去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗肾脏病药物中的应用

摘要

本发明公开了去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗肾脏病药物中的应用，经实验研究表明，去-O-甲基毛狄泼老素具有很好的保护肾脏的作用，对肾脏疾病常表现的尿蛋白总量增高、足突的融合和消失、足细胞损伤、肾小球有核细胞总数升高、系膜区面积和肾小球面积增大、新月体形成、PCNA和MCP-1表达等病理症状具有明显的抑制作用，对多种肾脏疾病均具有很好的防治作用，且实验过程中未见明显不良反应，有望开发成新一代安全有效治疗肾脏疾病的药物。

权利要求

1.去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗肾脏病药物中的应用，其特征在于，去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗系膜增生性肾小球肾炎药物中的应用。

说明书

去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗肾脏病药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及去-O-甲基毛狄泼老素化合物，特别涉及去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗肾脏病药物中的应用。

背景技术

[0002] 肾脏病严重的危害人类的生命健康，每年有数千万的病人死于肾脏疾病，其中原发性肾病综合征是儿科常见的泌尿系统疾病，临床主要表现为蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和不同程度的水肿，每年因原发性肾病综合征而死亡的儿童呈上升趋势，国外报道16岁以下人群其发生率约为15.7/10万，我国部分省、市医院住院患儿据统计资料显示，肾病综合征约占泌尿内科疾病患儿的21~31%，肾病综合征如不采取积极有效的治疗，患儿往往会死于感染等多种并发症。目前治疗原发性肾病综合征主要以肾上腺糖皮质激素为基础药物，且治疗周期长，长期使用该类药物会引起机体免疫功能的低下，从而影响疾病的治疗，且长期使用糖皮质激素药物会带来，如肥胖、生长抑制、高血压、糖尿病和骨质疏松等不良反应，微小病变型肾病是儿童肾病综合征最常见的病理类型，其病理改变主要以电镜下肾小球上皮细胞足突融合为特征，因此肾病综合征已经严重影响到患儿的生活质量和身心健康，给整个社会和家庭带来了不利影响；同时，肾小球肾炎也是肾脏疾病中危害人类生命健康的主要疾病，每年因肾小球肾炎疾病死亡的人数逐年升高，如系膜增生性肾小球肾炎是一病理形态学诊断，光镜下表现为弥漫性肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）增生和（或）系膜基质增多，是我国儿童肾活检病例中最常见的病理类型，病人可呈血尿、蛋白尿、肾病综合征、隐匿性肾炎等多种临床表现；新月体性肾小球肾炎发病机制主要是由于体内抗肾小球基底膜抗体与肾脏中的肾小球基底膜结合，形成抗原-抗体复合物，促发肾脏的免疫炎症反应，激活补体，导致肾组织的免疫损伤，病理上主要表现为：大量的肾小球壁层上皮细胞增生，充填于肾小囊中形成“新月体”，这是本病的特征性改变，此外，肾小管可见上皮细胞变性、坏死、萎缩，肾小球及肾间质中可见大量的单核/巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润，并最终形成肾小球硬化和小管间质纤维化。目前治疗肾小球肾炎主要以化学药为主，但长期使用化学药会产生多种不良反应，且有些药物通过肾脏排泄对肾脏产生严重的毒副作用。

[0003] 去-O-甲基毛狄泼老素（DML），是从紫草中提取的小分子化合物，其分子式为C15H20O4，分子量为264.32。中国专利200810200074.4公开了苯并大环内酯类化合物(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素、其衍生物及其制备方法和用途；201110079284.4公开了3R-去-O-甲基毛狄泼老素在制备预防或治疗抑郁症的药物中的用途；但其对肾脏病的治疗作用还没有研究报道。

发明内容

[0004] 发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，在去-O-甲基毛狄泼老素原有功效的基础上，开发其新的临床用途，提供去-O-甲基毛狄泼老素在治疗肾脏疾病中的应用，实验结果显示，其具有很好的防治肾脏病的作用，且无不良反应。

[0005] 技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素（DML），其结构式为：

[0006]

[0007] 本发明通过大量实验研究表明，去-O-甲基毛狄泼老素具有很好的治疗肾脏疾病的作用，可用于制备治疗肾脏病药物中的应用。

[0008] 作为优选方案，本发明所述的去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗肾病综合症药物中的应用；作为更优选方案，本发明所述的去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗原发性肾病综合征和继发性肾病综合征药物中的应用。

[0009] 作为优选方案，本发明所述的去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗肾小球肾炎药物中的应用；作为更优选方案，去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗系膜增生性肾小球肾炎药物中的应用；作为另一更优选方案，去-O-甲基毛狄泼老素在制备治疗新月体性肾小球肾炎药物中的应用。

[0010] 本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素做成治疗肾脏疾病的制剂时，可以将去-O-甲基毛狄泼老素和药学上可接受的载体制备成口服液、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉针剂或注射液剂型的药物。

[0011] 将本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素制成口服液时,将各原料的提取物加蒸馏水溶解，过滤，加入糖浆，调节pH,制成口服液。

[0012] 将本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素制成片剂时，把各原料和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

[0013] 本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素制成胶囊剂时把各原料的提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

[0014] 本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素制成颗粒剂时，把各原料的提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

[0015] 本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素制成注射液时，取各原料的提取物加入生理盐水溶解然后加入活性碳，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。

[0016] 本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素除热原之后，经无菌过滤，冷冻干燥，得到注射用粉针剂。

[0017] 有益效果：本发明在去-O-甲基毛狄泼老素原有功效的基础上进行新的用途开发，实验研究表明去-O-甲基毛狄泼老素具有很好的治疗肾脏病的作用，对多种肾脏疾病均具有非常好的治疗效果，且实验过程中，未表现出副作用等不良反应，有望开发成为新一代安全有效，用于治疗肾脏病的药物。

具体实施方式

[0018] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

[0019] 实施例1：去-O-甲基毛狄泼老素对肾病综合征的药理作用

[0020] 一、实验材料

[0021] 氨基核苷嘌呤霉素购自美国Sigma公司；SuperScript III RNase H-Reverse Transcriptase试剂盒购自美国Invitrogen公司；山羊抗nephrin、podocin抗体、辣根过氧化物酶标记抗山羊和小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。

[0022] 二、实验方法

[0023] 1、动物模型制备及实验分组：雄性SD大鼠40只，体重80~100克。随机分为5组，正常对照组、模型组、去-O-甲基毛狄泼老素（DML）低剂量治疗组、去-O-甲基毛狄泼老素（DML）高剂量治疗组和去-O-甲基毛狄泼老素（DML）对照组，每组8只(n=8)。正常对照组：腹腔注射生理盐水；模型组、去-O-甲基毛狄泼老素低剂量及高剂量治疗组予一次性腹腔注射氨基核苷嘌呤霉素（PAN），剂量150mg/kg。从注射当天（第0天）起，去-O-甲基毛狄泼老素低剂量、去-O-甲基毛狄泼老素高剂量以及去-O-甲基毛狄泼老素对照组分别给予20，-1 -1
40，40mg·Kg ·d ，灌胃，1次/天，其他组给予等量生理盐水灌胃。用代谢笼隔日（分别为第1、3、5、7天）收集大鼠24h尿液，检测24h尿蛋白总量，第8天集中处死所有大鼠，留取肾脏。

[0024] 2、大鼠24小时尿蛋白含量测定：应用Bradford法测定24h尿蛋白总量（mg/24h）。

[0025] 3、肾脏病理形态学观察：包括光镜检查和肾脏超微结构检查。光镜检查：所有标本于4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片（3μm），分别行苏木素-伊红（HE）和希夫氏（PAS）3
染色，光镜下观察肾组织。超微结构检查：采用透射电镜观察。取约1mm 的肾皮质，经2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定、脱水、环氧树脂618包埋，超薄切片后醋酸铀-柠檬酸铅染色，JEM-1010透射电镜下观察。

[0026] 4、实时定量RT-PCR：取肾皮质，Trizol一步抽提法提取总RNA。逆转录以随机六核苷酸寡聚合物(PdN6)为引物,采用Invitrogen公司的SuperScript III RNase H-ReverseTranscriptase试剂盒进行。实时定量PCR在美国ABI PRISM 7000 SDS上进行。采用primer3软件（http://frodo.wi.mit.edu）设计引物。引物序列为：nephrin：forward，
5’-GGAGGACAGGATCAGGAATGAA-3’，reverse,5’-CCCGGTCCCCAGTCCA-3’；podocin：forward，
5’-GTGAGGAGGGCACGGAAG-3’，reverse，5’-AGGGAGGCGAGGACAAGA-3’；GAPDH：forward，
5’-GTCTTCACTACCATGGAGAAGG-3’，reverse,5’-TCATGGATGACCTTGGCCAG-3’。实时定量PCR采用SYBR Green master mix(Applied Biosystems)试剂盒在96孔板上（
Optical 96-well plate）进行,每一管的反应总体积为25μL,PCR的温度循环设计为：
95°C，10分钟；随后以95°C，15秒和60°C，1分钟循环40次。mRNA表达量采用管家基因GAPDH校正。

[0027] 5、大鼠肾组织蛋白质提取及免疫印迹：冰上称取100mg肾皮质，加入冰预冷的蛋白质裂解缓冲液1ml（50mM Tris-HCL(pH7.4)、150mM NaCl、1%Triton X-100、0.25%脱氧胆酸钠、1mM EDTA、1mM DTT、5%甘油、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1μg/ml Leupeptin、1μg/ml Pepstatin）冰上匀浆，4°C孵育1h，16000g 4°C离心15min，取上清。Bradford法测蛋白浓度。取30μg总蛋白加上样缓冲液煮沸5分钟后上SDS聚丙烯酰胺凝胶(10%)电泳，转移至硝酸纤维素膜。将转移后的硝纤膜TBS-T室温封闭1h，加1:1000山羊抗nephrin或podocin抗体室温反应2h，辣根过氧化物酶标记的二抗室温作用1h，化学发光后自显影、定影。

[0028] 6、统计学方法：结果以均数±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，多个均数之间的比较采用q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

[0029] 三、实验结果

[0030] 1、去-O-甲基毛狄泼老素（DML）对实验性肾病大鼠24h尿蛋白总量的影响：实验前，各组大鼠尿蛋白排泄量无明显差别。PAN注射后第3天，模型组大鼠尿蛋白的排泄量开始增加，至第7天达最高峰，尿蛋白总量达259.73mg/24h；治疗组在去-O-甲基毛狄泼老素灌胃5天后对大鼠实验性肾病模型有明显降低尿蛋白的作用（P＜0.05，具体实验如表1）。

[0031] 表1 各组大鼠24h尿蛋白总量变化(n=8，mg/24h)

[0032]

[0033] 与对照组比较，*P＜0.01；与模型组相比较，◆P＜0.01。

[0034] 由以上表1的实验结果表明去-O-甲基毛狄泼老素能有效的降低氨基核苷嘌呤霉素诱发的肾病综合征动物模型的尿蛋白总量，且与模型组相比具有统计学意义，并且实验结果表明去-O-甲基毛狄泼老素对正常大鼠的尿蛋白总量没有影响，说明去-O-甲基毛狄泼老素具有很好的抑制肾病综合征动物模型导致的尿蛋白总量增高的作用。

[0035] 2、肾脏病理形态学观察：光镜下模型组肾小球、去-O-甲基毛狄泼老素治疗组的肾小球与正常对照组相比未见明显异常。透射电镜：正常对照组肾小球足细胞足突形态正常。模型组足细胞足突广泛融合、消失。而经去-O-甲基毛狄泼老素治疗后，能显著减轻足细胞足突的融合。表明本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素能够很好的抑制氨基核苷嘌呤霉素诱导的肾小球足突的融合和消失，能有效抑制尿总蛋白增高，对肾脏具有明显保护作用。

[0036] 3、肾组织中nephrin和podocin表达：实时定量RT-PCR和Western Blot检测结果显示，模型组大鼠肾组织中nephrin和podocin表达显著降低，分别是正常对照组的33.85%和39.41%，去-O-甲基毛狄泼老素治疗后，肾组织中nephrin和podocin表达显著上调，且随剂量增大其作用更为显著，去-O-甲基毛狄泼老素高剂量治疗组，其肾组织中nephrin和podocin表达恢复到正常对照组的85.96%和81.03%。以上实验结果进一步表明去-O-甲基毛狄泼老素能上调足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin表达，对肾脏组织具有明显的保护作用。

[0037] 微小病变型肾病是儿童肾病综合征最常见的病理类型，其病理改变主要以电镜下肾小球上皮细胞足突融合为特征，且肾脏疾病患者中足突的融合和消失是蛋白尿形成的启动机制之一，而尿蛋白的排泄又可加重足细胞损伤。以上实验结果显示，去-O-甲基毛狄泼老素对肾脏具有很好的保护作用，能有效降低尿蛋白含量，明显缓解足细胞损伤，减轻足突融合，并且能上调足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin表达，能够有效的治疗肾病综合征。

[0038] 实施例2 去-O-甲基毛狄泼老素（DML）对系膜增生性肾小球肾炎的药理作用。

[0039] 一、实验材料

[0040] 健康雄性SD大鼠40只，4周龄，体重160g左右，购自江苏省实验动物中心；完全弗氏佐剂、FITC标记的羊抗兔IgG及Schiff试剂购自美国Sigma公司，增殖细胞核抗原（PCNA）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）单克隆抗体购自美国Sant Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、正常山羊血清封闭液、DAB显色剂购自北京中山生物技术公司。

[0041] 二、实验方法

[0042] 1、抗大鼠胸腺细胞抗血清（ATS）制备：4周龄SD大鼠，取其胸腺并制备成一定浓度7
的单胸腺细胞悬液，与完全弗氏佐剂等体积混匀后，按5×10 细胞皮下多点注射免疫新西
7
兰大白兔，其后每隔2周按1×10 胸腺细胞经耳缘静脉注射加强免疫3次。7周后颈动脉放血并分离血清，大鼠胸腺细胞涂片及大鼠肾组织冰冻切片测定ATS效价，间接免疫荧光法测抗体效价达1:1280。

[0043] 2、大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型制备及实验分组：雄性SD大鼠40只，随机分为5组：正常对照组、模型组、去-O-甲基毛狄泼老素（DML）低剂量组、去-O-甲基毛狄泼老素（DML）高剂量组和去-O-甲基毛狄泼老素（DML）对照组，每组8只。正常对照组和去-O-甲基毛狄泼老素对照组经尾静脉一次性注射10ml/kg的正常兔血清，模型组、去-O-甲基毛狄泼老素低剂量组和去-O-甲基毛狄泼老素高剂量组经尾静脉一次性注射10ml/kg的ATS。从注射ATS当天（第0天）起，去-O-甲基毛狄泼老素低剂量、去-O-甲基-1 -1
毛狄泼老素高剂量以及去-O-甲基毛狄泼老素对照组分别给予20，40，40mg·Kg ·d ，灌胃，1次/天，其他组给予等量生理盐水灌胃。用代谢笼隔日（分别为第1、3、5、7天）收集大鼠24h尿液，检测24h尿蛋白总量，第8天集中处死所有大鼠，留取肾脏。

[0044] 3、大鼠24小时尿蛋白含量测定：应用Bradford法测定24h尿蛋白总量（mg/24h）。

[0045] 4、肾脏病理形态学观察：所有标本于4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片（3μm），分别行苏木素-伊红（HE）和希夫氏（PAS）染色，光镜下观察肾组织。每张切片高倍镜下随机选取10个肾小球，对肾小球内有核细胞进行计数,并采用捷达病理图像分析系统软件测定肾小球系膜区面积及肾小球面积。

[0046] 5、肾组织PCNA、MCP-1的表达：肾组织中PCNA和MCP-1的表达采用Western Blot检测。

[0047] 6、统计学方法：结果以均数±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，多个均数之间的比较采用q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

[0048] 三、实验结果

[0049] 1、去-O-甲基毛狄泼老素（DML）对大鼠MsPGN模型24h尿蛋白总量的影响：模型组ATS注射后24h，尿蛋白即升高，至第5天达最高峰，尿蛋白总量达72.49mg/24h；治疗组在给予去-O-甲基毛狄泼老素灌胃5天后对大鼠MsPGN模型有明显降低尿蛋白的作用（P＜0.05，具体实验结果如表2）。

[0050] 表2 各组大鼠24h尿蛋白总量变化(n=8，mg/24h)

[0051]

[0052] 与对照组比较，*P＜0.01；与模型组相比较，◆P＜0.01。

[0053] 由以上表2的检测结果表明本发明去-O-甲基毛狄泼老素能有效的降低系膜增生性肾小球肾炎模型的尿蛋白总量，且与模型组相比具有统计学意义，说明去-O-甲基毛狄泼老素具有很好的抑制系膜增生性肾小球肾炎导致的尿蛋白总量增高的作用。

[0054] 2、肾脏病理形态学观察：PAS染色光镜下，正常对照组肾小球无明显改变；模型组肾小球内细胞数明显增多，肾小球系膜细胞和系膜基质弥漫性重度增生，系膜区明显扩大，肾小球毛细血管腔广泛受压狭窄、闭塞，部分小球可见球囊粘连、细胞性新月体形成及肾小球硬化。肾小管上皮细胞灶性颗粒样、空泡样变性，部分小管管腔内见蛋白管型，间质可见弥漫性炎性细胞浸润；去-O-甲基毛狄泼老素高剂量治疗组大部分肾小球基本接近正常，少数小球可见系膜细胞及系膜基质节段性轻度增生，毛细血管管腔开放良好，偶见球囊粘连，未见新月体形成及肾小球硬化，偶见肾小管上皮细胞灶性颗粒样变性，间质内无明显炎性细胞浸润。

[0055] 图像分析显示模型组肾小球内有核细胞总数、系膜区面积及肾小球面积均明显高于对照组（P＜0.01），去-O-甲基毛狄泼老素治疗组肾小球内有核细胞总数、系膜区面积及肾小球面积均明显低于模型组（P＜0.01；具体实验如表3）。

[0056] 表3 各组大鼠肾小球病理形态学指标变化（n=8)

[0057]* ◆

[0058] 与对这种比较，P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01。

[0059] 由以上表3实验结果表明，本发明提供的去-O-甲基毛狄泼老素能有效的降低肾小球有核细胞总数，且能减少系膜区面积和肾小球面积，和模型组相比具有统计学意义，进一步表明去-O-甲基毛狄泼老素对肾脏具有明显的保护作用。

[0060] 3、肾组织中PCNA和MCP-1表达：Western Blot检测结果显示，正常大鼠肾组织表达少量的PCNA和MCP-1。模型组大鼠肾组织中PCNA和MCP-1表达显著增加，分别是对照组的3.93倍和2.54倍。去-O-甲基毛狄泼老素治疗后，大鼠肾组织中PCNA和MCP-1表达均显著降低，低剂量去-O-甲基毛狄泼老素对PCNA和MCP-1的抑制率为63%和55%，高剂量去-O-甲基毛狄泼老素对PCNA和MCP-1的抑制率为79%和72%。实验结果进一步表明去-O-甲基毛狄泼老素能够防治肾组织内炎症细胞的浸润，从而减轻炎症反应。

[0061] 本研究结果显示，去-O-甲基毛狄泼老素能有效阻止大鼠系膜增生性肾小球肾炎疾病的进一步发展，给予大鼠去-O-甲基毛狄泼老素后，大鼠24小时尿蛋白总量较模型组即有显著下降，第7天后，治疗组肾小球内系膜细胞增殖及系膜基质增生较模型组均有显著减轻，间质中炎性细胞浸润程度较模型组明显下降，且随着去-O-甲基毛狄泼老素治疗剂量的增加，其作用更为明显，证实去-O-甲基毛狄泼老素对系膜增生性肾小球肾炎具有确切的治疗作用。

[0062] 且实验结果表明，系膜增生性肾小球肾炎模型大鼠在第8天肾皮质中PCNA和MCP-1表达明显增强，经去-O-甲基毛狄泼老素治疗后，肾组织内PCNA和MCP-1的含量均明显减少。MCP-1具有趋化激活单核细胞，促进氧自由基的产生及肾组织内炎症细胞的浸润，加重炎症反应作用。去-O-甲基毛狄泼老素可显著减低肾组织中MCP-1表达，提示去-O-甲基毛狄泼老素可通过阻断MCP-1的表达而减轻肾组织损伤，进一步说明去-O-甲基毛狄泼老素对肾脏具有保护作用，能够有效防治系膜增生性肾小球肾炎。

[0063] 另外实验结果表明，去-O-甲基毛狄泼老素还具有很好的抗肾小球基底膜肾毒血清肾炎作用，模型组大鼠在注射抗肾小球基底膜肾毒血清3天后尿蛋白开始增加，并呈进行性增高，第14天时出现大量的蛋白尿、明显的低白蛋白血症、高脂血症及肾功能异常。与模型组相比，去-O-甲基毛狄泼老素治疗后，24h尿蛋白定量、血清总胆固醇显著降低，血清白蛋白明显回升，肾功能明显好转，血清BUN和Cr水平显著下降。