食品及饮料中杏成分实时荧光PCR鉴定方法

摘要

本发明公开了一种杏成分检测用引物与探针、其使用方法及应用。该方法针对杏核糖体18S？rRNA基因序列，设计了杏基因的检测用引物和探针，采用实时荧光PCR法对食品及饮料中杏成分的定性检测。本发明所研制的食品及饮料中杏成分的实时荧光PCR法定性检测方法、对提高食品中杏成分成份的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验技术具有重要意义，具有广阔发展前景。

权利要求

1.一种杏成分实时荧光PCR 检测试剂盒，其特征在于：包括下述杏成分检测用引物与探针：上游引物：SEQ ID NO.1

下游引物：SEQ ID NO.2

探针：FAM-5’-CTGTCTCTGCCTATGCCTCCA-3’-TAMRA。

2. 一种杏成分及其制品的实时荧光PCR 鉴伪方法，其特征在于：利用权利要求1 所述的引物与探针，对样品DNA 进行实时荧光PCR 方法检测。

3. 根据权利要求2所述的杏成分及其制品的实时荧光PCR 鉴伪方法，其特征在于：利用权利要求1 所述的引物和探针，分别对样品按下述方法进行实时荧光PCR 检测：①实时荧光PCR 反应体系：

浓度为10 μg/mL-100 μg/mL的样品DNA 2 μL

10 μmol/L引物 各1 μL

5 μmol/L探针 1 μL

5 U/μL Taq DNA聚合酶 0.5 μL

10 μmol/L dNTP 1 μL

10×PCR缓冲液 2.5 μL水 16 μL反应体系总体积为25μL，其中：

②实时荧光PCR 反应参数：95℃，10s，1 个循环；95℃，5s ；52℃，10s ；72℃，34s ；40 个循环。

说明书

食品及饮料中杏成分实时荧光PCR鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明属于食品质量控制领域，具体涉及一种食品及饮料中杏成分实时荧光PCR鉴定方法。

背景技术

[0002] 杏普遍栽培于世界温带地区，杏原产中国，遍植于中亚、东南亚及南欧和北非的部分地区。杏肉除了供人们鲜食之外，还可以加工制成杏脯、糖杏罐头、杏干、杏汁、杏酒、杏青梅、杏话梅、杏丹皮等；杏仁可以制成杏仁霜、杏仁露、杏仁酪、杏仁酱、杏仁点心、杏仁酱菜等。

[0003] 近年来，不断有媒体曝光，一些商家所售卖的杏加工产品(如杏仁露、杏仁饮料等)，其价格明显比商场里的要低很多，甚至比成本价还低。实际上是一些不法商家由于某些杏的成本较高，为了更多的经济利益，便会用假货冒充成本较高的真货销售欺骗消费者，或者在不加入杏成分的前提下，虚假标注产品中含有杏成分。由于国家质监面临无法可依的窘境。也尚无权威的鉴定机构可以对食品或饮料中的杏成分进行鉴定。

[0004] 随着近年来，人们对食品的安全卫生特别重视，食品卫生指标尤其是杏产品中是否真正含有杏等原料的真伪鉴定就显得特别重要。为了尽量减轻假杏产品的不良影响，力求避免人民的合法利益受到侵害，而造成更加不利的影响。由此，急需一种食品及饮料中杏成分简便、快速的检测方法。目前我国在食品及饮料中杏成分检测方法仍是个空白，在保证方法稳定性、特异性等方面存在很多困难，这也是制约方法建立的瓶颈。

发明内容

[0005] 为了解决上述实际问题，本发明建立了一种食品、饮料中杏成分检测方法研究，进行杏制品检测技术研究。采用TaqMan探针技术，能够对食品或饮料中的杏成分成份进行鉴定。该标准的研制成功及推广应用对提高进出口食品及饮料中的杏成分成份的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验技术具有重要意义。

[0006] 本发明从以下几个方面研究：提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用杏品种的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，直接读取实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和原料中杏成分及其制品的鉴伪检测等，在此基础上，进行了特异性和稳定性检测；

[0007] 本发明的具体技术方案如下：

[0008] 本发 明所 述的 杏（Armeniaca vulgaris）为蔷 薇科(Rosaceae) 李亚 科(Prunoideae)杏属植物(Arm eniaca M ill.)。全世界杏属植物划分为6个地理生态群和24个区域性亚群，共有10个种。中国有普通杏(A rm eniaca vulgaris Lam.)、西伯利亚杏A.sibirica(L.)Lam、辽杏A.mandshurica(Maxim.)Skv.、藏杏A.holosericea(Betal.)Kost.、紫 杏 A.dasy2 carpa(Ehrh.)Borkh.、志 丹 杏 (A.zhidanensis)C.Z.Qiao、梅(A.mume)Sieb.、政和杏(A.zhengheensis)ZhangJ.Y.etLuM.N与李梅杏(A.lim eisis)Zhang J.Y.etWang Z.M这9个种。

[0009] 本发明的一方面在于：公开一种杏成分检测用引物与探针，其包括以下碱基序列：

[0010] 杏成分检测引物和探针的设计：

[0011] 针对杏核糖体18S rRNA基因序列设计检测用引物与探针。通过GenBank的Blast功能寻找杏核糖体18S rRNA基因（Genebank登录号普通杏AF318756.1，西伯利亚杏AF318739.1，辽杏AF318714.1）的同源基因，可见该基因具有很高的种属特异性，其他基因与该基因的同源性很小。

[0012] 据此设计了本发明用于检测的杏成分的检测引物和探针如下：

[0013] 杏成分检测引物和探针

[0014] 上游引物：5’-TCTGCCTCAACCGATA-3’ SEQ ID NO：1

[0015] 下游引物：5’-GGCGAACACGAAGAA-3’ SEQ ID NO：2

[0016] 探针：FAM-5’-CTGTCTCTGCCTATGCCTCCA-3’-TAMRA SEQ ID NO：3

[0017] 其 中 ：FAM（Carboxyfluorescein， 羧 基 荧 光 素）、TAMRA（Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明）；

[0018] 本发明的另一方面在于：一种杏成分检测试剂盒，其包括上文所述的杏成分检测用引物与探针。

[0019] 本试剂盒中还可以包括阳性对照、阴性对照、空白对照。其中，阳性对照可以选择杏提取的DNA，内参照可以选择真核生物18SrRNA基因DNA，阴性对照可以选择不含有杏成分的样品提取的DNA，空白对照可以选择灭菌水，也可以每组各设置两个或多个平行的反应体系。其中，

[0020] 质量控制标准为：以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

[0021] (a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

[0022] (b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

[0023] (c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。

[0024] (d)内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0

[0025] 结果判定标准为：在符合质量控制标准的情况下，被检样品进行检测时：如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性。如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性。如35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值≥40.0，则判定被检样品阴性。

[0026] 本发明的另一方面在于：一种杏成分及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其利用上文所述的引物与探针，对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测。

[0027] 对于上文所述的杏成分及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，所述的实时荧光PCR方法较优的选择如下：

[0028] ①实时荧光PCR反应体系：

[0029] 反应体系总体积为25μL，其中：

[0030]

[0031] ②实时荧光PCR反应参数：95℃，10s，1个循环；95℃，5s；52℃，10s；72℃，34s；40个循环。

[0032] 对于上文所述的杏成分及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，具体的，所述的样品DNA的制备方法为本领域技术人员所掌握的常规技术，可根据样品状态的不同，例如液体样品、固体样品而采取不同的提取方法，不仅可以选用商业途径可获得的DNA提取试剂盒，还可以使用CTAB法、碱裂解法等，具体操作还可以按照本发明实施例1所述的方法进行。

[0033] 对于提取的DNA浓度和纯度的测定：取步骤③获得的DNA溶液加水稀释，至浓度为10μg/mL~100μg/mL，A260/A280比值在1.7~1.9之间，备用。

[0034] 通过以上技术方案，本发明最后确定所述方法对杏成分的最低检出限（LOD）为10mg/kg。从而本发明不仅提供了一套特异性良好的引物和探针，还建立了对食品和饮料中杏成分及其制品鉴伪的定性检测方法。必定利于鉴定杏成分食品真伪工作的开展，具有广泛的应用价值，还能对我国相关食品的国际贸易起到积极的作用。

[0035] 有益效果

[0036] （1）解决了食品及饮料中杏成分检测方面的问题。建立了检测食品及饮料中杏成分鉴别真伪的方法。

[0037] （2）由大量的实际应用结果可见，本标准方法检测食品中杏成分具有很好适用性。

[0038] （3）本发明所述杏成分检测方法，采用TaqMan探针技术，此实时荧光检测系统能够实时监测反应进程，无需电泳，闭管操作，防止污染，并能够对结果进行快速判定。

[0039] （4）该方法的研制成功及推广应用对提高食品中杏成分的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测鉴定相关产品成分及检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验技术具有广泛的应用前景。

附图说明

[0040] 图1内参照基因实时荧光PCR检测结果图；

[0041] 图2杏成分检测结果图；其中：1.普通杏2.西伯利亚杏3.辽杏4.紫杏5.志丹杏6.政和杏7.李梅杏8.藏杏9.梅10-11阴性对照和空白对照。

[0042] 图3杏成分特异性检测结果；其中：1.普通杏2.西伯利亚杏3.辽杏4.紫杏5.志丹杏6.李梅杏7.藏杏8.梅；9-37对照表1中其它阴性结果、阴性对照和空白对照。

[0043] 图4杏成分初加工产品添加实验灵敏度检测结果；其中，1.200mg/kg 2.100mg/kg3.50mg/kg 4.20mg/kg 5.10mg/kg 6.空白对照。

具体实施方式

[0044] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0045] 实施例1

[0046] （一）待测样品：检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以杏成分样品提取的DNA为阳性对照，以已知不含有杏成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照，每组各设置两个平行的反应体系。

[0047] （二）检测方法

[0048] 下述DNA提取方法，均为本领域技术人员的常规操作，所有试剂及溶液均为常规途径制备或者由商业途径获得。

[0049] (1)果汁等液体样品DNA提取

[0050] 将果汁等液体样品上下颠倒均匀，使下层沉淀物与上层的液体充分混匀后再称取样品。取约30mL液体至一洁净培养皿中，抽真空冻干；称取0.2g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中，然后加入5mL CTAB提取液（20g/L CTAB，,1.4mol/L NaCL，0.1mol/L Tris-HCL，0.02mol/LNa2EDTA,pH8.0），65℃孵育1h，间期不断混匀几次；8000g 15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，14500g 10min，取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液（5g/L CTAB,40mmol/LNaCl），剧烈混匀30s，室温静置1h；14500g 20min，弃上清液，加入350μL1.2mol/LNaCl，剧烈振荡
30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500g 10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500g 20min，弃上清液，加入500μL 70%乙醇，混匀后，
14500g 20min，弃上清液，晾至风干，加入30μL ddH2O溶解，4℃贮存备用。

[0051] (2)固体样品DNA提取

[0052] 称取样品500mg于50mL离心管中，加入5mL裂解液，置于65℃温育2h，加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下12000g离心10min，转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1），颠倒混匀，室温下12000g离心10min，转移上清至另一灭菌的离心管中，加入0.8倍异丙醇或2倍体积的预冷无水乙醇混匀，-20℃放置0.5h～1h，4℃下12000g离心10min～15min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，4℃下12000g离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50μL双蒸水，溶解沉淀，保存。

[0053] (3)DNA浓度和纯度的测定：

[0054] 取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。当浓度为10μg/mL~100μg/mL，A260/A280比值在1.7~1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。

[0055] （2）实时荧光PCR检测

[0056] ①引物信息：

[0057] 扩增引物和探针：由宝生物工程(大连)有限公司合成；

[0058] 杏核糖体18S rRNA基因序列设计检测用引物与探针。（为方便描述以下简称杏成分引物/探针），真核生物18SrRNA基因内参照引物和探针（为方便描述以下简称内参照引物/探针）详见表1。

[0059] 其中：真核生物18SrRNA基因内参照的选取：杏属于真核生物。真核生物18SrRNA基因因为表达保守的基因，常在国家标准、ISO标准、各文献中作为真核生物PCR反应检测的内参照基因，用以验证实验是否有效。

[0060] 基因序列对应Genebank的登陆号：AB743827.1。

[0061] 表1试验用引物和探针

[0062]

[0063]

[0064] 其 中 ：FAM（Carboxyfluorescein， 羧 基 荧 光 素）、TAMRA（Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明）；

[0065] ②实时荧光PCR反应体系：

[0066] 反应体系总体积为25μL，其中含：样品DNA（10μg/mL-100μg/mL）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探针（5μmol/L）1μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，dNTP（10μmol/L）1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，水16μL。

[0067] 按照上述体系，分别以表1中所示引物和探针，分别提取的杏样品成分DNA、真核生物内参照的DNA、阴性对照及空白对照进行实时荧光PCR反应。

[0068] ③实时荧光PCR反应参数：95℃，10s，1个循环；95℃，5s，52℃，10s，72℃，34s，40个循环。

[0069] 检测仪器：ABI 7500实时荧光PCR仪，美国ABI公司；实验结果以附图说明中图谱形式输出。

[0070] （3）质量控制标准

[0071] 以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

[0072] (a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

[0073] (b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

[0074] (c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。

[0075] (d)内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0

[0076] （4）结果判定

[0077] 与物种鉴定检测国标、转基因检测等实时荧光PCR国标对结果判断的标准一致，本实验在符合质量控制的情况下，被检样品进行检测时：同样设置40个循环，Ct值即为循环数。如果Ct值≤35.0，表明样品在经过35个循环以内的扩增，即检测到扩增曲线，则判定为被检样品阳性。如Ct值≥40.0，表明样品经过40个循环扩增，仍没有扩增曲线，则判定为被检样品阴性。如35.0＜Ct值＜40.0，在此之间结果为可疑结果，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值≥40.0，则判定被检样品阴性。

[0078] 实时荧光PCR检测结果：

[0079] 内参照基因检测结果如图1，其中横坐标代表Ct值（Threshold Cycle，荧光域值）每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数称为Ct值。纵坐标代表OD值（optical density，光密度）表示被检测物吸收掉的光密度；曲线代表荧光扩增曲线，内参照基因实时荧光PCR检测结果图所示：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0，检测结果为阳性。

[0080] 实时荧光PCR法检测杏成分基因结果如图2和表2所示：其中1.普通杏2.西伯利亚杏3.辽杏4.紫杏5.志丹杏6.政和杏7.李梅杏8.藏杏9.梅检测结果，分别出现荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0，证明检测结果为阳性。

[0081] 表2杏成分实时荧光PCR法检测试验结果

[0082]序号样品名称 试验结果
1 普通杏 +
2 西伯利亚杏 +
3 辽杏 +
4 紫杏 +
5 志丹杏 +
6 政和杏 +
7 李梅杏 +
8 藏杏 +
9 梅 +

[0083] 实施例2特异性试验

[0084] 采用本标准方法检测样品（样品详单见表3），辽宁省果树科学研究所，国家果树种质熊岳李、杏圃，大连市农科院研究所，以及大连市各大超市和市场等，样品主要包括：普通杏、西伯利亚杏、辽杏、紫杏、志丹杏、李梅杏、藏杏、梅共计8种杏；李、桃、樱桃、苹果、草莓、梨、苹果、香蕉、海棠果、橙、蓝莓、杨桃、板栗、猕猴桃、山核桃、金桔、毛桃、鲜荔枝、葡萄、哈密瓜、山楂、柑桔、芒果、香瓜、沙枣、菠萝、柚子、杨梅等近种或非近种DNA样品。

[0085] 杏成分特异性检测部分结果如图3和表3所示。

[0086] 表3杏成分检测特异性试验结果

[0087]序号 样品名称 试验结果 序号 样品名称 试验结果
1 普通杏 + 20 杨桃 -
2 西伯利亚杏+ 21 板栗 -
3 辽杏 + 22 猕猴桃 -
4 紫杏 + 23 山核桃 -
5 志丹杏 + 24 葡萄 -
6 梅 + 25 鲜荔枝 -
7 李梅杏 + 26 毛桃 -
8 藏杏 + 27 金桔 -
9 菠萝 - 28 橙 -
10 沙枣 - 29 蓝莓 -
11 香瓜 - 30 山楂 -
12 芒果 - 31 哈密瓜 -
13 李 - 32 柑桔 -

[0088]14 桃 - 33 柿子 -
15 樱桃 - 34 杨梅 -
16 苹果 - 35 柚子 -
17 草莓 - 36 香蕉 -
18 梨 - 37 海棠果 -
19 苹果 -

[0089] 采用实施例1所述引物和探针分别检测表3中所列出的样品，根据实施例1所述的结果判定标准，对扩增曲线进行判定；表3杏成分特异性检测结果，其中引物SEQ ID NO：1、2、3对图中1.普通杏2.西伯利亚杏3.辽杏4.紫杏5.志丹杏6.李梅杏7.藏杏8.梅具有特异性扩增，分别出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。9-37对照表3中其它阴性结果，所对应的苹果等非目标基因检测结果显示，非目的基因均无荧光信号检出，检测结果均为阴性。

[0090] 由上述实验结果可见，该标准方法具有很好的特异性。

[0091] 实施例3检测灵敏度及添加试验

[0092] 以苹果为基质做初加工产品添加试验。分别取杏和苹果果实剪碎研磨后，把杏肉添加至苹果肉中混匀，先形成10％的添加样品。以此比例添加至新的苹果肉中直至分别形成含杏肉200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、20mg/kg、10mg/kg共5个梯度的添加样品。在添加过程中充分混匀，保证样品在苹果肉中均匀散布。

[0093] 根据实施例1所述的结果判定标准，对扩增曲线进行判定；添加试验结果：如图4杏成分初加工产品添加实验灵敏度检测结果显示，以苹果肉作为初加工产品基质，分别添加杏肉，制成添加浓度分别为200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、20mg/kg、10mg/kg（对应图4中的1.200mg/kg、2.100mg/kg、3.50mg/kg、4.20mg/kg、5.10mg/kg），分别按实施例1所述方法，提取各浓度添加样品的DNA，经实施例1所述的实时荧光PCR方法检测，从图4的结果可知，1~5不同浓度的各个样品均分别出现荧光曲线增幅现象，检测结果均为阳性，证明检测灵敏度可达到10mg/kg。

[0094] 实施例4方法的应用

[0095] 选取实际检测样品，样品来源为检验进出口送检样品，从农科所收集的样品，从大连市内各超市、市场、饮食小摊等处采购的食品等采用本标准方法检测杏源性成分。采用本发明实施例1所述方法检测杏成分，根据实施例1所述的结果判定标准，对扩增曲线进行判定；样品名称及结果如表4。

[0096] 表4实际样品检测结果

[0097]

[0098] 由以上检测结果可见，运用本标准方法检测实际样品共253份。其中检测杏、杏核、杏叶、杏仁等样品44份，都检测出杏成分；检测杏仁霜、杏仁露、杏仁糕、水果点心、果汁、杏罐头、水果罐头等样品89份，检测出含有杏成分样品39份，其中有2份样品分别标注为杏仁露和杏仁霜，但检测中未发现杏源性成分；检测杏仁、杏脯、话梅、果丹皮、水果糖、果脯等食品81份，有25份样品检测出含有杏成分。由大量的实际应用结果可见，本标准方法检测食品中杏品种具有很好适用性，可用以满足食品/饮品鉴伪的要求。