一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂

摘要

本发明公开了一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂及其制法，该脂质体注射剂由盐酸平阳霉素、胆固醇琥珀酸酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、海藻糖和甘露醇制成。本发明的脂质体注射剂具有粒径大小合适分布均匀，并具有良好的稳定性、较高的包封率和较低的渗漏率，本发明的制备方法重现性好，适合于工业化大生产。

权利要求

1.一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂，其由以下重量配比的成分制成：且胆固醇琥珀酸酯与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺之间的重量比为1∶4。

2.根据权利要求1所述的盐酸平阳霉素脂质体注射剂，其特征在于盐酸平阳霉素的规格为4mg或8mg，其Zeta电位为-10～-60mV。

3.根据权利要求2所述的盐酸平阳霉素脂质体注射剂，其特征在于其Zeta电位为-20～-40mV。

4.根据权利要求2所述的盐酸平阳霉素脂质体注射剂，其特征在于其Zeta电位为-30mV。

5.一种制备权利要求1-4中任一项所述的盐酸平阳霉素脂质体注射剂的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）在50℃缓慢磁力搅拌下将胆固醇琥珀酸酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚氧乙烯40氢化蓖麻油溶于有机溶剂中，得到脂质溶液，将上述溶液冷冻干燥，直至干燥完全，得到形成疏松海绵状的干燥固体；

（2）将盐酸平阳霉素溶于缓冲溶液中，加入海藻糖，搅拌均匀得水相；

（3）在25℃下缓慢磁力搅拌下，将步骤1的固体加入步骤2的水相中，然后在600bar到900bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得盐酸平阳霉素脂质体；

（4）在氮气保护下，将步骤（3）制得的盐酸平阳霉素脂质体，用pH调节剂调节pH值至

7.0～9.0，在60℃水浴10～15分钟，然后将温度降至20～30℃在不断搅拌下加入甘露醇，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得盐酸平阳霉素脂质体注射剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述的有机溶剂为体积比为1：

3的乙醇和异丙醇的混合有机溶剂。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述冷冻干燥的过程为：在-50～-60℃预冻2～4小时，接着在-40℃～-50℃冷冻10～13小时，再经12～15小时升华至20℃～25℃，最后在30℃～35℃干燥6～8小时。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的缓冲溶液为pH值为5.8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述pH调节剂为氢氧化钾。

说明书

一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂

技术领域

[0001] 本发明涉及一种脂质体注射剂及其制法，具体涉及一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂及其制法，属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 血管瘤是人类最常见的良性肿瘤，肝脏的血管瘤是最常见的良性肿瘤之一。平阳霉素属于广谱的抗癌抗生素，由平阳霉菌产生，主要成分是博来霉素A5，能抑制胸腺嘧啶核苷进入DNA释放出游离核碱，并使之分解破坏，从而抑制DNA的合成和切断DNA链，干扰细胞的分裂繁殖，影响细胞代谢功能，促进细胞变化坏死。平阳霉素是一种较安全，副作用小，对造血系统和免疫系统功能基本无伤害的新型抗肿瘤药物。

[0003] 盐酸平阳霉素为白色结晶性粉末，在水中或甲醇中易溶，在乙醇中微溶，在丙酮、氯仿/三氯甲烷或乙醚中几乎不溶。盐酸平阳霉素化学名称为N＇-[3-[(4-氨基丁基)氨基]丙基]博来霉素酰胺盐酸盐，分子式：C57H89N19O21S2·nHCl，结构式如下： [0004]

[0005] 盐酸平阳霉素为2005年版《药典》二部中记载的质量检测标准的品种（用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以戊烷磺酸钠溶液－甲醇－乙腈(76∶16∶8)为流动相，按 外标法以峰面积计算供试品中盐酸平阳霉素的含量），目前上市的盐酸平阳霉素剂型主要为冻干粉针，普通工艺所制备的盐酸平阳霉素注射剂，物理和化学性质稳定性差，长期存放药品质量会下降而且还会生成一些杂质，带来毒副作用，给临床使用留下了隐患。 [0006] 专利CN1391901A公开了一种含平阳霉素的治疗血管瘤的注射剂，其由平阳霉素、0.5%利多卡因及地塞米松组成，其中平阳霉素占3～10mg、0.5%利多卡因3～10ml、地塞米松1～5mg。在药物配伍混合使用情况下，其稳定性不好，生物利用度也不够高。 [0007] CN101284127A公开一种治疗血管瘤的注射液及其制备方法。所述组合物由平阳霉素、干扰素、地塞米松、肾上腺素、利多卡因和注射用水有机配制而成，但是多药物的安全性问题不能得到保证，且导致成本增加。

[0008] CN101015504A公开了一种治疗子宫腺肌症的栓塞剂及其制备过程。该制剂制备过程复杂且使用不便，只能在手术中使用，安全性不高。

[0009] CN101536987A公开了一种含抗血管瘤药物海藻酸钠微球血管栓塞剂及其制备方法和应用，其特征为海藻酸钠包裹所述抗血管瘤药物，比例为5∶1-60∶1，所述抗血管瘤药物为平阳霉素、鱼肝油酸钠、尿素或博莱霉素，该药物的稳定性不够好，且粒径和包裹率难于测定和控制，导致生物利用度低，而且制备过程过于复杂，不适合工业大生产。 [0010] CN200980155850A公开了一种囊泡制剂，利用血清成分将维生素E运送至肝实质细胞的性质，通过使维生素E吸附或化学结合于囊泡表面，从而可以将囊泡中所含的生理活性物质有效且特异性地运送至肝实质细胞。

[0011] 在靶向给药系统中，脂质体制备工艺逐步完善，脂质体作用机制进一步阐明，脂质体制剂具有以下优点：（1）具有缓释作用：活性成分缓慢释放，延缓肾排泄和代谢，从而延长作用时间，提高质量效果；（2）降低药物毒性；（3）增加药物的溶解性，提高制剂质量；（4）具有靶向性：脂质体所载的药物在肝、脾网状内皮系统脏器局部维持高浓度，从而起到药物器官靶向性作用；（5）具有对活性药物成分的保护作用。

[0012] 贺福长，平阳霉素磁性脂质体对人粘液表皮样癌的体内抗瘤作用研究，《实用口腔医学杂志》，1997年02期，第108-110页，其中公开了通过对研制的平阳霉素磁性脂质体对人粘液表皮样癌体内抗肿瘤作用观察，评价其作为导向治疗肿瘤的新型载体的可行性,但没有公开平阳霉素磁性脂质体的成分。

[0013] 由于盐酸平阳霉素注射剂存在的不足，目前对于盐酸平阳霉素脂质体注射剂存在需求，尤其需要质量优异的盐酸平阳霉素脂质体注射剂。

发明内容

[0014] 事实上，脂质体的稳定性是长期以来限制脂质体广泛应用的重要问题，脂质体普遍存在容易聚集、融合，导致包封药物泄漏，因此在工业上制备符合稳定性要求的药物脂质体实非易事，制药领域具有一般经验的技术人员清楚地知道在制备药物脂质体方面面临各种技术困难，所有这些绝非现有的理论可以预期解决的，需要克服许多技术难题。因此需要想方设法地寻找脂质体组方，以获得稳定性优良的盐酸平阳霉素脂质体注射剂。 [0015] 一般而言，对于大多数的脂质体药物制剂而言，被包裹的药物的药学性质主要由脂类组成和浓度所控制。为了形成品质优良的盐酸平阳霉素脂质体注射剂，重要的是寻找能与盐酸平阳霉素良好相容从而将其良好包封且不渗漏的成膜材料，以及寻找能使脂质体形成稳定注射剂的赋形剂成分。

[0016] 为了实现上述目的，本发明人进行的大量研究和实现，发现特定重量配比的盐酸平阳霉素、胆固醇琥珀酸酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、甘露醇和海藻糖能制成盐酸平阳霉素脂质体注射剂，与现有技术中的盐酸平阳霉素注射剂相比，其中作为药物活性成分的盐酸平阳霉素的包封率高且泄漏率低，脂质体粒径小且分布均匀，本发明制剂的药物活性成分在体循环中的保留时间显著延长，药物的生物相容性和生物利用度明显提高，从而明显提高了疗效。

[0017] 一方面，本发明提供一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂，其主要由以下重量配比的成分制成：

[0018]

[0019] 优选地，胆固醇琥珀酸酯与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺之间的重量比为1∶4。 [0020] 进一步优选地，本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂主要由以下重量配比的成分制成：

[0021]

[0022] 优选地，胆固醇琥珀酸酯与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺之间的重量比为1∶4。 [0023] 一般地，作为用于形成脂质体的磷脂，可以使用天然磷脂和合成磷脂。制备脂质体注射剂常用的膜材料为磷脂和附加剂，其中磷脂通常可选用蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄磷脂、蛋黄磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、蛋黄磷脂酰肌醇、大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、大豆磷脂酰甘油、大豆磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酸磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油中的一种或几种。常用附加剂的膜材料有胆固醇、十八胺、磷脂酸等等。用于制备脂质体注射剂的膜材料还有磷脂酰乙醇胺、胆固醇乙 脂、谷载醇、牛胆酸钠、磷脂酰丝胺酸、硬脂酰胺、单硬脂酰磷脂酸、单硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二鲸蜡基磷酸盐（DCP）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、单棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺。附加剂一般用来调节膜结构和或改变荷电性质，如胆固醇能使脂质体双分子层膜固化，从而减少自由基的生成，降低了氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。本发明人在大量的筛选实验时意外发现，当使用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇琥珀酸酯组合之外的任何膜材料时，均没有获得品质优良的脂质体，所得脂质体在高温40℃、相对湿度75%±5%的加速试验下，包封率、稳定性、和渗漏率等性质较差。

[0024] 在本发明中，针对盐酸平阳霉素的特点，本发明人通过研究意外发现二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇琥珀酸酯一起特别适于作为盐酸平阳霉素基础磷脂成膜材料。二硬脂酰磷脂酰乙醇胺容易获得，价格低廉，相变温度较高，易于形成稳定的脂质体膜。在本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂中，相对于4重量份的盐酸平阳霉素而言，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的用量为20-40重量份。如果二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的用量低于20重量份，则无法形成稳定的脂质体；反之，如果二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的用量的用量高于40重量份，则作为药物活性成分的盐酸平阳霉素的包封率下降，注射剂的品质以及疗效降低。 [0025] 在本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂中，胆固醇琥珀酸酯和聚氧乙烯40氢化蓖麻油协同用于调节脂质体的膜稳定性和通透性，调节盐酸平阳霉素的释放性质。 [0026] 胆固醇琥珀酸酯用于调节磷脂囊泡的稳定性和通透性。胆固醇琥珀酸酯(cholesterol hemisuccinate，CHS)是胆固醇的琥珀酯衍生物，又名胆固醇半琥珀酸酯，胆固醇半丁二酸酯，是一种抗动脉硬化的原料药。胆固醇琥珀酸酯除了荷负电荷外，还具有较好的脂质体膜稳定作用。这种胆固醇的琥珀酸衍生物，体内可生物降解，不存在安全性风险，可以安全的作为负电性材料使用。

[0027] 胆固醇琥珀酸酯是一种双亲性分子，与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺相结合， 阻止其凝聚成晶体结构。胆固醇琥珀酸酯掺入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺双层，类似于“缓冲剂”一样起到调节膜结构“流动性”的作用。当低于相变温度时，胆固醇琥珀酸酯可以使膜减少有序排列，增加流动性；当高于相变温度时，胆固醇琥珀酸酯可以增加膜的有序排列，从而降低膜的流动性。胆固醇琥珀酸酯能使脂质体双分子层膜固化，从而减少自由基的生成，降低氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。

[0028] 在本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂中，相对于4重量份的盐酸平阳霉素而言，胆固醇琥珀酸酯的较佳用量为5-10重量份。本发明人经过研究发现，当胆固醇琥珀酸酯与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺之间的重量比为1∶4时，能形成质量最佳的盐酸平阳霉素脂质体，所形成的脂质体毒性也最小。

[0029] 另一方面，在本发明的脂质体中，胆固醇琥珀酸酯为本发明优选的负电荷膜材料，特别适于作为基础磷脂成膜材料，有效地增大了脂质体表面的Zeta电位的绝对值，使脂质体表面的静电斥力增大，有效地抑制脂质体的聚集。在冻干粉针制备过程中，预冻阶段随着脂质体外水相冰析出，脂质体不断被浓缩，聚集的趋势增大，而加入负电荷磷脂可以有效地阻止此时脂质体的聚集，保证冻干复水后脂质体粒径稳定在一定范围内。在本发明的脂质体中，其Zeta电位为-10～-60mV，优选为-20～-40mV,本发明实施例的Zeta电位约为-30mV。

[0030] 研究表明，脂质体的稳定性与生物利用度有密切的对应关系。稳定性越高，生物利用度越高。因此，本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂的稳定性高，是导致药物生物利用度高的因素之一。

[0031] 另一方面，本发明人研究发现，在本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂中，相对于4重量份的盐酸平阳霉素而言，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的用量为20-40重量份，胆固醇琥珀酸酯为5-10重量份，聚氧乙烯40氢化蓖麻油为6-8重量份，且胆固醇琥珀酸酯与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺之间的重量比为1∶4时，可以得到品质优良的盐酸平阳霉素脂质体，其包封率和稳定性都很高，毒性低，生物利用度高。

[0032] 在本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂中，使用聚氧乙烯40氢化蓖麻油来进一步改进其药学性质。聚氧乙烯40氢化蓖麻油是一种非离子表面活性剂，当用于脂质体中时，能提高膜之间的化学能，从而提高其在水性液体中的化学稳定性，进而提高注射剂的稳定性。

[0033] 在本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂中，使用海藻糖和甘露醇作为赋形剂，进一步用于形成稳定的注射剂。海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷键构成的非还原性糖，自身性质非常稳定，它最明显的性质是在无水的条件下有保护生物膜的能力，使脂质体即使在脱水的情况下也保持形态完整。在本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂中，海藻糖能有效保护脂质体颗粒的形态和稳定性，进一步提高脂质体注射剂的稳定性。甘露醇在医药上是良好的利尿剂，降低颅内压、眼内压及治疗肾药、脱水剂、食糖代用品、也用作药片的赋形剂及固体、液体的稀释剂，尤其能为冻干粉针剂提供良好的成型支撑。 [0034] 本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂，其盐酸平阳霉素（以平阳霉素计）的规格可以为4mg或8mg，其Zeta电位为-20～-40mV。本发明的盐酸平阳霉素脂质体注射剂其平均粒径为120nm～160nm。

[0035] 另一方面，本发明还提供一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂的制备方法，具体包括如下制备步骤：

[0036] （1）在约50℃缓慢磁力搅拌下将胆固醇琥珀酸酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚氧乙烯40氢化蓖麻油溶于有机溶剂中，得到脂质溶液，将上述溶液冷冻干燥，直至干燥完全，得到形成疏松海绵状的干燥固体；

[0037] （2）将盐酸平阳霉素溶于缓冲溶液中，加入海藻糖，搅拌均匀得水相； [0038] （3）在约25℃下缓慢磁力搅拌下，将步骤1的固体加入步骤2的水相中，然后在600bar到900bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得盐酸平阳霉素脂质体； [0039] （4）在氮气保护下，将步骤（3）制得的盐酸平阳霉素脂质体，用pH调节剂调节pH值至7.0～9.0，在60℃水浴10～15分钟，然后将温度降至20～ 30℃在不断搅拌下加入甘露醇，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得盐酸平阳霉素脂质体注射剂。 [0040] 在制备方法发明的一方面，所述的有机溶剂选自乙醇、氯仿、二氯甲烷、甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、苯甲醇、叔丁醇、正己烷中的一种或几种，优选为体积比为1：3的乙醇和异丙醇的混合有机溶剂。

[0041] 在制备方法发明的一方面，步骤（1）中所述冷冻干燥的过程为：在-50～-60℃预冻2～4小时，接着在-40℃～-50℃冷冻10～13小时，再经12～15小时升华至20℃～25℃，最后在30℃～35℃干燥6～8小时。

[0042] 在制备方法发明的一方面，所述的缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种或几种，优选为pH值为5.8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液。

[0043] 在制备方法发明的一方面，所述pH调节剂可以是碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾或氢氧化钾等，优选为氢氧化钾。

[0044] 优选的一方面，本发明还提供一种盐酸平阳霉素脂质体注射剂的制备方法，具体包括如下制备步骤：

[0045] （1）在约50℃缓慢磁力搅拌下将胆固醇琥珀酸酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚氧乙烯40氢化蓖麻油溶于体积比为1：3的乙醇和异丙醇的混合有机溶剂中，得到脂质溶液，将上述溶液在-50～-60℃预冻2～4小时，接着在-40℃～-50℃冷冻10～13小时，再经12～15小时升华至20℃～25℃，最后在30℃～35℃干燥6～8小时，得到形成疏松海绵状的干燥固体；

[0046] （2）将盐酸平阳霉素溶于pH值为5.8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，加入海藻糖，搅拌均匀得水相；

[0047] （3）在约25℃下缓慢磁力搅拌下，将步骤1的固体加入步骤2的水相中，然后在600bar到900bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得盐酸平阳霉素脂质体； [0048] （4）在氮气保护下，将步骤（3）制得的盐酸平阳霉素脂质体，用氢氧化钾调节pH值至7.0～9.0，在60℃水浴10～15分钟，然后将温度降至20～ 30℃在不断搅拌下加入甘露醇，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得盐酸平阳霉素脂质体注射剂。 [0049] 制备脂质体的挑战在于如何使脂质体膜形成适当大小、适当结构材料的包封率高的囊泡。而且这些材料在形成脂质体不漏出。本发明人通过选择适当的材料成分、采用合适的制备工艺，获得了品质优良的盐酸平阳霉素脂质体注射剂，脂质体粒径小，平均粒径为
120nm～160nm，粒径分布均匀，包封率高，稳定性高。

[0050] 本发明的脂质体注射剂减少了毒副作用，提高了制剂产品质量，具有良好的制剂稳定性，冷冻过程中脂质体不会因脱水、融合、冰晶等发生破裂，长期储存后渗漏率低，脂质体同样保持良好的包封率。

[0051] 通过本发明方法制得的盐酸平阳霉素脂质体注射剂，增加了药物在体循环中的保留时间，提高了药物的生物利用度，减少了毒副作用，并且制备方法重现性好，适合于工业化大生产。

附图说明

[0052] 图1是盐酸平阳霉素脂质体注射剂的血药浓度-时间曲线，为实施例1、3、4及对比例1、3和4中制备的注射剂，于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h和24h的平均血药浓度与时间的关系曲线。

[0053] 其中：

[0054]

具体实施方式

[0055] 以下通过具体优选的实施例对本发明进行进一步说明。这些实施例仅是说明性的，并不应理解为对本发明的限制。

[0056] 实施例1盐酸平阳霉素脂质体注射剂的制备

[0057] 处方（1000瓶）所用成分及其重量如下：

[0058]

[0059]

[0060] 采用制备工艺制备盐酸平阳霉素脂质体注射剂：

[0061] （1）在约50℃缓慢磁力搅拌下将10g胆固醇琥珀酸酯、40g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和8g聚氧乙烯40氢化蓖麻油溶于200ml体积比为1：3的乙醇和异丙醇的混合有机溶剂中，得到脂质溶液，将上述溶液在-50℃预冻2小时，接着在-40℃冷冻10小时，再经12小时升华至20℃，最后在30℃干燥6小时，得到形成疏松海绵状的干燥固体；

[0062] （2）将4g盐酸平阳霉素溶于1000ml pH值为5.8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，加入10g海藻糖，搅拌均匀得水相；

[0063] （3）在约25℃下缓慢磁力搅拌下，将步骤1的固体加入步骤2的水相中，然后在600bar到900bar做梯度均质4遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得盐酸平阳霉素脂质体； [0064] （4）在氮气保护下，将步骤（3）制得的盐酸平阳霉素脂质体，用氢氧化钾调节pH值至8.0，在60℃水浴10分钟，然后将温度降至20℃在不断搅拌下加入30g甘露醇，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得盐酸平阳霉素脂质体注射剂。

[0065] 实施例2盐酸平阳霉素脂质体注射剂的制备

[0066] 处方（1000瓶）所用成分及其重量如下：

[0067]

[0068]

[0069] 采用制备工艺制备盐酸平阳霉素脂质体注射剂：

[0070] （1）在约50℃缓慢磁力搅拌下将7.5g胆固醇琥珀酸酯、30g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和7g聚氧乙烯40氢化蓖麻油溶于200ml体积比为1：3的乙醇和异丙醇的混合有机溶剂中，得到脂质溶液，将上述溶液在-60℃预冻4小时，接着在-50℃冷冻13小时，再经15小时升华至25℃，最后在35℃干燥8小时，得到形成疏松海绵状的干燥固体；

[0071] （2）将4g盐酸平阳霉素溶于1000ml的pH值为5.8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，加入8g海藻糖，搅拌均匀得水相；

[0072] （3）在约25℃下缓慢磁力搅拌下，将步骤1的固体加入步骤2的水相中，然后在600bar到900bar做梯度均质6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得盐酸平阳霉素脂质体； [0073] （4）在氮气保护下，将步骤（3）制得的盐酸平阳霉素脂质体，用氢氧化钾调节pH值至9.0，在60℃水浴15分钟，然后将温度降至30℃在不断搅拌下加入20g甘露醇，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得盐酸平阳霉素脂质体注射剂。

[0074] 实施例3盐酸平阳霉素脂质体注射剂的制备

[0075] 处方（1000瓶）所用成分及其重量如下：

[0076]

[0077] 采用制备工艺制备盐酸平阳霉素脂质体注射剂：

[0078] （1）在约50℃缓慢磁力搅拌下将10g胆固醇琥珀酸酯、40g二硬脂酰 磷脂酰乙醇胺和12g聚氧乙烯40氢化蓖麻油溶于溶于200ml体积比为1：3的乙醇和异丙醇的混合有机溶剂中，得到脂质溶液，将上述溶液在-55℃预冻3小时，接着在-45℃冷冻11小时，再经13小时升华至23℃，最后在33℃干燥7小时，得到形成疏松海绵状的干燥固体； [0079] （2）将8g盐酸平阳霉素溶于1000ml的pH值为5.8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，加入12g海藻糖，搅拌均匀得水相；

[0080] （3）在约25℃下缓慢磁力搅拌下，将步骤1的固体加入步骤2的水相中，然后在600bar到900bar做梯度均质5遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得盐酸平阳霉素脂质体； [0081] （4）在氮气保护下，将步骤（3）制得的盐酸平阳霉素脂质体，用氢氧化钾调节pH值至7.0，在60℃水浴14分钟，然后将温度降至25℃在不断搅拌下加入20g甘露醇，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得盐酸平阳霉素脂质体注射剂。

[0082] 实施例4盐酸平阳霉素脂质体注射剂的制备

[0083] 处方（1000瓶）所用成分及其重量如下：

[0084]

[0085] 采用制备工艺制备盐酸平阳霉素脂质体注射剂：

[0086] （1）在约50℃缓慢磁力搅拌下将6g胆固醇琥珀酸酯、24g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和7g聚氧乙烯40氢化蓖麻油溶于200ml体积比为1：3的乙醇和异丙醇的混合有机溶剂中，得到脂质溶液，将上述溶液在-55℃预冻3小时，接着在-40℃冷冻12小时，再经14小时升华至25℃，最后在35℃干燥6小时， 得到形成疏松海绵状的干燥固体；

[0087] （2）将4g盐酸平阳霉素溶于1000ml的pH值为5.8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，加入9g海藻糖，搅拌均匀得水相；

[0088] （3）在约25℃下缓慢磁力搅拌下，将步骤1的固体加入步骤2的水相中，然后在600bar到900bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得盐酸平阳霉素脂质体； [0089] （4）在氮气保护下，将步骤（3）制得的盐酸平阳霉素脂质体，用氢氧化钾调节pH值至7.7，在60℃水浴15分钟，然后将温度降至30℃在不断搅拌下加入18g甘露醇，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，然后进行冻干，即得盐酸平阳霉素脂质体注射剂。

[0090] 对比例1-4盐酸平阳霉素脂质体注射剂的制备

[0091] 需要说明的是，发明人在预试验中，曾经采用逆相蒸发一冻融法制备过盐酸平阳霉素脂质体：称取卵磷脂9.5g，胆固醇1.0g，维生素E50mg，加氯仿使之完全溶解后，将含有盐酸平阳霉素0.4g、维生素C 15mg,PVP适量的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)40ml缓缓加入其中，同时加司盘-802ml,间断超声5min至乳化完全，在旋转蒸发仪上除去有机相，形成凝胶状物，置4℃冰箱冷冻后室温融化。重复3次，得到了不佳的盐酸平阳霉素脂质体，其平均粒径为685.24nm，包封率约为70％，渗漏率明显约为8％。将该处方改用实施例1-3中类似的生产工艺，其包封率、渗漏率、粒径等性质均不理想。

[0092] 现仅仅例举性给出证实本发明组合具有协同作用效果的部分对比例，但不应理解为对本发明的限制，分别采用与实施例1-4中相同的生产工艺，将如下表1中所示的对比例1-4中的成分分别制成盐酸平阳霉素脂质体注射剂。

[0093] 表1对比例1-4中所用成分

[0094]

[0095]

[0096] 其中，“/”表示未使用。

[0097] 具体而言，对比实施例1用胆固醇代替胆固醇琥珀酸酯，用聚氧乙烯35蓖麻油代替聚氧乙烯40氢化蓖麻油；对比实施例2用二油酰磷脂酰乙醇胺代替二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，用海藻糖代替甘露醇和海藻糖，即内外相均为海藻糖；对比实施例3用二硬脂酰磷脂酰胆碱代替二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，用吐温80代替聚氧乙烯40氢化蓖麻油；对比实施例4用大豆甾醇代替胆固醇琥珀酸酯，用甘露醇代替甘露醇和海藻糖，即内外相均为甘露醇。 [0098] 以下通过试验例对比，证实了本发明成分的组合具有协同作用的效果，本发明提供了品质优异的盐酸平阳霉素脂质体注射剂。

[0099] 试验例1脂质体粒径的测定

[0100] 室温条件下，取实施例1-4和对比例1-4中的盐酸平阳霉素脂质体注射剂，置于Submicron Particle Sizer Model 370粒径检测仪的样品管中，测定粒径大小分布及平均粒径；用投射电子显微镜观察粒子形态。结果示于下表2中。

[0101] 表2脂质体粒径检测结果

[0102]

[0103]

[0104] 从表2可知，实施例1-4制得的脂质体粒径均匀，显球形，大小均一；对比例1-4制得的脂质体粒径分布不均匀，形状不定，大小不一。

[0105] 具体而言，即使在采用同样的生产工艺时，实施例1-4中所得盐酸平阳霉素脂质体的颗粒外观及其粒径大小和分布范围明显优于对比例1-4中所得的盐酸平阳霉素脂质体。说明当使用本发明所用成分以外的成分组合时，或者当成分用量在本发明限定的成分用量范围外时，所得盐酸平阳霉素脂质体的外观劣于本发明，平均粒径明显大出很多。 [0106] 试验例2包封率的测定

[0107] 将实施例1-4和对比例1-4中制备的盐酸平阳霉素脂质体注射剂以5000r/min的转速高速离心，离心20分钟，取上清液，用甲醇溶解，HPLC法测盐酸平阳霉素含量，计算包封率，结果示于下表3中。

[0108] 表3包封率测定结果

[0109]

[0110] 由表3可知，实施例1-4制备的脂质体制剂的包封率显著的高于对比例1-4的脂质体制剂的包封率。说明当使用本发明所用成分以外的成分时，或者当成分用量在本发明限定的成分用量范围外时，所得脂质体的脂质体包封率低于本发明。

[0111] 试验例3稳定性考察

[0112] 将本发明实施例1-4制备的样品和上市注射用盐酸平阳霉素冻干粉针（批号：20110224，北京协和药厂）分别置于高温40℃、相对湿度75%的条件下6个月，进行加速试验考察，实验结果示于下表4中。

[0113] 表4加速试验结果

[0114]

[0115]

[0116]

[0117] 由表4可知，加速6月时，上市制剂和对比例1-4的含量降低，有关物质升高；而本发明的样品性状、含量和有关物质变化均不明显，说明本发明的产品稳定性好。 [0118] 试验例4渗漏率试验

[0119] 取试验例1-4和对比例1-4制备的样品，在室温条件下，分别于0天、30天、60天、90天和180天，定期检查，测定包封率，与0天包封的药量比较，计算渗漏率，结果示于下表
5中。

[0120] 表5渗漏率试验结果

[0121]

[0122] 由表5可知，长期储存时，本发明实施例1-4中制备的盐酸平阳霉素脂质体注射剂渗漏率变化不大，而对比例1-4中制备的注射剂渗漏率逐渐增大，脂质体渗漏严重，这说明本发明制备的盐酸平阳霉素脂质体注射剂具有更高的稳定性。

[0123] 试验例5血药浓度的测定

[0124] 将56只大鼠随机分成7组，每组分别注射给药实施例1、3、4及对比例1、3和4中制备的注射剂，以及市售盐酸平阳霉素注射剂（批号：20110224，北京协和药厂），注射量为0.2g盐酸平阳霉素（以平阳霉素计）。给药后分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h和
24h，采血，血样经处理后，以HPLC-MS法测定血药浓度。绘制实施例1、3、4中制备的盐酸平阳霉素脂质体注射剂、对比例1、3-4中制备的盐酸平阳霉素脂质体注射剂的血药浓度与时间的关系曲线，示于附图1中，由于市售盐酸平阳霉素注射剂迅速代谢，血药浓度有效时间短，没有缓释作用，故没有在图1中给出其常规的血药曲线。

[0125] 由图1可知，本发明具有缓释效果和生物利用度高，与对比例1、3和4中制备的盐酸平阳霉素脂质体注射剂和市售盐酸平阳霉素脂质体注射剂相比，本发明实施例1、3和4中制备的盐酸平阳霉素脂质体注射剂还具有以下优点：在体内的消除速度减缓，在体循环中分布时间延长，达到了改进的缓释效果，增加了生物利用度。

[0126] 对比实施例1-4在试验例1-5中虽然不是单因素考察其影响（单因素的影响见说明书描述），但对比实施例1-4从不同方面证实了本发明实施例1-4中制备脂质体注射剂具有意外的效果，本发明组分组合具有协同作用。具体而言，对比实施例1-4在试验例1-5中显示的结果表明对比实施例1-4彼此之间各有特点，难于确定哪种组合具有全面的优化效果，但均明显不如实施例1-4的脂质体注射剂，说明实施例1-4的脂质体注射剂具有优异的制剂学特征，取得了意外的技术效果，解决了制剂学技术问题。

[0127] 工业实用性

[0128] 由上述实施例以及实验例的结果可知，本发明的盐酸平阳霉素脂质体具有良好的外观，颗粒小，粒径均匀，包封率高，稳定性高，渗漏率低，在体内的停留时间长，生物利用度高，本发明的制备方法重现性好，适合于工业化大生产，具有良好的工业应用价值。 [0129] 以上通过具体实施方式和实施例对本发明进行了详细说明，不过应理解，这些说明并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和保护范围的情况下，可以对本发明的技术方案及其实施方式进行多种修饰、改进和替换，这些均因落入本发明的保护范围内。

[0130] 本申请中提及或引用的各个参考文献，在此全文引入作为参考。