本发明属于植物保护技术领域，公开了一种诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法。本方法包括烟草疫霉菌活化、制备产生孢子囊的诱导液、诱导产生孢子囊和诱导释放游动孢子。本发明所用的诱导液为体积浓度15%～25%的贝奇野菜复合蔬果汁液和质量浓度0.05%～0.20%复合肥溶液，在诱导烟草疫霉产生孢子囊时于白色日光灯下连续光照培养。本发明方法简便、快速、无污染，可用于烟草疫霉菌致病力测定，杀菌剂对烟草疫霉菌的生物活性测定以及丝瓜品种对疫病的抗病性鉴定等研究。
1.一种诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）烟草疫霉菌活化：将烟草疫霉菌接种于PDA培养基上进行活化培养；
（2）制备产生孢子囊的诱导液：用水将市场上购买的贝奇（福建）食品有限公司生产的贝奇野菜复合蔬果汁饮料配制成体积浓度15%～25%的贝奇野菜复合蔬果汁液，灭菌后备用；制备质量浓度为0.05%～0.2%的硫酸钾型15-15-15复合肥溶液，灭菌后备用；
（3）诱导产生孢子囊：取步骤（1）已活化的烟草疫霉菌边缘菌丝块接种到步骤（2）制备的体积浓度15%～25%的贝奇野菜复合蔬果汁液中，25℃～30℃黑暗培养2d～4d；然后倾尽贝奇复合蔬果汁液，换上步骤（2）制备的质量浓度为0.05%～0.20%复合肥溶液，于光照强度500Lux～700Lux的白色日光灯下25℃～30℃连续光照培养2d～4d，即可诱导产生大量的孢子囊；
（4）诱导释放游动孢子：将步骤（3）经过诱导的烟草疫霉菌4℃～10℃放置20min～
40min，然后置于25℃～30℃，30min后即可释放出大量的游动孢子。
2.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的活化培养为25℃～30℃黑暗培养2d～4d。
3.根据权利要求2所述的诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于：所述的活化培养的温度为27℃。
4.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的水为双蒸水；
步骤（2）中所述的贝奇野菜复合蔬果汁的体积浓度为20%；
步骤（2）所述的硫酸钾型15-15-15复合肥溶液的质量浓度为0.1%。
5.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的灭菌的条件为121℃湿热灭菌25min。
6.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的诱导产生孢子囊的方法为：取步骤（1）已活化的烟草疫霉菌边缘菌丝块置于无菌的培养皿上，加入步骤（2）制备的体积浓度20%的贝奇野菜复合蔬果汁液，使果汁液刚好浸过菌丝块，27℃黑暗培养2d；然后倾尽复合蔬果汁液，换上步骤（2）制备的质量浓度为0.1%硫酸钾型15-15-15复合肥溶液，使复合肥溶液也刚好浸过菌丝块，置于光照强度600Lux的白色日光灯光照培养箱中27℃连续光照培养3d，即可诱导产生孢子囊。
7.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的诱导释放游动孢子的方法为：将步骤（3）经过诱导的烟草疫霉菌4℃放置30min，然后置于27℃，30min后即可释放出大量的游动孢子。
一种诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物保护技术领域，涉及一种诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法。
背景技术
[0002] 烟草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda de Haan）是引起丝瓜疫病的病原菌，在丝瓜生产中为害严重。在气候适宜的条件下，疫病短期即可暴发流行，造成很大的经济损失。因此，常需要获得大量无污染的烟草疫霉菌的孢子囊或游动孢子，用于监测各地烟草疫霉菌的致病力、测定各种杀菌剂对其孢子囊和游动孢子的生物学活性，以及测定丝瓜品种的抗性水平等。目前，室内获得大量烟草疫霉菌孢子囊和游动孢子的方法主要有传统培养诱导法和新鲜寄主植物材料诱导法2种。
[0003] 传统培养诱导法：将菌丝置于燕麦培养基或黑麦培养基或V8汁培养液，活化培养较长一段时间后，再加入土壤浸出液或者皮氏液，光照条件下诱导产生孢子囊，经低温处理后产生游动孢子。该方法诱导疫霉菌产生孢子囊需要10天以上，时间长。
[0004] 新鲜寄主植物材料诱导法：将活化好的疫霉菌接种到新鲜寄主植物的子叶或果实中，培养一段时间后即可诱导产生孢子囊，经低温处理后产生游动孢子。该方法所需要的时间较短，但容易遭受细菌的污染，而且植物材料较难获得。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种简便、快速诱导烟草疫霉菌产生大量无污染的孢子囊并释放游动孢子的方法，用于烟草疫霉菌致病力测定、杀菌剂对烟草疫霉菌的生物活性测定以及丝瓜品种对疫病的抗病性鉴定等研究。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，包括如下步骤：
[0007] （1）烟草疫霉菌活化：将烟草疫霉菌接种于PDA培养基上进行活化培养。
[0008] （2）制备产生孢子囊的诱导液：用水将市场上购买的贝奇（福建）食品有限公司生产的贝奇野菜复合蔬果汁饮料配制成体积浓度15%～25%的贝奇野菜复合蔬果汁液，灭菌后备用；制备质量浓度为0.05%～0.2%的复合肥溶液，灭菌后备用。
[0009] （3）诱导产生孢子囊：取步骤（1）已活化的烟草疫霉菌接种到步骤（2）制备的体积浓度15%～25%的贝奇野菜复合蔬果汁液中，25℃～30℃黑暗培养2d～4d；然后倒尽贝奇复合蔬果汁液，换上步骤（2）制备的质量浓度为0.05%～0.20%的复合肥溶液，于光照强度500Lux～700Lux的白色日光灯下25℃～30℃连续光照培养2d～4d，即可诱导产生孢子囊。
[0010] （4）诱导释放游动孢子：将步骤（3）经过诱导的烟草疫霉菌4℃～10℃放置20min～40min，然后置于25℃～30℃，30min后即可释放出大量的游动孢子。
[0011] 步骤（1）中所述的活化培养为25℃～30℃黑暗培养2d～4d；更优选的所述的活化培养的温度为27℃。
[0012] 步骤（2）中所述的水优选为双蒸水。
[0013] 步骤（2）中所述的贝奇野菜复合蔬果汁的体积浓度优选为20%。
[0014] 步骤（2）所述的复合肥优选为硫酸钾型15-15-15复合肥，所述的复合肥溶液的质量浓度优选为0.1%。
[0015] 步骤（2）中所述的灭菌的条件优选为121℃湿热灭菌25min。
[0016] 步骤（3）中所述的诱导产生孢子囊的方法优选为：取步骤（1）已活化的烟草疫霉菌边缘菌丝块置于无菌的培养皿上，加入步骤（2）制备的体积浓度20%的贝奇野菜复合蔬果汁液，使果汁液刚好浸过菌丝块，27℃黑暗培养2d；然后倾尽贝奇野菜复合蔬果汁液，换上步骤（2）制备的复合肥溶液，使复合肥溶液也刚好浸过菌丝块，置于光照强度600Lux的白色日光灯光照培养箱中27℃连续光照培养3d，即可诱导产生大量的孢子囊。
[0017] 步骤（4）中所述的诱导释放游动孢子的方法优选为：将步骤（3）经过诱导的烟草疫霉菌4℃放置30min，然后置于27℃，30min后即可释放出大量的游动孢子。
[0018] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0019] （1）快速：本发明的方法可以在5d内获得大量的烟草疫霉菌的孢子囊和游动孢子，较传统培养诱导方法相比，诱导周期可以缩短一半；与新鲜寄主植物材料诱导法的诱导周期相当。
[0020] （2）无污染：本发明的诱导液经过灭菌处理，在操作过程中亦无污染源的加入，诱导出的孢子囊和游动孢子均没有污染。
[0021] （3）诱导液可以长期保存备用：本发明的诱导液经过灭菌处理，可置于4℃冰箱中保存备用，如有需要即可拿出来使用。
附图说明
[0022] 图1是诱导烟草疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子流程图。
[0023] 图2是烟草疫霉菌标准菌株（编号：GIM3.567）产生孢子囊的结果图。
[0024] 图3是烟草疫霉菌标准菌株（编号：GIM3.567）释放游动孢子的结果图。
[0025] 图4是新鲜丝瓜疫病病样分离的烟草疫霉菌在诱导液中的生长情况图。
[0026] 图5是诱导新鲜丝瓜疫病病样分离的烟草疫霉菌产生孢子囊的结果图。
[0027] 图6是诱导新鲜丝瓜疫病病样分离的烟草疫霉释放游动孢子的结果图。
具体实施方式
[0028] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0029] 原材料规格
[0030] 贝奇野菜复合蔬果汁饮料：贝奇（福建）食品有限公司市售饮品。
[0031] 20%的贝奇野菜复合蔬果汁液：用双蒸水与贝奇野菜复合蔬果汁饮料按体积比4:1混匀，121℃湿热灭菌25min后备用。
[0032] 复合肥：硫酸钾型15-15-15复合肥料，挪威海德鲁有限公司市售肥料。
[0033] 0.1%复合肥溶液：称取1.0g的复合肥，溶解于999mL双蒸水中，121℃湿热灭菌25min后备用。
[0034] 其它实验操作所需要的培养皿、PDA培养基、移液器、灭菌锅、冰箱、蒸馏水、光照培养箱等均为实验室常规工具或材料。
[0035] 实施例1烟草疫霉菌标准菌株产生孢子囊和游动孢子
[0036] （1）在超净工作台上，将烟草疫霉菌（菌株编号：GIM3.567，购自于广东省微生物菌种保藏中心）接种到PDA培养基上，27℃黑暗培养2d。
[0037] （2）在超净工作台上，用直径为0.5cm的打孔器在菌落边缘处打孔，取1块菌丝块置于直径为6cm的无菌培养皿中，加入体积浓度为20%的贝奇野菜复合蔬果汁液5mL，27℃黑暗培养2d；然后倒尽果汁液，换上无菌的质量浓度为0.1%复合肥溶液5mL，置于光照强度600Lux的白色日光灯的光照培养箱（广东省韶关市泰宏医疗器械有限公司产品，型号：LRH-250-G），27℃连续光照培养3d。
[0038] （3）将经过上述诱导培养的烟草疫霉菌于4℃冰箱中，放置30min；然后将其置于27℃培养箱中，30min后收集液体。
[0039] （4）用量程为2.5μL移液枪吸取0.2μL的液体至于载玻片上，拖成条带，在4倍镜视野下计算游动孢子的数量。取样10次，计算出0.2μL液体中游动孢子的平均数，然后换算成每毫升游动孢子悬浮液的浓度。
[0040] 产生的孢子囊和释放的游动孢子如图2和图3所示；经测定释放的游动孢子数达5
5.92×10 个孢子/mL，释放率80%以上。
[0041] 实施例2诱导新鲜丝瓜疫病病样中分离的烟草疫霉菌菌株产生孢子囊和游动孢子
[0042] （1）取新鲜发病的丝瓜疫病病样标本，用剪刀在病健交界处剪取大小约为2mm×5mm的组织块。
[0043] （2）在超净工作台上，将组织块置于75%酒精中浸30s，然后在5%次氯酸钠溶液中浸泡漂洗1min；尔后用灭菌水换洗3次。在灭菌滤纸上吸干水后，将其转移到PDA培养基平板上，27℃黑暗培养4d。
[0044] （3）待长出菌落后，在超净工作台上挑取菌落颜色为白色的边缘菌丝块，对其进行菌丝纯化，即可获得烟草疫霉菌。
[0045] （4）在超净工作台上，将纯化后的菌株置于体积浓度为20%的贝奇野菜复合蔬果汁液中，使果汁液刚好浸过菌丝块，27℃黑暗培养2d；然后倾尽液体，换入灭过菌的质量浓度为0.1%复合肥溶液，使复合肥溶液亦刚好浸过菌丝块，置于光照强度600Lux的白色日光灯（广东省韶关市泰宏医疗器械有限公司产品，型号：LRH-250-G）的光照培养箱中，27℃连续光照培养3d。
[0046] （5）将上述经过诱导培养的菌株置于4℃冰箱中30min，然后放置于27℃培养箱中，30min后收集液体。用移液枪吸取0.2μL的液体至于载玻片上，在4倍镜视野下计算游动孢子的数量。取样10次，计算出0.2μL液体中游动孢子的平均数，然后换算成游动孢子悬浮液的浓度。
[0047] 从新鲜丝瓜疫病样分离纯化的烟草疫霉菌在诱导液的生长情况如图4所示，产生5
的孢子囊和释放的游动孢子如图5和图6所示。经测定，释放的游动孢子数1.91×10 个孢子/mL，释放率80%以上。
[0048] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
