醇提取。

[0010] 乙酸乙酯和正丁醇提取物的提取方法：取瑞香植物全株，粉碎，用乙醇加热回流提取3次，合并提取液，浓缩成浸膏，用水分散，先用乙酸乙酯萃取，然后用正丁醇萃取，分别浓缩，得乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏，即得。

[0011] 上述提取方法中所用乙醇的浓度为80～95%。

[0012] 前述应用中所述的中药瑞香是瑞香科瑞香属植物Daphne papyracea Wall. exSteud. var. crassiuscula Rehd.的全株。

[0013] 申请人对瑞香提取物的体外抗丙型肝炎活性进行了测试，具体如下；

[0014] 测试原理：荧光法

[0015] 检测仪器：TECAN GENios

[0016] 受试药物：实施例1中的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物，分别、浓缩干燥成干浸膏。

[0017] 试剂盒:SensoLyte 520 HCV蛋白酶试剂盒 (批号：AK71145-1011，美国圣何塞AnaSpec。)

[0018] 蛋白酶：HCV NS3/4A蛋白酶 (批号：046-079，美国圣何塞 AnaSpec)

[0019] 测试溶液的配制(按试剂盒说明手册操作)：

[0020] 缓冲溶液：将2X实验缓冲液（Component D）、1M DDT（Component F）和去离子水按1：0.06：1进行混合，冰浴备用。

[0021] HCV NS3/4A蛋白酶底物溶解：加0.12 ml的DMSO (Component C)到HCV NS3/4A蛋TM
白酶底物[Ac-Asp-Glu-Dap(QXL 520)-Glu-Glu-Abu-COO-Ala-Ser-Cys

[0022] (5-FAMsp)-NH2]（Component A）, 作为储备液-20℃冻存。每次实验前取储备液，用缓冲溶液按1：100比例稀释，现配现用。

[0023] HCV NS3/4A蛋白酶溶液：用缓冲溶液将蛋白酶溶液稀释20或60倍。

[0024] 测定方法(按试剂盒说明手册操作)：在384孔黑色平板 (美国BD Falcon公司)中，先分别加入底物空白溶液（Substrate Control，SC）、溶剂空白溶液（Vehicle Control，VC）、阳性对照（Positive Control, PC）、 抑制剂对照(Inhibitor Control, IC)、测试化合物对照(Test Compound Control, TCC), 再加入HCV NS3/4A蛋白酶和底物。每个浓度均为
3个复孔，震荡混匀后，室温下暖孵30分钟,经TECAN GENios在激发波长485nm和发射波
长535nm下测试荧光强度。实验结果见表1。

[0025] 抑制率计算公式：

[0026] 抑制率% = 100×（FAverage VC-Average SC- FAverage sample-Average SC）/ FAverage VC-Average SC[0027] 式中的F 为对照组和样品组荧光值，抑制率及IC50的计算通过微软Windows Excel软件完成。

[0028] 表1 瑞香提取物对HCV NS3/4A蛋白酶的抑制作用 (n=3)

[0029]组别 （100mg/mL） （10mg/mL） （1mg/mL） IC50(mg/ml)
瑞香乙酸乙酯提取物 70.5±0.02%
瑞香正丁醇提取物 65.4±0.45%
Embelin（PC） 100.2±0.1% 63.7±3.2% 14.0±4.4% 6.0

[0030] * 数据为：平均值±相对标准偏差（ 三次独立实验值）

[0031] 目前离体实验认为，单体化合物的IC50在10mg/ml以下就具有较强的抗HCVNS3/4A蛋白酶作用。对瑞香乙酸乙酯和正丁醇两种提取物的HCV NS3/4A蛋白酶测试结果
显示：在100mg/ml浓度时，两种提取物对HCV NS3/4A蛋白酶抑制率分别达70.5%和65.4%，
对HCV NS3/4A蛋白酶有较好的抑制作用，可用于研制预防和治疗丙型肝炎药物。

[0032] 与现有技术相比，本发明发现中药瑞香及其提取物对丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶具有较强的抑制作用，乙酸乙酯和正丁醇提取物浸膏浓度在100mg/ml时，对丙型肝炎病