本发明提供了一种猕猴桃灵芝复合酵素及其制备方法，向以猕猴桃为主要原料的水果中引入灵芝菌，经过发酵工程及生物萃取技术处理，加工成营养价值更高的、保健效果更好的酵素食饮品。本发明所用原料为富含维生素C、多糖、氨基酸等有益成分的猕猴桃与珍贵药食用真菌灵芝组合，具有抗氧化，养胃肠，预防三高症，提高免疫力，预防癌症等多种生理活性；采用臭氧技术处理原料，可有效杀灭原料表面微生物，同时保证原料的完整性，营养物质及酶等活性物质成分不受影响；采用常温（26-34℃）多菌群、多阶段、多层次共发酵技术，实现对猕猴桃等活性物质的生物萃取，所制备的酵素食饮品兼有猕猴桃、灵芝等有效活性成分和各益生菌及其有益代谢产物。
1.猕猴桃灵芝复合酵素，其特征在于，所述复合酵素的制备方法包括以下步骤：
1）将去除表面柔毛的猕猴桃洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；将杀菌后沥干的猕猴桃打浆；
2）将水果洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；所述水果为刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓； 将杀菌后沥干的桔子、柠檬、火龙果去皮压烂；刺梨、梨、李子、苹果切成小块，果核或籽保留完好；将葡萄、草莓压烂，葡萄籽保留完好；
3）将处理好的猕猴桃、刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓分别按
70:4:4:2:2:5:2:3:5:5的重量比混合；
4）将西红柿洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；将杀菌后沥干的西红柿压烂；
a）斜面菌种培养：将灵芝菌接种斜面，28℃±1℃培养8d； b）液体菌种的制备：将斜面菌种直接转接至液体种子培养基中，28℃±1℃，150rpm振荡培养5-6d，制备得到液体种子液； c）扩大培养：将灵芝菌液体种子液按10%的接种量转接至扩大培养基中，28℃±1℃，
30rpm振荡培养20d，然后静置培养40d；6）乳酸菌混合发酵液的制备： d）斜面菌种培养：将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)分别接种斜面，
e）液体菌种的制备：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌斜面菌苔用无菌水制备成 菌悬液，按10%的接种量分别转接至液体种子培养
基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养12-24h；然后用无菌水调菌浓度为1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液； f）扩大培养：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养
g）将上述各乳酸菌发酵液按等比例混合，即得到乳酸菌混合发酵液；
h）斜面菌种培养：将柠檬形克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)接种斜面，
i）液体菌种的制备：将果酒酵母菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，125rpm振荡培养8-12h；然后用无菌水调整菌浓度为
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液； j）扩大培养：将果酒酵母液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，
30℃±1℃，75rpm振荡培养8-12h，制备得到酵母发酵液；
k）斜面菌种培养：将巴氏醋酸杆菌（Acetobacer pasteurianus）接种斜面，30℃±1℃培养24-36h，得到斜面醋酸杆菌； l）液体菌种的制备：将斜面醋酸杆菌用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，30rpm振荡培养24-36h；然后用无菌水调整菌浓度为
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液； m）扩大培养：将醋酸杆菌液体种子液按13%的接种量转接至 扩大培养基中，
30℃±1℃，30rpm振荡培养8-12h，制备得到醋酸菌发酵液；
9）将乳酸菌混合发酵液按每1000ml/100kg西红柿的量接入步骤4）处理好的西红柿中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
10）将酵母发酵液按每700ml/100kg水果的量接入步骤3）处理好的水果中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
11）将步骤9）和步骤10）中得到的发酵物与步骤5）的灵芝发酵物按6:1:3的重量比混合，在30±4℃的条件下密封发酵40-60d；
12）将步骤11）中得到的发酵物与步骤8）的醋酸菌发酵液按900ml醋酸菌发酵液/100kg发酵物的比例混合，在30±4℃的条件下密封发酵50-60d；最后将所得发酵物过滤，滤液经低温真空浓缩，即得猕猴桃灵芝复合酵素。
2.猕猴桃灵芝复合酵素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将去除表面柔毛的猕猴桃洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；将杀菌后沥干的猕猴桃打浆；
2）将水果洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；所述水果为刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓； 将杀菌后沥干的桔子、柠檬、火龙果去皮压烂；刺梨、梨、李子、苹果切成小块，果核或籽保留完好；将葡萄、草莓压烂，葡萄籽保留完好；
3）将处理好的猕猴桃、刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓分别按
70:4:4:2:2:5:2:3:5:5的重量比混合；
4）将西红柿洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；将杀菌后沥干的西红柿压烂；
a）斜面菌种培养：将灵芝菌接种斜面，28℃±1℃培养8d； b）液体菌种的制备：将斜面菌种直接转接至液体种子培养基中，28℃±1℃，150rpm振荡培养5-6d，制备得到液体种子液； c）扩大培养：将灵芝菌液体种子液按10%的接种量转接至扩大培养基中，28℃±1℃，
d）斜面菌种培养：将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)分别接种斜面，
e）液体菌种的制备：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌斜面菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量分别转接至液体种子培养基
中，37℃±1℃，35rpm振荡培养12-24h；然后用无菌水调菌浓度为1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液； f）扩大培养：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养
g）将上述各乳酸菌发酵液按等比例混合，即得到乳酸菌混合发酵液；
h）斜面菌种培养：将柠檬形克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)接种斜面，
i）液体菌种的制备：将果酒酵母菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，125rpm振荡培养8-12h；然后用无菌水调整菌浓度为
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液； j）扩大培养：将果酒酵母液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，
30℃±1℃，75rpm振荡培养8-12h，制备得到酵母发酵液；
k）斜面菌种培养：将巴氏醋酸杆菌（Acetobacer pasteurianus）接种斜面，30℃±1℃培养24-36h，得到斜面醋酸杆菌； l）液体菌种的制备：将斜面醋酸杆菌用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，30rpm振荡培养24-36h；然后用无菌水调整菌浓度为
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液； m）扩大培养：将醋酸杆菌液体种子液按13%的接种量转接至扩大培养基中，
30℃±1℃，30rpm振荡培养8-12h，制备得到醋酸菌发酵液；
9）将乳酸菌混合发酵液按每1000ml/100kg西红柿的量接入步骤4）处理好的西红柿中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
10）将酵母发酵液按每700ml/100kg水果的量接入步骤3）处理好的水果中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
11）将步骤9）和步骤10）中得到的发酵物与步骤5）的灵芝发酵物按6:1:3的重量比混合，在30±4℃的条件下密封发酵40-60d；
12）将步骤11）中得到的发酵物与步骤8）的醋酸菌发酵液按900ml醋酸菌发酵液/100kg发酵物的比例混合，在30±4℃的条件下密封发酵50-60d；最后将所得发酵物过滤，滤液经低温真空浓缩，即得猕猴桃灵芝复合酵素。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1）、步骤2）和步骤4）中使用的臭氧水浓度为4ppm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中a）使用的斜面培养基的配制方法为：向马铃薯浸汁200g/葡萄糖20g和琼 脂15g中加水1000ml，121℃高压灭菌
20-30min；所述马铃薯浸汁的配制方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1，煮沸30min，用纱布过滤，然后补足失水至1000ml，即得； b）中所述液体种子培养基的配制方法为：向马铃薯浸汁200g和葡萄糖20g中加水
1000ml，121℃高压灭菌20-30min；所述马铃薯浸汁的配制方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1，80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至1000ml，即得； c）中所述扩大培养基的配制方法为：向葡萄糖20g和打碎的刺梨200g中加水1000ml，
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤6）中d）使用的斜面培养基的配制方法为：向牛肉蛋白粉10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁
0.58g、硫酸锰0.28g和琼脂粉15g中加入蒸馏水1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌
e）中所述液体种子培养基的配制方法为：向牛肉膏8g、胰蛋白胨8g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g和吐温80ml中加入蒸馏水
1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌15-20min，即得； f）中所述扩大培养基的配制方法为：向牛肉膏8g、胰蛋白胨8g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g、吐温80ml和番茄汁10ml中加入蒸馏水1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌15-20min，即得。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤7）中h）使用的斜面培养基的配制方法为：向酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖、20g和琼脂粉15g中加入蒸馏水1000ml，
i）中所述液体种子培养基的配制方法为：12°麦芽汁，121℃高 压灭菌20min，即得； j）中所述扩大培养基的配制方法为：将12°麦芽汁970ml和猕猴桃汁30ml混合，
121℃高压灭菌20-30min，即得；所述猕猴桃汁由猕猴桃直接打浆获得。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤8）中k）使用的斜面培养基的配制方法为：向葡萄糖9g、酵母粉8g、碳酸钙5g和琼脂粉15g中加水1000mL，调pH5.5，0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精40mL，即得； l）中所述液体种子培养基的配制方法为：向葡萄糖10g和酵母粉9g中加水1000mL，调pH5.5，0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精40mL，即得； m）中所述扩大培养基的配制方法为：向葡萄糖10g和酵母粉9g中加水1000mL，调pH5.5，0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精50mL，即得。
8.根据权利要求2-7任一项所述的制备方法，其特征在于，选用的各种水果原料为成熟、无腐烂、无病害的新鲜或贮藏的果实。
猕猴桃灵芝复合酵素及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品工程领域，具体地说，涉及一种猕猴桃灵芝复合酵素及其制备方法。
背景技术
[0002] 酵素是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性的物质，它存在于所有活的动植物体内，是维持机体正常功能，消化食物，修复组织等生命活动的一种必需物质，几乎参与所有的生命活动。酵素分为酸化还原酵素、转移酵素、加水分解酵素、脱离酵素、异性化酵素和合成酵素等六大类。具有氧化作用、分解作用、新陈代谢作用、热能作用、净化血液作用、抗菌防御作用。
[0003] 酵素技术是一门集多菌群复合发酵、萃取技术为一体的新型高新技术。微生物发酵的传统食品如泡菜、豆瓣酱、纳豆、味噌等也可以称为酵素产品。但本项目研究的酵素特指以新鲜蔬菜、水果等植物为原料，经不同种类益生菌群多轮次发酵而制得的微生物制剂。因此，酵素食饮品含有来源于天然植物、微生物中的丰富酶系、维生素、矿物质以及具有广泛生理功效的活性物质、人体益生菌群等，具有调理肠胃、抗衰老、抗氧化、提高机体免疫力、调节血脂等广泛的生理作用等。
[0004] 国内外酵素发酵的技术工艺较多，共同特征如下：（1）生产酵素的原料大多为来自本地的具有某种特殊生理功效成分或高含某种营养素的优质果蔬。（2）发酵方式基本上都采用自然发酵或半自然发酵（参与酵素发酵的部分微生物为纯种接种）。（3）发酵工艺一般采用乳酸菌、酵母菌二次发酵法。
[0005] 酵素产品的生产原料及技术工艺使得酵素的生产及风味和品质具有鲜明的地域特点：（1）酵素生产原料主要是新鲜的水果和蔬菜，不同地貌、气候环境条件下果蔬的种类、品种以及品质存在巨大的差异。因此，来源于不同地域的果蔬原料酿造的酵素会有风味和品质上的差异。（2）酵素的酿造采用自然发酵或半自然发酵，生长于不同地貌、气候环境条件下的果蔬，其腐生、内生菌群会存在很大差异，导致酵素发酵微生物菌群生物学特性不同，进而发酵特性及其代谢产物等不同，最终影响酵素的风味和品质。（3）酵素酿造采用自然或半自然固态或半固态大池或大缸的常温发酵方式。因此，酵素发酵地的空气和水源中微生物以及气候条件对酵素发酵过程以及产品品质都会产生很大的影响。根据以上分析，酿造优质的酵素不仅需要先进的技术工艺，还需要优质的果蔬原料以及独特的环境、气候条件。
[0006] 目前，国内酵素产品市场尚处于培育阶段，潜在市场空间广阔。然而酵素生产工艺有待进一步改进和提升，以满足市场的大量需求。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种猕猴桃灵芝复合酵素及其制备方法。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的一种猕猴桃灵芝复合酵素，所述复合酵素的制备方法包括以下步骤：
[0009] 1）将去除表面柔毛的猕猴桃洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；将杀菌后沥干的猕猴桃打浆；
[0010] 2）将水果洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；所述水果为刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓；
[0011] 将杀菌后沥干的桔子、柠檬、火龙果去皮压烂；刺梨、梨、李子、苹果切成小块，果核或籽保留完好；将葡萄、草莓压烂，葡萄籽保留完好；
[0012] 3）将处理好的猕猴桃、刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓分别按70:4:4:2:2:5:2:3:5:5的重量比混合；
[0013] 4）将西红柿洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；将杀菌后沥干的西红柿压烂；
[0014] 5）灵芝发酵物的制备：
[0015] a）斜面菌种培养：将灵芝菌接种斜面，28℃±1℃培养8d；
[0016] b）液体菌种的制备：将斜面菌种直接转接至液体种子培养基中，28℃±1℃，150rpm振荡培养5-6d，制备得到液体种子液；
[0017] c）扩大培养：将灵芝菌液体种子液按10%的接种量转接至扩大培养基中，28℃±1℃，30rpm振荡培养20d，然后静置培养40d；
[0018] 6）乳酸菌混合发酵液的制备：
[0019] d）斜面菌种培养：将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)分别接种斜面，37℃±1℃培养24-32h；
[0020] e）液体菌种的制备：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌斜面菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量分别转接至液体种子培8 8
养基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养12-24h；然后用无菌水调菌浓度为1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液；
[0021] f）扩大培养：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养24-28h，制备得到各乳酸菌发酵液；
[0022] g）将上述各乳酸菌发酵液按等比例混合，即得到乳酸菌混合发酵液；
[0023] 7）酵母发酵液的制备：
[0024] h）斜面菌种培养：将柠檬形克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)接种斜面，30℃±1℃培养18-24h，得到果酒酵母菌苔；
[0025] i）液体菌种的制备：将果酒酵母菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，125rpm振荡培养8-12h；然后用无菌水调整菌浓度为8 8
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液；
[0026] j）扩大培养：将果酒酵母液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，30℃±1℃，75rpm振荡培养8-12h，制备得到酵母发酵液；
[0027] 8）醋酸菌发酵液的制备：
[0028] k）斜面菌种培养：将巴氏醋酸杆菌（Acetobacer pasteurianus）接种斜面，30℃±1℃培养24-36h，得到斜面醋酸杆菌；
[0029] l）液体菌种的制备：将斜面醋酸杆菌用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，30rpm振荡培养24-36h；然后用无菌水调整菌浓度为8 8
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液；
[0030] m）扩大培养：将醋酸杆菌液体种子液按13%的接种量转接至扩大培养基中，30℃±1℃，30rpm振荡培养8-12h，制备得到醋酸菌发酵液；
[0031] 9）将乳酸菌混合发酵液按每1000ml/100kg西红柿的量接入步骤4）处理好的西红柿中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
[0032] 10）将酵母发酵液按每700ml/100kg水果的量接入步骤3）处理好的水果中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
[0033] 11）将步骤9）和步骤10）中得到的发酵物与步骤5）的灵芝发酵物按6:1:3的重量比混合，在30±4℃的条件下密封发酵40-60d；
[0034] 12）将步骤11）中得到的发酵物与步骤8）的醋酸菌发酵液按900ml醋酸菌发酵液/100kg发酵物的比例混合，在30±4℃的条件下密封发酵50-60d；最后将所得发酵物过滤，滤液经低温真空浓缩，即得猕猴桃灵芝复合酵素。所述猕猴桃灵芝复合酵素可以制成饮品或猕猴桃灵芝复合酵素粉。
[0035] 其中，步骤1）、步骤2）和步骤4）中使用的臭氧水浓度为4ppm。
[0036] 本发明还提供一种猕猴桃灵芝复合酵素的制备方法，包括以下步骤：
[0037] 1）将去除表面柔毛的猕猴桃洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；将杀菌后沥干的猕猴桃打浆；
[0038] 2）将水果洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；所述水果为刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓；
[0039] 将杀菌后沥干的桔子、柠檬、火龙果去皮压烂；刺梨、梨、李子、苹果切成小块，果核或籽保留完好；将葡萄、草莓压烂，葡萄籽保留完好；
[0040] 3）将处理好的猕猴桃、刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓分别按70:4:4:2:2:5:2:3:5:5的重量比混合；
[0041] 4）将西红柿洗净，然后在臭氧水中进行过流式浸没杀菌；将杀菌后沥干的西红柿压烂；
[0042] 5）灵芝发酵物的制备：
[0043] a）斜面菌种培养：将灵芝菌接种斜面，28℃±1℃培养8d；
[0044] b）液体菌种的制备：将斜面菌种直接转接至液体种子培养基中，28℃±1℃，150rpm振荡培养5-6d，制备得到液体种子液；
[0045] c）扩大培养：将灵芝菌液体种子液按10%的接种量转接至扩大培养基中，28℃±1℃，30rpm振荡培养20d，然后静置培养40d；
[0046] 6）乳酸菌混合发酵液的制备：
[0047] d）斜面菌种培养：将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)分别接种斜面，37℃±1℃培养24-32h；
[0048] e）液体菌种的制备：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌斜面菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量分别转接至液体种子培8 8
养基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养12-24h；然后用无菌水调菌浓度为1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液；
[0049] f）扩大培养：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养24-28h，制备得到各乳酸菌发酵液；
[0050] g）将上述各乳酸菌发酵液按等比例混合，即得到乳酸菌混合发酵液；
[0051] 7）酵母发酵液的制备：
[0052] h）斜面菌种培养：将柠檬形克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)接种斜面，30℃±1℃培养18-24h，得到果酒酵母菌苔；
[0053] i）液体菌种的制备：将果酒酵母菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，125rpm振荡培养8-12h；然后用无菌水调整菌浓度为8 8
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液；
[0054] j）扩大培养：将果酒酵母液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，30℃±1℃，75rpm振荡培养8-12h，制备得到酵母发酵液；
[0055] 8）醋酸菌发酵液的制备：
[0056] k）斜面菌种培养：将巴氏醋酸杆菌（Acetobacer pasteurianus）接种斜面，30℃±1℃培养24-36h，得到斜面醋酸杆菌；
[0057] l）液体菌种的制备：将斜面醋酸杆菌用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，30rpm振荡培养24-36h；然后用无菌水调整菌浓度为8 8
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液；
[0058] m）扩大培养：将醋酸杆菌液体种子液按13%的接种量转接至扩大培养基中，30℃±1℃，30rpm振荡培养8-12h，制备得到醋酸菌发酵液；
[0059] 9）将乳酸菌混合发酵液按每1000ml/100kg西红柿的量接入步骤4）处理好的西红柿中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
[0060] 10）将酵母发酵液按每700ml/100kg水果的量接入步骤3）处理好的水果中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
[0061] 11）将步骤9）和步骤10）中得到的发酵物与步骤5）的灵芝发酵物按6:1:3的重量比混合，在30±4℃的条件下密封发酵40-60d；
[0062] 12）将步骤11）中得到的发酵物与步骤8）的醋酸菌发酵液按900ml醋酸菌发酵液/100kg发酵物的比例混合，在30±4℃的条件下密封发酵50-60d；最后将所得发酵物过滤，滤液经低温真空浓缩，即得猕猴桃灵芝复合酵素。
[0063] 其中，步骤1）、步骤2）和步骤4）中使用的臭氧水浓度为4ppm。
[0064] 步骤5）中a）使用的斜面培养基的配制方法为：向马铃薯浸汁200g/葡萄糖20g和琼脂15g中加水1000ml，121℃高压灭菌20-30min；所述马铃薯浸汁的配制方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1，煮沸30min，用纱布过滤，然后补足失水至1000ml，即得。
[0065] b）中所述液体种子培养基的配制方法为：向马铃薯浸汁200g和葡萄糖20g中加水1000ml，121℃高压灭菌20-30min；所述马铃薯浸汁的配制方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1，80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至1000ml，即得。
[0066] c）中所述扩大培养基的配制方法为：向葡萄糖20g和打碎的刺梨200g中加水1000ml，121℃高压灭菌20-30min，即得。
[0067] 步骤6）中d）使用的斜面培养基的配制方法为：向牛肉蛋白粉10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g和琼脂粉15g中加入蒸馏水1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌15-20min，即得。
[0068] e）中所述液体种子培养基的配制方法为：向牛肉膏8g、胰蛋白胨8g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g和吐温80ml中加入蒸馏水1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌15-20min，即得。
[0069] f）中所述扩大培养基的配制方法为：向牛肉膏8g、胰蛋白胨8g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g、吐温80ml和番茄汁10ml中加入蒸馏水1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌15-20min，即得。
[0070] 步骤7）中h）使用的斜面培养基的配制方法为：向酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖、20g和琼脂粉15g中加入蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌15-20min，即得。
[0071] i）中所述液体种子培养基的配制方法为：12°麦芽汁，121℃高压灭菌20min，即得。
[0072] j）中所述扩大培养基的配制方法为：将12°麦芽汁970ml和猕猴桃汁30ml混合，121℃高压灭菌20-30min，即得；所述猕猴桃汁由猕猴桃直接打浆获得。
[0073] 步骤8）中k）使用的斜面培养基的配制方法为：向葡萄糖9g、酵母粉8g、碳酸钙5g和琼脂粉15g中加水1000mL，调pH5.5。0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精
40mL，即得。
[0074] l）中所述液体种子培养基的配制方法为：向葡萄糖10g和酵母粉9g中加水1000mL，调pH5.5，0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精40mL，即得。
[0075] m）中所述扩大培养基的配制方法为：向葡萄糖10g和酵母粉9g中加水1000mL，调pH5.5。0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精50mL，即得。
[0076] 以上制备方法中选用的各种水果原料为成熟、无腐烂、无病害的新鲜或贮藏的果实。
[0077] 相对于现有技术，本发明的优点在于：
[0078] （一）制备本发明的猕猴桃灵芝复合酵素所用原料为富含维生素C、多糖、氨基酸等有益成分的猕猴桃与珍贵药食用真菌灵芝组合，具有抗氧化，养胃肠，预防三高症，提高免疫力，预防癌症等多种生理活性。
[0079] （二）采用臭氧技术处理原料，可有效杀灭原料表面微生物，同时保证原料的完整性，营养物质及酶等活性物质成分不受影响。
[0080] （三）采用常温（≤35℃）多菌群、多阶段、多层次共发酵技术，实现对猕猴桃等活性物质的生物萃取，所制备的酵素食饮品兼有猕猴桃、灵芝等有效活性成分和各益生菌及其有益代谢产物。
附图说明
[0081] 图1为本发明实施例1中猕猴桃灵芝复合酵素制备工艺流程图。
具体实施方式
[0082] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0083] 实施例 猕猴桃灵芝复合酵素的制备
[0084] 1.1原料的选择
[0085] 猕猴桃：选择已成熟，无腐烂、无病害的猕猴桃果实，可以是新鲜摘取的，也可以是贮藏的。
[0086] 其它水果：包括刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄、草莓，选择已成熟、无病害、无腐烂的果实，可以是新鲜摘取的，也可以是贮藏的。
[0087] 西红柿：选择已成熟，无腐烂、无病害的西红柿，可以是新鲜摘取的，也可以是贮藏的。
[0088] 1.2原料的前处理
[0089] 1.2.1猕猴桃的前处理
[0090] 1）挑选出坏、烂果，去除杂物和泥土；
[0091] 2）将猕猴桃清洗，去除表面柔毛，沥干，然后转入4ppm浓度的臭氧水中进行过流式浸没杀菌，取出沥干；
[0092] 3）将杀菌后沥干的猕猴桃打浆。
[0093] 1.2.2其它水果的前处理
[0094] 1）挑选出坏、烂果，去梗，去除杂物和泥土；
[0095] 2）清洗，沥干，然后转入4ppm浓度的臭氧水中进行过流式浸没杀菌，取出沥干；
[0096] 3）将杀菌处理的桔子、柠檬、火龙果去皮压烂；刺梨、梨、李子、苹果碎成小块，但果核或籽不要弄破；葡萄、草莓压烂，但葡萄籽不要弄破。
[0097] 1.2.3西红柿的前处理
[0098] 1）挑选出坏、烂西红柿，去除杂物和泥土；
[0099] 2）清洗，沥干，然后转入4ppm浓度的臭氧水中进行过流式浸没杀菌，取出沥干；
[0100] 3）将杀菌处理的西红柿压烂，单独装入一个已清洗、消毒的陶瓷缸中。
[0101] 1.3杀菌处理的原料混合
[0102] 将处理好的猕猴桃、刺梨、梨、火龙果、李子、桔子、柠檬、苹果、葡萄和草莓分别按70:4:4:2:2:5:2:3:5:5的重量比混合，装入另一个已清洗、消毒的陶瓷缸中。
[0103] 1.4灵芝发酵物的制备
[0104] a）斜面菌种培养：将灵芝菌接种斜面，28℃±1℃培养8d。
[0105] b）液体菌种的制备：将斜面菌种直接转接至液体种子培养基中，28℃±1℃，150rpm振荡培养5-6d，制备得到液体种子液。
[0106] c）扩大培养：将灵芝菌液体种子液按10%的接种量转接至扩大培养基中，28℃±1℃，30rpm振荡培养20d，然后静置培养40d。
[0107] 其中，a）中使用的斜面培养基的配制方法为：向马铃薯浸汁200g/葡萄糖20g和琼脂15g中加水1000ml，121℃高压灭菌20-30min；所述马铃薯浸汁的配制方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1，煮沸30min，用纱布过滤，然后补足失水至1000ml，即得。
[0108] b）中所述液体种子培养基的配制方法为：向马铃薯浸汁200g和葡萄糖20g中加水1000ml，121℃高压灭菌20-30min；所述马铃薯浸汁的配制方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1，80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至1000ml，即得。
[0109] c）中所述扩大培养基的配制方法为：向葡萄糖20g和打碎的刺梨200g中加水1000ml，121℃高压灭菌20-30min，即得。
[0110] 1.5乳酸菌混合发酵液的制备
[0111] d）斜面菌种培养：将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)分别接种斜面，37℃±1℃培养24-32h。
[0112] e）液体菌种的制备：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌斜面菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量分别转接至液体种子培8 8
养基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养12-24h；然后用无菌水调菌浓度为1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液。
[0113] f）扩大培养：分别将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，37℃±1℃，35rpm振荡培养24-28h，制备得到各乳酸菌发酵液。
[0114] g）将上述各乳酸菌发酵液按等体积比例混合，即得到乳酸菌混合发酵液。
[0115] 其中，d）中使用的斜面培养基的配制方法为：向牛肉蛋白粉10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g和琼脂粉15g中加入蒸馏水1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌15-20min，即得。
[0116] e）中所述液体种子培养基的配制方法为：向牛肉膏8g、胰蛋白胨8g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g和吐温80ml中加入蒸馏水1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌15-20min，即得。
[0117] f）中所述扩大培养基的配制方法为：向牛肉膏8g、胰蛋白胨8g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g、吐温80ml和番茄汁10ml中加入蒸馏水1000ml，调pH6.2～6.4，121℃高压灭菌15-20min，即得。
[0118] 1.6酵母发酵液的制备
[0119] h）斜面菌种培养：将柠檬形克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)接种斜面，30℃±1℃培养18-24h，得到果酒酵母菌苔。
[0120] i）液体菌种的制备：将果酒酵母菌苔用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，125rpm振荡培养8-12h；然后用无菌水调整菌浓度为8 8
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液。
[0121] j）扩大培养：将果酒酵母液体种子液按15%的接种量转接至扩大培养基中，30℃±1℃，75rpm振荡培养8-12h，制备得到酵母发酵液。
[0122] 其中，h）中使用的斜面培养基的配制方法为：向酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖、20g和琼脂粉15g中加入蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌15-20min，即得。
[0123] i）中所述液体种子培养基的配制方法为：12°麦芽汁，121℃高压灭菌20min，即得。
[0124] j）中所述扩大培养基的配制方法为：将12°麦芽汁970ml和猕猴桃汁30ml混合，121℃高压灭菌20-30min，即得；所述猕猴桃汁由猕猴桃直接打浆获得。
[0125] 1.7醋酸菌发酵液的制备
[0126] k）斜面菌种培养：将巴氏醋酸杆菌（Acetobacer pasteurianus）接种斜面，30℃±1℃培养24-36h，得到斜面醋酸杆菌。
[0127] l）液体菌种的制备：将斜面醋酸杆菌用无菌水制备成菌悬液，按10%的接种量转接至液体种子培养基中，30℃±1℃，30rpm振荡培养24-36h；然后用无菌水调整菌浓度为8 8
1×10-2×10cfu/mL，制备得到液体种子液。
[0128] m）扩大培养：将醋酸杆菌液体种子液按13%的接种量转接至扩大培养基中，30℃±1℃，30rpm振荡培养8-12h，制备得到醋酸菌发酵液。
[0129] 其中，k）中使用的斜面培养基的配制方法为：向葡萄糖9g、酵母粉8g、碳酸钙5g和琼脂粉15g中加水1000mL，调pH5.5。0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精40mL，即得。
[0130] l）中所述液体种子培养基的配制方法为：向葡萄糖10g和酵母粉9g中加水1000mL，调pH5.5，0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精40mL，即得。
[0131] m）中所述扩大培养基的配制方法为：向葡萄糖10g和酵母粉9g中加水1000mL，调pH5.5。0.1MPa灭菌20min；灭菌后加95%食用级酒精50mL，即得。
[0132] 1.8发酵
[0133] 1.8.1将乳酸菌混合发酵液按每1000ml/100kg西红柿的量接入上述处理好的西红柿中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
[0134] 1.8.2将酵母发酵液按每700ml/100kg水果的量接入1.3中处理好的水果中，搅拌混合，在30±4℃的条件下密封发酵60d；
[0135] 1.8.3将步骤1.8.1和1.8.2中得到的发酵物与上述灵芝发酵物按6:1:3的重量比混合，在30±4℃的条件下密封发酵40-60d；
[0136] 1.8.4将步骤1.8.3中得到的发酵物与上述醋酸菌发酵液按900ml醋酸菌发酵液/100kg发酵物的比例混合，在30±4℃的条件下密封发酵50-60d；最后将所得发酵物过滤，滤液经低温真空浓缩，即得猕猴桃灵芝复合酵素。所述猕猴桃灵芝复合酵素可以制成饮品或猕猴桃灵芝复合酵素粉。
[0137] 上述猕猴桃灵芝复合酵素的制备工艺流程如图1所示。
[0138] 本发明的猕猴桃灵芝复合酵素兼有猕猴桃、灵芝等有效活性成分（如富含微生物素C、氨基酸、灵芝多糖、SOD等）和益生菌（如嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌）及其有益代谢产物（如GABA、寡肽、氨基酸等）。这些天然来源的活性物质及益生菌具有滋养胃肠功能，平衡和稳定肠道正常微生物菌群的作用。同时具有抗氧化，提高免疫力，改善亚健康状态，预防高血脂、高血压、糖尿病，预防癌症的功效。
[0139] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
