癌症治疗中纳米多药载药体系的制备方法

摘要

本发明涉及一种癌症治疗中纳米多药载药体系的制备方法，包括如下步骤：采用阳极氧化法制备AAO模板，并对其进行表面改性，改变表面的亲溶剂性质；把改性模板放置到多种抗癌药物的混合溶液中，在常压或减压条件下辅助制备纳米药物；用酸或碱溶解除去模板，得到单分散且比例、形貌可控的多药纳米结构；清洗后得到纯的单分散纳米药物；合成功能化的表面活性剂分子，同时引入靶向单元；用合成的表面活性剂对纳米药物进行功能化；本发明方法是用模板法辅助制备各种疏水抗癌药物的多药协同纳米结构，改变制备条件可以得到不同配方、形貌和尺寸的纳米药物，所制备的纳米药物具有高的载药量、良好的稳定性、安全性、更低的毒副作用和优异的抗癌活性。

权利要求

1.癌症治疗中纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备AAO模板；

2）纳米颗粒的制备：将两种以上具有协同效应的疏水药物加入到有机溶剂中，配制成浓度为1毫摩尔/升溶液至饱和溶液，得到药物溶液；将AAO表面改性后浸泡在药物溶液中≥5分钟，取出硬模板晾干，重复浸泡和晾干步骤≥10次；

3）去除模板：用0.1-10mol/L的NaOH、5wt%-50wt%的H3PO4或磷酸+铬酸混合酸溶解去除模板；

4）收获纳米颗粒：用水清洗去模板后的纳米药物，除去反应副产物，得到单分散的纳米药物；

5）表面活性剂的合成：以末端为氨基的PEG为亲水端，含有18个碳链长度的马来酸酐作为疏水端，通过-NH2和-COOH的缩合反应，制备PEG-PMHC18；

6）载药体系的制备：取纳米药物溶于水中，制得纳米药物水溶液；取步骤5）制得的表面活性剂溶于水中，制成表面活性剂水溶液；将纳米药物水溶液和表面活性剂水溶液混合，使两个体系混合均匀，通过超声、震荡或机械搅拌使得表面活性剂对纳米药物进行稳定包裹,制得产品； 步骤2）中，所述AAO表面改性是指将AAO置于在下列物质中的一种或多种中进行超声处理8-12分钟：水、乙醇、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中，且表面改性最后选择的溶剂与药物溶液中的有机溶剂相同。

2.根据权利要求1所述纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于：步骤1）中，制备AAO模板的条件如下：取纯度≥99.999%的铝片并对其进行预处理，电解液为5wt%的硫酸、磷酸或草酸溶液；加入适量乙醇调控模板的制备过程；氧化电压180V，氧化温度15℃，氧化时间为7小时。

3.根据权利要求2所述纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于：所述预处理包括退火、去油渍、抛光和清洗步骤。

4.根据权利要求1所述纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述两种以上具有协同效应的疏水药物选自下列物质中的两种以上的物质：紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、秋水仙碱、长春新碱、甲氨蝶呤、他莫西芬、替尼泊苷、顺铂、6-巯基嘌呤。

5.根据权利要求1所述纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述有机溶剂选自下列物质中的一种或几种：乙醇、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。

6.根据权利要求1所述纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于：步骤4）中，除去反应副产物的方法是通过高速离心后弃去上层清液；所述高速离心的转速为4000-24800转/分钟。

7.根据权利要求1所述纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于：步骤6）中，所述纳米药物水溶液的浓度为10-1000μmol/L。

8.根据权利要求1所述纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于：步骤6）中，所述表面活性剂水溶液的浓度为0.1-100mg/mL。

9.根据权利要求1所述纳米多药载药体系的制备方法，其特征在于：步骤6）中，所述纳米药物水溶液：表面活性剂水溶液体积比为1:10-10:1。

说明书

癌症治疗中纳米多药载药体系的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种药物制剂的制备方法，尤其是涉及一种癌症治疗中纳米多药载药体系的制备方法。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的疑难疾患，居疾病死亡率之首。化学疗法在肿瘤治疗中占较大比例，近40年来发展很快，疗效不断提高，但目前的抗癌药物大多存在水溶性差、对肿瘤组织的选择性差、疗效低、毒性大、使用单一药物治疗易产生多药耐药性等缺点，限制了临床应用，并难以实现剂型的多样化。增加疏水药物的水溶性、克服耐药性具有十分重要的现实意义和研究价值，是医药化学领域亟待解决的问题。为了增加抗癌效果并减小毒副作用，全球许多科学家都竞相研发最新型的纳米药物载体材料和技术，致力于把疏水性药物通过某些载体包裹以对其进行增溶。

[0003] 近年来，随着生物技术的不断发展，各种新型的药物载体层出不穷，其制备工艺逐步完善，作用机制进一步阐明、剂型逐步改善、毒性和免疫原性大幅降低，特别是大量实验数据证明大多数的药物载体可以提高药物治疗指数、降低药物毒性、减小药物副作用、减小剂量。

[0004] 尽管药物载体发展迅速，且具备了许多优点和特点，其临床应用并不像预期的那样广泛，主要原因在于载体的引入极大的降低了载药量、载体的存在给机体增加了额外的代谢负担、载体的合成成本高且耗时，更重要的是，具有协同治疗效果的多组分药物很难同时且定量成比例的进入同一剂型，使得具有最佳治疗效果的纳米多药体系无法精确的控制制备。另外，载体基药物在体液环境中的分布和稳定存在也面临着极大的挑战。随着癌症诊断和治疗业的发展，制备高载药量、尺寸均一且比例可控的多组分药物协同体系成为必要。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种癌症治疗中纳米多药载药体系的制备方法；该方法是用模板法辅助制备各种疏水抗癌药物的多药协同纳米载药体系，改变制备条件可以得到不同配方、形貌和尺寸的纳米多药载药体系，所制备的纳米多药载药体系具有高的载药量、良好的稳定性、安全性、更低的毒副作用和优异的抗癌活性。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明一种癌症治疗中纳米多药载药体系的制备方法，包括如下步骤：

[0007] 采用阳极氧化法制备AAO模板(即：多孔阳极氧化铝模板)，并对其进行表面改性，改变表面的亲溶剂性质；把改性模板放置到多种抗癌药物的混合溶液中，在常压或减压条件下辅助制备纳米药物；用酸或碱溶解除去模板，得到单分散且比例、形貌可控的多药纳米结构；清洗后得到纯的单分散纳米药物；合成功能化的表面活性剂分子，同时引入靶向单元；用合成的表面活性剂对纳米药物进行功能化；除去多余的表面活性剂并进行后续的稳定性和生物学测试。

[0008] 具体步骤如下：

[0009] 1）制备AAO模板；

[0010] 2）纳米颗粒的制备：将两种以上具有协同效应的疏水药物加入到有机溶剂中，配制成浓度为1毫摩尔/升溶液至饱和溶液，得到药物溶液；将AAO表面改性后浸泡在药物溶液中≥5分钟，取出硬模板晾干，重复浸泡和晾干步骤≥10次；

[0011] 3）去除模板：用0.1-10mol/L的NaOH、5wt%-50wt%的H3PO4或磷酸+铬酸混合酸溶解去除模板；

[0012] 4）收获纳米颗粒：用水清洗去模板后的纳米药物体系，除去反应副产物，得到单分散的纳米药物；

[0013] 5）表面活性剂的合成：以末端带氨基的聚乙二醇（以后简称：PEG）为亲水端，含有18个碳链长度的马来酸酐(简称：PMHC18)的两亲性表面活性剂；作为疏水端，通过-NH2和-COOH的缩合反应，制备PEG-PMHC18的两亲性表面活性剂；

[0014] 6）载药体系的制备：取纳米药物溶于水中，制得纳米药物水溶液；取步骤5）制得的表面活性剂溶于水中，制成表面活性剂水溶液；将纳米药物水溶液和表面活性剂水溶液混合，使两个体系混合均匀，通过超声、震荡或机械搅拌使得两者通过疏水相互作用、静电作用和/或范德华力作用实现稳定包裹（即纳米药物的功能化）,制得多药载药体系。

[0015] 优选地，所述PEG的分子量范围为2000-20000。

[0016] 本发明可以通过载药体系的体外释放及生物学表征：数码照片、电子显微镜、动态光散射仪和紫外-可见分光光度法测定了载药体系的稳定性，并测定载药体系的体外释放行为、细胞内吞、体外和体内毒性等，来验证这本发明的方法的有效性。

[0017] 优选地，步骤1）中，制备AAO模板的条件如下：取纯度≥99.999%的铝片并对其进行预处理，电解液为5wt%的硫酸、磷酸或草酸溶液；加入适量乙醇调控模板的制备过程；氧化电压180V，氧化温度15℃，氧化时间为7小时。

[0018] 优选地，所述预处理包括退火、去油渍、抛光和清洗步骤。

[0019] 优选地，步骤2）中，所述两种以上具有协同效应的疏水药物选自下列物质中的两种以上的物质：紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、秋水仙碱、长春新碱、甲氨蝶呤、他莫西芬、替尼泊苷、顺铂、6-巯基嘌呤。

[0020] 优选地，步骤2）中，所述有机溶剂选自下列物质中的一种或几种：乙醇、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。选择有机溶剂时，应当是所选药物分子的良溶剂；也即药物分子在有机溶剂中溶解度高。

[0021] 优选地，步骤2）中，所述AAO表面改性是指将AAO置于在下列物质中的一种或多种中进行超声处理8-12分钟：水、乙醇、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中，且表面改性最后选择的溶剂与药物溶液中的有机溶剂相同。

[0022] 优选地，步骤4）中，除去反应副产物的方法是通过高速离心后弃去上层清液；所述高速离心的转速为4000-24800转/分钟。

[0023] 优选地，步骤6）中，所述纳米药物水溶液的浓度为10-1000umol/L。

[0024] 优选地，步骤6）中，所述表面活性剂水溶液的浓度为0.1-100mg/mL。

[0025] 优选地，步骤6）中，所述纳米药物水溶液：表面活性剂水溶液体积比为1:10-10:1。

[0026] 本发明具有如下有益效果：

[0027] （1）实验条件温和，操作简单，不需要使用大量的毒性溶剂和添加剂，不需要复杂的合成和制备过程；

[0028] （2）制备时间短，效率高；

[0029] （3）原材料来源广泛、成本低廉，无毒安全；

[0030] （4）形貌和尺寸均匀可调且易于控制（其中纳米颗粒的粒径为10-200nm，纳米棒和纳米管的直径10-200nm，长度500nm-100μm），适合产业化生产；

[0031] （5）载药量高（大于90%）；

[0032] （6）生物相容好，动物体内血液循环时间长，大大提高药物的生物利用率；

[0033] （7）该方法应用面广，适用于各种疏水药物。因此，本发明是一种操作简单、成本低、产率高、纳米药物组分和比例可调、形貌可控、尺寸小、粒径分布窄、对环境无污染的纳米药物制备方法，为新一代高载药量的多药制剂的研制及应用研究提供物质基础与技术保障，可用于癌症诊断和治疗领域，具有广泛的应用前景。

附图说明

[0034] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明

[0035] 图1：空白AAO模板的扫描电子显微镜（SEM）图片（a.正面图，b.侧面图）；

[0036] 图2：AAO模板法制备的吉非替尼（GET）和10-羟基喜树碱（HCPT）（1:1）纳米颗粒的SEM图片；

[0037] 图3：GET和HCPT（1:1）纳米多药释放体系的细胞内吞过程（激光共聚焦荧光显微镜照片：a.30min,b.1h,c.2h，d.3h）；

[0038] 图4：GET和HCPT（1:1）纳米多药释放体系的细胞毒性研究（纳米多药与纳米单药培养不同时间对肿瘤细胞杀伤效果的MTT测试：a.24h,b.48h）；

[0039] 图5：PEG-PMHC18和FA-PEG-PMHC18的生物相容性研究图；

[0040] 图6：AAO模板法制备GET和HCPT（1:1）多药载药体系形貌调控过程的SEM图片（a.纳米颗粒，b.纳米颗粒和纳米棒的混合体系，c.纳米棒，d.纳米颗粒和纳米管混合体系）；

[0041] 图7：AAO模板法制备的紫杉醇（PTX）和替尼泊苷（TEN）（2:3）纳米颗粒的SEM图片。

具体实施方式

[0042] 实施例1

[0043] 模板法制备单分散性GET和HCPT（摩尔比1:1）纳米多药载药体系的方法，它包括如下步骤：

[0044] 1）制备AAO模板：用高纯铝片（99.999%）作为原料，丙酮溶液中超声10min，除去表面污染物，然后在10V电压下，高氯酸/乙醇（1:4，V/V）溶液中电解30min，清除表面的氧化物，得到光亮的铝片，以铝片为阳极，铂片为阴极，在180V电压下，5%H3PO4+C2H5OH（1:3，V/V）为电解液，15°C电解7小时，CuCl2溶液除去Al基底，10%H3PO4溶液除掉阻挡层，得到两端开口的模板，如图1所示；

[0045] 2）多药纳米颗粒的制备：选择两种疏水抗癌药物吉非替尼（简称：GET）和10-羟基喜树碱（简称：HCPT），在N，N-二甲基甲酰胺（简称：DMF）中配制成30mM/L的混合溶液，并精确控制两种药物的摩尔比为1:1；将AAO模板依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃-DMF中超声10min处理，处理后的AAO模板在药物混合溶液中浸泡-晾干，重复该操作10次；

[0046] 3）去除模板：用1M/L的2-5mL的NaOH溶解2小时彻底除去AAO模板；

[0047] 4）纯化纳米颗粒：用去离子水清洗去除模板后的混合溶液体系，高速离心后弃去上层清液，重复水洗5次得到纯的单分散药物纳米颗粒；

[0048] 5）合成表面活性剂：以末端为氨基的PEG-5000（即分子量为5000的PEG）为亲水端，含有18个碳链长度的马来酸酐作为疏水端，通过-NH2和-COOH的缩合反应，制备PEG-PMHC18的两亲性表面活性剂；

[0049] 6）药物释放体系的制备：取1mLGET+HCPT（摩尔比1:1）纳米颗粒溶液（50uM/L），加入200uL PEG-PMHC18的水溶液（1mg/mL），搅拌30min使其稳定包裹；

[0050] 7）药物释放体系的稳定性表征：所制备的功能化多药释放体系在生理缓冲液中室温放置6个月，动态光散射法和紫外可见吸光光度法测定了体系的储存稳定性；

[0051] 8）细胞内吞过程：激光共聚焦荧光显微镜测试纳米多药随时间变化的进细胞过程；

[0052] 9）疗效表征：MTT比色法测试不同剂型对肿瘤细胞的杀伤效果，小鼠肿瘤治疗实验表征新剂型的体内治疗效果。

[0053] 经检测，本实施制得的纳米药物的尺寸为30-40纳米，如图2所示，所制备的纳米药物的载药量为90%；静置6个月后保持稳定。

[0054] 图3所示为激光共聚焦荧光显微镜测试本实施例制备的GET和HCPT（1:1）纳米多药释放体系的细胞内吞过程，结果表明该多药纳米颗粒体系可以被肿瘤细胞有效且快速内吞。

[0055] 采用MTT比色法测试不同剂型对肿瘤细胞的杀伤效果，如图4所示，结果表明纳米颗粒体系具有比分子态更强的治疗效果，且纳米多药具有比纳米单药更强的治疗效果。

[0056] PEG分子无毒，具有良好的安全性；图5所示为生物相容性研究结果，可以看出，细胞在200ug/mL的表面活性剂中培养时仍然能保持95%以上的存活率，说明本实施例制备的多药协同纳米颗粒释放体系具有良好的生物相容性。

[0057] 实施例2

[0058] 模板法制备单分散性GET和HCPT（不同比例）纳米多药载药体系的方法，它包括如下步骤：

[0059] 1）制备AAO模板：与实施例1相同；

[0060] 2）制备比例可调的多药纳米颗粒：选择两种疏水抗癌药物GET和HCPT，在N，N--二甲基甲酰胺（DMF）中配制成30mM/L的混合溶液，并精确控制两种药物的摩尔比为1:9,2:8,3：7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2或9:1，将AAO模板依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃DMF中超声10min处理，处理后的AAO模板在药物混合溶液中浸泡-晾干，重复该操作10次；

[0061] 3）去除模板：与实施例1相同；

[0062] 4）纯化纳米颗粒：与实施例1相同；

[0063] 5）合成表面活性剂：与实施例1相同；

[0064] 6）药物释放体系的制备：取1mL上述不同比例的GET+HCPT纳米颗粒溶液（1000uM/L），加入10mL PEG-PMHC18的水溶液（0.1mg/mL），搅拌30min使其稳定包裹；

[0065] 7）药物释放体系的稳定性表征：与实施例1相同；

[0066] 8）生物学测试：激光共聚焦荧光显微镜测试纳米多药释放体系的进细胞过程；MTT比色法测试不同剂型的体外杀伤效果；小鼠肿瘤模型表征新剂型的体内治疗效果。

[0067] 经检测，本实施制得的纳米药物的尺寸为30-50纳米，所制备的纳米药物的载药量为91-93%；静置6个月后保持稳定；具有优异的抗癌活性。

[0068] 实施例3

[0069] 模板法制备单分散性不同形貌GET和HCPT（摩尔比为1:1）纳米多药载药体系的方法，它包括如下步骤：

[0070] 1）制备AAO模板：与实施例1相同；

[0071] 2）制备不同形貌的纳米多药：选择两种疏水抗癌药物GET和HCPT，在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中配制成15，30，60mM/L的混合溶液，并精确控制两种药物的摩尔比为1:1，将AAO模板依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃-DMF中超声10min处理，处理后的AAO模板在药物混合溶液中浸泡—晾干，调整每次浸泡时间为5,10,30min，重复该操作15次；

[0072] 3）去除模板：与实施例1相同；

[0073] 4）纯化纳米多药：与实施例1相同；

[0074] 5）合成表面活性剂：与实施例1相同；

[0075] 6）药物释放体系的制备：取1mL的GET+HCPT纳米多药溶液（500uM/L），加入100uLPEG-PMHC18的水溶液（100mg/mL），超声30min使其稳定包裹；

[0076] 7）药物释放体系的稳定性表征：与实施例1相同，并在表征手段中增加了电子显微镜和数码照片的结果；

[0077] 8）生物学测试：激光共聚焦荧光显微镜测试纳米多药释放体系的进细胞过程；MTT比色法测试不同剂型的体外杀伤效果；小鼠肿瘤模型表征新剂型的体内治疗效果。

[0078] 经检测，本实施制得的药物纳米颗粒的直径为100纳米，药物纳米棒的直径为190-200纳米，长度1-2um，如图6所示，所制备的纳米药物的载药量为90%；静置6个月后保持稳定；具有优异的抗癌活性。

[0079] 实施例4

[0080] 模板法制备单分散性紫杉醇（PTX）和替尼泊苷（TEN）（摩尔比为2:3）纳米多药载药体系的方法，它包括如下步骤：

[0081] 1）制备AAO模板：与实施例1相同；

[0082] 2）制备比例精确的纳米多药：选择两种疏水抗癌药物PTX和TEN，在四氢呋喃（THF）中配制成20mM/L的混合溶液，并精确控制两种药物的摩尔比为2:3，将AAO模板依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃中超声10min处理，处理后的AAO模板在药物混合溶液中浸泡-晾干，调整每次浸泡时间为10min，重复该操作15次；

[0083] 3）去除模板：用5wt%的2-5mL的H3PO4溶解4小时彻底除去AAO模板；

[0084] 4）纯化纳米多药：与实施例1相同；

[0085] 5）合成表面活性剂：与实施例1相同；

[0086] 6）药物释放体系的制备：取1mLPTX+TEN多药纳米颗粒溶液（10uM/L），加入200uLPEG-PMHC18的水溶液（1mg/mL），搅拌30min使其稳定包裹；

[0087] 7）药物释放体系的稳定性表征：与实施例1相同；

[0088] 8）生物学测试：激光共聚焦荧光显微镜测试纳米多药释放体系的进细胞过程；MTT比色法测试不同剂型的体外杀伤效果；小鼠肿瘤模型表征新剂型的体内治疗效果。

[0089] 经检测，本实施制得的纳米药物的尺寸为70-80纳米，如图7所示，所制备的纳米药物的载药量为93%；静置6个月后保持稳定；具有优异的抗癌活性。

[0090] 实施例5

[0091] 模板法制备单分散性甲氨蝶呤（MTX）和他莫西芬（TAM）（摩尔比为1:1）纳米多药载药体系的方法，它包括如下步骤：

[0092] 1）制备AAO模板：与实施例1相同；

[0093] 2）制备比例精确的纳米多药：选择两种疏水抗癌药物MTX和TAM，在二甲基亚砜（DMSO）中配制成30mM/L的混合溶液，并精确控制两种药物的摩尔比为1:1，将AAO模板依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃-二甲基亚砜中超声10min处理，处理后的AAO模板在药物混合溶液中浸泡—晾干，调整每次浸泡时间为5min，重复该操作30次；

[0094] 3）去除模板：用10wt%的2-5mL的H3PO4溶解4小时彻底除去AAO模板；

[0095] 4）纯化纳米多药：与实施例1相同；

[0096] 5）合成表面活性剂：与实施例1相同；

[0097] 6）药物释放体系的制备：取1mLMTX+TAM多药纳米颗粒溶液（50uM/L），加入250uLPEG-PMHC18的水溶液（1mg/mL），超声30min使其稳定包裹；

[0098] 7）药物释放体系的稳定性表征：与实施例1相同，并在表征手段中增加了电子显微镜和数码照片的结果；

[0099] 8）生物学测试：激光共聚焦荧光显微镜测试纳米多药释放体系的进细胞过程；MTT比色法测试不同剂型的体外杀伤效果；小鼠肿瘤模型表征新剂型的体内治疗效果。

[0100] 经检测，本实施制得的纳米药物的尺寸为190纳米，所制备的纳米药物的载药量为90%；静置6个月后保持稳定；具有优异的抗癌活性。

[0101] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。