本发明提供了分离并纯化促性腺激素类糖蛋白亚基的方法，其包括：(1)取含有促性腺激素的溶液与尿素混合，放置，然后稀释；(2)取上述稀释液直接上样于用平衡缓冲液平衡的亲和层析柱，收集流出液，然后加入平衡缓冲液，收集流出液，合并流出液中含促性腺激素alpha亚基的级分；(3)然后，加入洗脱缓冲液，收集洗脱液，合并洗脱液中含促性腺激素beta亚基的级分。
1.分离并纯化促性腺激素α亚基和β亚基的方法，其由如下步骤组成：（1）取含有促性腺激素的溶液与尿素混合，放置，然后稀释；
（2）取步骤（1）得到的稀释液直接上样于用平衡缓冲液平衡的亲和层析柱，收集流出液，然后加入平衡缓冲液，收集流出液，合并流出液中含促性腺激素alpha亚基的级分；
（3）然后，向亲和层析柱加入洗脱缓冲液，收集洗脱液，合并洗脱液中含促性腺激素beta亚基的级分，其中，促性腺激素是促卵泡激素。
2.权利要求1所述的方法，其中，促性腺激素是重组人促卵泡激素。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中含有促性腺激素的溶液中促性腺激素的浓度为1~100mg/ml。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中稀释后促性腺激素的浓度为0.01~1mg/ml。
5.权利要求3所述的方法，其中步骤（1）中含有促性腺激素的溶液中促性腺激素的浓度为3~30mg/ml。
6.权利要求5所述的方法，其中步骤（1）中含有促性腺激素的溶液中促性腺激素的浓度为8~15mg/ml。
7.权利要求6所述的方法，其中步骤（1）中含有促性腺激素的溶液中促性腺激素的浓度为10mg/ml。
8.权利要求4所述的方法，其中步骤（1）中稀释后促性腺激素的浓度为0.03~0.3mg/ml。
9.权利要求8所述的方法，其中步骤（1）中稀释后促性腺激素的浓度为0.08~0.15mg/ml。
10.权利要求9所述的方法，其中步骤（1）中稀释后促性腺激素的浓度为0.1mg/ml。
11.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中混合后尿素的浓度为6~10M。
12.权利要求11所述的方法，其中步骤（1）中混合后尿素的浓度为7~9M。
13.权利要求12所述的方法，其中步骤（1）中混合后尿素的浓度为8M。
14.权利要求1所述的方法，其中放置温度为50~70℃；和/或，放置时间为5~15分钟。
15.权利要求14所述的方法，其中放置温度为55~68℃。
16.权利要求15所述的方法，其中放置温度为60~67℃。
17.权利要求16所述的方法，其中放置温度为65℃。
18.权利要求14所述的方法，其中放置时间为7~12分钟。
19.权利要求18所述的方法，其中放置时间为10分钟。
20.权利要求1所述的方法，其中亲和层析是琼脂糖凝胶亲和层析。
21.权利要求20所述的方法，其中亲和层析是CNBr-activated Sepharose 4B琼脂糖凝胶亲和层析。
22.权利要求1所述的方法，其中平衡缓冲液是含中性盐的弱碱性缓冲液。
23.权利要求22所述的方法，其中平衡缓冲液为含NaCl的pH7.5~8.5的缓冲液。
24.权利要求23所述的方法，其中平衡缓冲液为含0.4~0.6M NaCl的pH7.5~8.5的Tris-HCl缓冲液。
25.权利要求24所述的方法，其中平衡缓冲液为含0.5M NaCl的pH8.0的Tris-HCl缓冲液。
26.权利要求1所述的方法，其中步骤（2）中上样和/或加入的流速是5~35 ml/min。
27.权利要求26所述的方法，其中步骤（2）中上样和/或加入的流速是10~30 ml/min。
28.权利要求27所述的方法，其中步骤（2）中上样和/或加入的流速是20ml/min。
29.权利要求1所述的方法，其中洗脱缓冲液是酸性缓冲液。
30.权利要求29所述的方法，其中洗脱缓冲液是pH2.5~5.5的柠檬酸盐缓冲液或pH2.5~5.5的甘氨酸缓冲液。
31.权利要求30所述的方法，其中洗脱缓冲液是pH 3.0~4.5的柠檬酸盐缓冲液或pH
32.权利要求1~31之任一所述的方法，其中分离并纯化出的促性腺激素alpha亚基和/或beta亚基的纯度大于98%。
33.权利要求32所述的方法，其中分离并纯化出的促性腺激素alpha亚基和/或beta亚基的纯度大于99%。
一种分离纯化促性腺激素类糖蛋白亚基的方法
发明领域
[0001] 本发明是中国专利申请第201110269900.2号的继续申请，属于蛋白质纯化领域，具体而言，本发明涉及分离并纯化促性腺激素类糖蛋白亚基的方法。
背景技术
[0002] 促性腺激素(gonadotropins)是一类调节脊椎动物性腺发育，促进性激素生成和分泌的糖蛋白激素，主要包括促卵泡激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、绒毛膜促性腺激素(HCG)和促甲状腺激素(TSH)。促黄体生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)由垂体前叶分泌，两者协同作用，刺激卵巢或睾丸中生殖细胞的发育及性激素的生成和分泌；绒毛膜促性腺激素(HCG)由人胎盘分泌，可促进妊娠黄体分泌孕酮。怀孕初期尿中即可出现HCG，于妊娠两个月时达高峰，临床常以此作为妊娠指标。目前，重组人促卵泡激素也已由多家公司研制并上市用于治疗不排卵者和辅助生殖技术超排卵者。
[0003] 促性腺激素(LH，FSH，HCG和TSH)均由alpha(α)及beta(β)两个亚基(肽链)通过非共价键组合而成，并含有糖基，糖基部分通过共价键结合于肽链上的天冬酰胺残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基上。人的LH、FSH、HCG与TSH的alpha-肽链结构相同，均由92个氨基酸组成，含10个半胱氨酸，连接成5个二硫键，并且含有2个N-糖基化位点，可以在重组生产过程中互相替代使用；而beta-肽链互不相同。另外，在药物研发过程中，由于促性腺激素是一类结构非常复杂的糖蛋白，而且糖基对这些蛋白的生物学功能的性能及稳定性都起着决定性因素，因此如果要分离纯化这些亚基，就不能破坏其糖基结构。
[0004] Amoresano等人描述了利用反相-高效液相层析(RP-HPLC)来分离并纯化促性腺激素各亚基的方法[参见Amoresano，A.，Siciliano，R.，Orrù，S.，Napoleoni，R.，Altarocca，V.，De Luca，E.，Sirna，A.，and Pucci，P.(1996).Structural characterization of human recombinant glycohormones follitropin，lutropin and choriogonadotropin expressed in Chinese hamster ovary cells.Eur.J.Biochem.242，608-618.]。该方法用Vydac C4柱(25*0.46cm，5μm)进行RP-HPLC进行纯化，两亚基上样后在B相经25分钟由洗脱液的变化梯度中被分别洗脱出来。然而，RP-HPLC通常用于小规模的分离鉴定，分离成本高，同时规模小，不适合产业化要求。而且，该方法使用的洗脱液包含对人体有害的三氟乙酸和乙腈，其中三氟乙酸具有强烈性刺激气味、挥发性强，可吸入、口服或经皮肤吸收入人体，引起烧灼感、咳嗽、喘息、喉炎、气短、头痛、恶心、呕吐、皮肤灼伤等，甚至引起肺水肿而致人死亡；而乙腈极易挥发，吸入体内后可引起乙腈中毒，造成人体衰弱、无力、面色灰白、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、胸闷、胸痛，严重的引起循环系统紊乱，呼吸浅、慢而不规则，血压下降，脉搏细而慢，体温下降，甚至阵发性抽搐，昏迷。
[0005] 本发明人研发了不同于现有技术的促性腺激素亚基分离的方法，使用一个层析柱就完成分离促性腺激素中两个亚基的过程，而且层析过程中不使用对人体有害和对环境有污染的试剂。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题在于提供不同于现有技术的促性腺激素两个亚基的分离方法。其中，层析过程避免使用了对人体有害和对环境有污染的试剂，而且简便、快速、成本低、产物纯度高而降解小。
[0007] 具体而言，本发明提供了分离并纯化促性腺激素alpha亚基和beta亚基的方法，其包括：
[0008] (1)取含有促性腺激素的溶液与尿素混合，放置，然后稀释；
[0009] (2)取步骤(1)得到的稀释液直接上样于用平衡缓冲液平衡的亲和层析柱，收集流出液，然后加入平衡缓冲液，收集流出液，合并流出液中含促性腺激素alpha亚基的级分；
[0010] (3)然后，向亲和层析柱加入洗脱缓冲液，收集洗脱液，合并洗脱液中含促性腺激素beta亚基的级分。
[0011] 优选在本发明的方法中，促性腺激素是促卵泡激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、绒毛膜促性腺激素(HCG)或促甲状腺激素(TSH)，优选是FSH，更优选是重组人FSH(rhFSH)。在本发明的具体实施方式中，采用的是中国专利申请第201110269900.2号所述的rhFSH作为原料。
[0012] 优选在本发明的方法中，步骤(1)中含有促性腺激素的溶液中促性腺激素的浓度为1～100mg/ml，优选为3～30mg/ml，更优选为8～15mg/ml，最优选为10mg/ml。
[0013] 优选在本发明的方法中，步骤(1)中稀释后促性腺激素的浓度为0.01～1mg/ml，优选为0.03～0.3mg/ml，更优选为0.08～0.15mg/ml，最优选为0.1mg/ml。
[0014] 优选在本发明的方法中，步骤(1)中混合后尿素的浓度为6～10M，优选为7～9M，最优选为约8M。
[0015] 经本发明人研究发现，放置的时间和温度与杂质的产生有相当大的关联。因此，优选在本发明的方法中，放置温度为50～70℃，优选为55～68℃，更优选为60～67℃，最优选为65℃。也优选在本发明的方法中，放置时间为5～15分钟，优选为7～12分钟，最优选为10分钟。
[0016] 可以潜在使用的亲和层析介质数量非常多，已经商业化的数量也很多。经本发明人研究，优选在本发明的方法中，亲和层析是琼脂糖凝胶亲和层析，优选为CNBr-activated Sepharose 4B琼脂糖凝胶亲和层析。该凝胶介质可以通过商业渠道购买。
[0017] 优选在本发明的方法中，平衡缓冲液是含中性盐的弱碱性缓冲液，优选为含NaCl的pH7.5～8.5的缓冲液，更优选为含0.4～0.6MNaCl的pH7.5～8.5的Tric-HCl缓冲液，如，含0.5M NaCl的pH8.0的Tric-HCl缓冲液。
[0018] 优选在本发明的方法中，步骤(2)中上样和/或加入的流速是5～35ml/min，优选是10～30ml/min，最优选是20ml/min。
[0019] 优选在本发明的方法中，洗脱缓冲液是酸性缓冲液，如，pH2.5～5.5(优选pH3.0～4.5)的柠檬酸盐缓冲液或pH2.5～5.5(优选pH 3.0～4.5)的甘氨酸缓冲液。
[0020] 优选本发明的方法分离并纯化出的促性腺激素alpha亚基和/或beta亚基的纯度大于98％，优选大于99％。
[0021] 为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了现有技术文献(如，中国专利申请第201110269900.2号)，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
附图说明
[0022] 图1流出液的检测图谱。
[0023] 图2洗脱液的检测图谱。
具体实施方式
[0024] 以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《蛋白质技术手册》(科学出版社，2000)等手册和相关药物法规、规定以及本文所引用的参考文献和所用的试剂、载体等的厂商说明来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
[0025] FSH可以是取提取自哺乳动物(人)尿液的经纯化的FSH，也可以是重组制备的FSH，在本实施例中，优选使用中国专利申请第201110269900.2号实施所纯化得到的rhFSH，超滤浓缩至浓度为10mg/ml。取浓缩后的rhFSH溶液10ml，加入9M的尿素溶液90ml，混匀后放于65℃水浴10分钟(经我们测试，放置时间如果大于15分钟将有显著的FSH降解杂质产生)，然后将溶液置于室内冷却至室温(25℃)，直接加入水(而不用缓冲液)稀释至体积为1000ml。
[0026] 以琼脂糖凝胶CNBr-activated Sepharose 4B(GE Healthcare公司，其上含有FSH beta亚基的单克隆抗体(Abnova公司))，根据厂商说明，装层析柱(柱直径5cm，高20cm)，经含0.5M NaCl的10mM Tric-HCl(pH8.0)缓冲液平衡后，以20ml/min的流速上样上述稀释的rhFSH溶液，直接收集流出液，上样完成后继续以20ml/min的流速用含0.5M NaCl的10mM Tric-HCl(pH8.0)缓冲液上样10min并收集流出液，合并流出液中具有FSH alpha亚基蛋白活性的峰(流出液的检测图谱如图1所示，其中各峰无重叠，箭头所指的峰是流出液中具有FSHalpha亚基蛋白活性的峰，该峰经SDS-PAGE检测分子量，表明保留rhFSH alpha亚基的糖基化模式；经RP-HPLC检测，FSH alpha亚基纯度为99.3％，其中在检测图谱约32～36分钟处有一个几乎察觉不到的小峰，经鉴定为FSH-alpha亚基被氧化而产生的氧化亚基杂质。可见采用本发明的方法制备，几乎没有杂质产生)。然后，以20ml/min的流速向层析柱添加50mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)进行洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液中具有FSH beta亚基蛋白活性的峰(洗脱液的检测图谱如图2所示，其中各峰无重叠，箭头所指的峰是流出液中具有FSH beta亚基蛋白活性的峰，该峰经SDS-PAGE检测分子量，表明保留rhFSH beta亚基的糖基化模式；经RP-HPLC检测，FSH b eta亚基纯度为99.9％)。上样后的洗脱过程耗时仅约10分钟，即可完成具有商业价值的分离规模。
