无色杆菌属D-12及其在微生物降解乙草胺中的应用

摘要

本发明提供了一株新型高效降解酰胺类除草剂乙草胺的无色杆菌属（Achromobacter sp.）D-12及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2012年9月27日，保藏编号为CCTCC No：M 2012386。本发明所述无色杆菌属D-12可通过直接投加的方式应用于水体中乙草胺的降解，能安全、高效、快速的降解水体中残留的乙草胺，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

权利要求

1.无色杆菌属（Achromobacter sp.）D-12，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2012年9月27日，保藏编号为CCTCC No：M 2012386。

2.如权利要求1所述的无色杆菌属D-12在微生物降解乙草胺中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在23~ 44℃、pH 5.0 ~ 9.0、黑暗条件下进行。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解在30℃、pH7.0、150rpm黑暗条件下进行。

说明书

无色杆菌属D-12及其在微生物降解乙草胺中的应用

（一）技术领域

[0001] 本发明涉及一株新型高效降解酰胺类除草剂乙草胺的无色杆菌属（Achromobacter sp.）D-12及其应用。
(二）背景技术

[0002] 乙草胺（Acetochlor）是一种广泛应用的除草剂，主要用于玉米、大豆、花生、棉花、马铃薯等作物的除草，由美国孟山都公司于1971年开发成功，是目前世界上使用最广泛的除草剂品种之一，也是目前我国使用量最大的除草剂之一。乙草胺的分子式为C14H20ClNO2，结构式如下所示。

[0003]

[0004] 由于乙草胺具有中等到较高的水溶性及相对较低的土壤吸附常数，所以施到农田的酰胺类除草剂，容易通过渗透转移到浅层地下水或随雨水径流进入地表水，对水体环境造成污染。毒理学研究表明，乙草胺具有致癌性和较强的水生毒性，能导致遗传、生殖等毒性，且表现出对映体选择性。考虑到乙草胺对人体的潜在危害，以及地表水中乙草胺降解产物对人体的危害，乙草胺在1994年被美国环境保护局定为B-2类致癌物,规定在1个月的监测期,在20个监测井的地下水中残留浓度不得超过0.1μg/L；欧盟委员会决定不允许乙草胺再进行农药登记，已下令欧盟成员国在2012年7月23日取消其登记。乙草胺属我国规定的危险化学品，危险货物编号为61901。

[0005] 由于乙草胺的用量较高且使用时间较长，在地表水、地下水和土壤的样品中均能检测到一定浓度的乙草胺。因此研究乙草胺的去除方法就显得十分迫切和重要。

[0006] 微生物降解具有去除效率高、处理费用低、二次污染小等特点，逐渐被广泛应用于有毒污染物的降解和净化。采用微生物降解处理乙草胺的关键之一便是获得具有高效降解乙草胺能力的菌株。目前，国内外学者已对烷烃类化合物的生物降解进行了大量研究，但由于乙草胺结构较稳定、结构中含有氯原子，迄今分离到的乙草胺降解菌还比较有限，主要包括副球菌属（Paracoccus）、红杆菌科（Catellibacterium caeni）、食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）等。

[0007] 本发明中的无色杆菌（Achromobacter）是一种常见的短杆菌，经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用无色杆菌降解乙草胺的报道。该降解菌的发现对于工业废水中乙草胺的净化具有重要意义。（三）发明内容

[0008] 本发明目的是提供一株新型高效无色杆菌属乙草胺降解菌－－无色杆菌属（Achromobacter sp.）D-12及其应用。

[0009] 本发明采用的技术方案是：

[0010] 无色杆菌属（Achromobacter sp.）D-12，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2012年9月27日，保藏编号为CCTCC No：M2012386。

[0011] 所述无色杆菌属D-12的16S rDNA的Genbank登陆号为JX878617。

[0012] 本发明无色杆菌属D-12（Achromobacter sp.D-12）菌株的筛选与鉴定：

[0013] 1）培养基

[0014] 无机盐培养液终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl1g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，(NH4)2SO41.5g，MgSO40.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4·H2O0.13g，ZnCl20.23g，CuSO4·H2O0.03g，CoCl2·6H2O0.42g，Na2MoO4·2H2O0.15g，AlCl3·6H2O0.05g，溶剂为水。

[0015] 富集培养液：在无机盐培养液中加入乙草胺，使得乙草胺的终浓度为100mg/L。

[0016] LB液体培养基：每升培养液中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

[0017] LB固体培养基：每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

[0018] 2）菌株分离纯化

[0019] 污泥样品采自杭州农药厂，取5g污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液100ml中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

[0020] 取最后一次培养所得的培养液5ml进行梯度稀释（10-4、10-5、10-6），取各个稀释后的培养液150μl涂布于含100mg/L乙草胺的LB固体培养基平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含100mg/L乙草胺的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养（30℃，150rpm）过夜，将培养好的菌液离心（6000rpm，5min）后接至富集培养液中23~44℃培养5d，通过高效液相色谱法（HPLC）检测各富集培养液中乙草胺的残留量，最后筛选获得一株能高效降解乙草胺的菌株，命名为D-12。

[0021] 3）菌株鉴定

[0022] 将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为(0.25~0.5)×(0.8~1.0)μm，菌落平坦，中间凸起，边缘扩散，呈淡黄色。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Achromobacter属，因此为无色杆菌属D-12（Achromobacter sp.D-12）。

[0023] 本发明还涉及所述的无色杆菌属D-12在微生物降解乙草胺中的应用。

[0024] 所述降解在23~44℃、pH5.0~9.0、黑暗条件下进行，一般需振荡培养。优选的，所述降解在30℃、pH7.0、150rpm黑暗条件下进行。

[0025] 在乙草胺终浓度为10mg/L的无机盐培养液中，再加入含无色杆菌属D-12的细胞悬液构成反应体系，在23~44℃、pH值为5.0~9.0的条件黑暗振荡培养5d，即可使反应液中乙草胺的质量残留量小于5%；所述含无色杆菌属D-12的细胞悬液加入量为使反应体系中7 8
无色杆菌属D-12终浓度为5×10~1×10 个/ml。

[0026] 实际应用中，所述菌株通常需要经过活化和扩大培养，具体过程如下：

[0027] （1）斜面培养：将无色杆菌属D-12接种于斜面培养基，23~44℃培养5~7天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂15.0g/L，溶剂为水；

[0028] （2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养液中，23~44℃培养5~7天，获得种子液；所述无机盐培养液终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl1g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，(NH4)2SO41.5g，MgSO40.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4·H2O0.13g，ZnCl20.23g，CuSO4·H2O0.03g，CoCl2·6H2O0.42g，Na2MoO4·2H2O0.15g，AlCl3·6H2O0.05g，溶剂为水；

[0029] （3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接种量接种至LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期，获得菌液，将菌液离心，弃上清，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含无色杆菌属D-12的细胞悬液，该细胞悬液可投加于水体中用于乙草胺的降解；所述LB液体培养基终浓度组成为：每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为水，自然pH值。

[0030] 本发明菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量菌体（即含菌细胞培养液）在600nm处的吸光度值来表示。

[0031] 本发明采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养液中乙草胺的残留量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为乙腈：水=75:25（体积比），分析柱为Waters C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速为1ml/min，进样量为20μl，柱温为30℃。

[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

[0033] 本发明所述无色杆菌属D-12可通过直接投加的方式应用于水体中乙草胺的降解，能安全、高效、快速的降解水体中残留的乙草胺，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。（四）附图说明

[0034] 图1为本发明乙草胺降解菌的电镜图；

[0035] 图2为乙草胺的标准曲线图；

[0036] 图3为本发明的乙草胺降解菌在纯培养条件下对浓度为10~50mg/L的乙草胺的降解曲线图；

[0037] 图4为本发明的乙草胺降解菌在乙草胺浓度为10mg/L纯培养条件下的生长曲线图。

[0038] 图5为本发明的乙草胺降解菌在不同pH条件下对浓度为10mg/L的乙草胺的降解曲线图；

[0039] 图6为本发明的乙草胺降解菌在不同温度条件下对浓度为10mg/L的乙草胺的降解曲线图。（五）具体实施方式

[0040] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0041] 实施例1：菌株的筛选与鉴定

[0042] 1）培养基

[0043] 无机盐培养液：NaCl1g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，(NH4)2SO41.5g，MgSO40.1g，1ml微量元素溶液，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4·H2O0.13g，ZnCl20.23g，CuSO4·H2O0.03g，CoCl2·6H2O0.42g，Na2MoO4·2H2O0.15g，AlCl3·6H2O0.05g，用蒸馏水补足至1000ml。

[0044] 富集培养液：在无机盐培养液中加入乙草胺溶液，使得乙草胺的浓度为100mg/L。

[0045] LB培养液：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

[0046] LB固体培养基：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

[0047] 2）菌株分离纯化

[0048] 污泥样品采自杭州农药厂，取5g污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

[0049] 取最后一次培养所得的培养液少许进行梯度稀释，取稀释后的培养液150μl涂布于含100mg/L乙草胺的LB固体平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于LB固体平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体试管中振荡培养（30℃，150rpm）过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养5d，通过高效液相色谱法（HPLC）检测各富集培养液中乙草胺的残留量，最后筛选获得一株能高效降解乙草胺的菌株，命名为D-12（CCTCC No：M2012386）。

[0050] 3）菌株鉴定

[0051] 将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为（0.5μm～1.0μm）×（1.5μm～2.0μm），菌落平滑，呈淡黄色。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Achromobacter属。

[0052] 实施例2：含菌细胞悬液的制备

[0053] （1）斜面培养：将无色杆菌属D-12接种于斜面培养基，30℃培养6天，获得菌体斜面；所述斜面培养基按如下组成配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，水1000ml；

[0054] （2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养液中，30℃培养6天，获得种子液；所述无机盐培养液终浓度组成同实施例1；

[0055] （3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接种量接种至LB液体培养基（100mL）中，30℃、150rpm振荡培养至对数生长期，获得菌液，将菌液离心（6000rpm，5min），弃上清，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含无色杆菌属D-129
细胞悬液100mL，其中细胞悬液中的无色杆菌属D-12浓度为1~2×10 个/ml；

[0056] 所述LB液体培养基终浓度组成同实施例1；pH为7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲液的配方为：取0.2mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用超纯水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌（121℃、20min）后即得。

[0057] 实施例3：乙草胺降解实验

[0058] 1）无机盐培养液中菌体浓度与乙草胺含量的检测：

[0059] 菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量培养液中菌体在600nm处的吸光度值来表示。

[0060] 本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养液中乙草胺的残留量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为乙腈：水=75:25（体积比），分析柱为Waters C18色谱柱（4.6×250mm，5μm)，流速为1ml/min，进样量为20μl，柱温为30℃。

[0061] 2）乙草胺降解实验：

[0062] 取4个250ml锥形瓶，各加入100ml无机盐培养液，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入乙草胺，使乙草胺浓度均为10mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分8
别接种于此无机盐培养液中，使无色杆菌属D-12终浓度为0.5~1×10 个/ml，分别于23，
30，37，44℃培养摇床（pH7.0，150rpm），每天定时取样测定残留乙草胺浓度，结果见图6。

[0063] 取5个250ml锥形瓶，各加入100ml无机盐培养液，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入乙草胺，使乙草胺浓度均为10mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，8
分别接种于此无机盐培养液中，使无色杆菌属D-12终浓度为0.5~1×10 个/ml，分别于pH5.0，6.0，7.0，8.0，9.0培养摇床（30℃，150rpm），每天定时取样测定残留乙草胺浓度，结果见图5。

[0064] 取5个250ml锥形瓶，均加入100ml无机盐培养液，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入乙草胺，使乙草胺浓度分别为10、20、30、40、50mg/L，各取实施例2方法获得的含菌8
细胞悬液5ml，分别接种于此无机盐培养液中，使无色杆菌属D-12终浓度为0.5~1×10 个/ml，相应的设置3个不含该菌种的实验作为空白对照，然后一同置于摇床（30℃，pH7.0，
150rpm）中黑暗振荡培养。在培养时间为0、1、2、3、4、5d时定时取样，检测无机盐培养液中菌体的生长量与乙草胺的残留量，结果见图3和图4。

[0065] 将乙草胺标准品（浓度100mg/L）用无菌水溶解，在反相液相色谱测试标准曲线，乙2
草胺标准曲线如图2所示，标准曲线方程为（y=8.4961x-0.7536，R=0.9999，y为峰面积，x为乙草胺浓度）。本发明菌株对10~50mg/L浓度的乙草胺的降解曲线如图3所示，乙草胺浓度10mg/L时菌体的生长曲线如图4所示，图4可以看出OD600从0.2增加到0.5，说明菌体生长良好，观察图3，可以发现，培养5d后，本发明的乙草胺降解菌对10mg/L的乙草胺的降解率接近为100%，反应液中乙草胺的质量残留量分别为4.7%、3.8%和3.1%，所有未加菌的空白对照在5d后的水解率均小于5%。图5和图6表明该菌株最适宜的降解条件为pH值
7.0，温度30℃。

[0066] 实验结果表明该菌种对浓度10~50mg/L的乙草胺具有非常好的降解能力，而且此菌种为新型乙草胺降解菌，因此，该菌对研究乙草胺的降解途径与降解基因具有非常大的促进作用，对环境中乙草胺的降解尤其是对乙草胺的集中修复具有一定的积极意义。