一种低温β-琼胶酶及其编码基因与应用

摘要

本发明涉及一种低温β-琼胶酶及其编码基因与应用。该低温β-琼胶酶基因NJ21，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；低温β-琼胶酶NJ21，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还涉及低温β-琼胶酶NJ21在工业化降解琼脂糖中的应用。本发明从产琼胶酶的南极菌株中克隆获得琼胶酶的基因并可克隆到合适的宿主中实现异源表达，最终实现工业化生产琼胶酶，该低温β-琼胶酶NJ21具有较强的低温耐受力，为后续的工业应用提供成本低廉的琼胶酶起始材料。

权利要求

1.一种低温β-琼胶酶NJ21，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种低温β-琼胶酶基因NJ21，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组载体，插入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

4.一种重组细胞，转入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求1所述的低温β-琼胶酶NJ21在工业化降解琼脂糖中的应用。

说明书

一种低温β-琼胶酶及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种低温β-琼胶酶及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 琼胶酶是一种重要的海洋生物酶，在生化、临床、医药、食品等领域有着广泛的用途。琼胶降解菌分布较广，但主要存在于海洋中，在土壤、淡水中较少，海洋生态环境复杂，特别是极地（南北极）海洋环境中的微生物由于高盐度、高辐射、低温、反复冻融及特殊的光照特征可能使海洋微生物的遗传结构和生理习性发生适应性的改变，能够产生各种具有特异生理活性的酶系。因而于极地海洋微生物中分离获得的琼胶酶可能具有独特的降解活性和更高的催化活力，具有潜在的开发应用前景。

[0003] 目前，β-琼胶酶最适酶活均为常温或高温，如中国专利文献CN101845447A（申请号201010170690.7）公开了一种琼胶酶及其编码基因的获取方法。从海洋细菌需钠弧菌(保藏号:CGMCC No.2428)中首次利用多种PCR方法获取该琼胶酶基因aga41,突破了以往通过构建文库筛选琼胶酶基因的传统方法。该琼胶酶基因aga41属于β-琼胶酶中的GH50家族,全长2973bp,编码990个氨基酸,与已知琼胶酶序列相似性最高为49%。该β-琼胶酶的最适酶活温度为40℃。

[0004] 中国专利文献CN102399802A（申请号201110128971.0）公开了一种β-琼胶酶AgaXa，是由Catenivulumsp.X3的一个琼胶酶基因agaXa编码的一种新型琼胶酶。本发明的β-琼胶酶AgaXa及独特之处是在47℃（琼脂糖凝固的温度为40℃）时，酶活性稳定且酶活力高，因此本发明可以应用于从琼脂糖凝胶中回收DNA，且具有优势。本发明β-琼胶酶AgaXa能够特异的降解琼脂糖产生聚合度为6-14的新琼寡糖，能够应用于生产多聚寡糖。

[0005] 上述β-琼胶酶均需要外加热源才能达到最适酶活，因此耗费能量，处理成本较高。

[0006] 极端（南北极）海洋环境微生物是开发新型海洋活性物质的另一重要来源，微生物要在这种环境中得以生存，必须从自身的生理结构、代谢方式及生活行为各方面发生适应性的改变，因此，从这些环境中筛选得到的微生物，可能具备某些特殊的生理活性，能够产生某种特殊的代谢产物。南极海洋细菌中，77%是耐冷型，23%为嗜冷型。低温微生物具有不易受杂菌污染、作用条件要求简单、高酶活力及高催化效率等优势，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热及冷却系统，因而在节能方面有较大的优势。

发明内容

[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种低温β-琼胶酶及其编码基因与应用。

[0008] 本发明技术方案如下：

[0009] 一种低温β-琼胶酶NJ21，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0010] 上述低温β-琼胶酶基因NJ21，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0011] 一种重组载体，插入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

[0012] 一种重组细胞，转入了上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或上述重组载体。

[0013] 上述低温β-琼胶酶在工业化降解琼脂糖中的应用。

[0014] 有益效果

[0015] 本发明从产琼胶酶的南极菌株中克隆获得琼胶酶的基因并可克隆到合适的宿主中实现异源表达，最终实现工业化生产琼胶酶，该低温β-琼胶酶NJ21具有较强的低温耐受力，为后续的工业应用提供成本低廉的琼胶酶起始材料。

附图说明

[0016] 图1为不同pH条件对β-琼胶酶活性的影响曲线；

[0017] 图2为不同温度条件对β-琼胶酶活性的影响曲线；

[0018] 图3为经SDS-PAGE电泳获得的电泳图；

[0019] 图4为低温β-琼胶酶NJ21酶液4℃置于固体平板培养基上7天后的照片。

具体实施方式

[0020] 下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

[0021] 培养基

[0022] 分离培养基（又名：Zobell 2216E海水培养基）组分如下：蛋白胨5g，酵母粉1g，用过滤后的陈海水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

[0023] 分离平板培养基组分如下：蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂15g，用过滤后的陈海水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

[0024] LB液体培养基组分如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，用去离子水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

[0025] LB平板培养基组分如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g,琼脂15g，用去离子水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

[0026] 微生物材料的获得：

[0027] 微生物样品采自于中国第24次南极科学考察采集的海冰样品，采用分离平板培养基在温度为10℃的条件下，经3次划线培养挑取单克隆，制得菌株NJ-21，经16S DNA鉴定确定该菌为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）属。将纯化的菌株加入含30wt%的甘油溶液中，保存于-80℃超低温冰箱中。

[0028] 实施例1：

[0029] 产β-琼胶酶南极菌株的基因组文库的构建

[0030] （1）制备目的DNA片段

[0031] 将交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）NJ-21种子液接种于Zobell 2216E海水培养基中，于10℃、150rpm的振荡培养箱中培养3d后，用细菌基因组提取试剂盒（购自Tiangen公司，DP302-02）提取染色体DNA，检测其电泳DNA浓度，DNA长度大于40kb，符合建库要求。

[0032] （2）基因组DNA的部分消化

[0033] 交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）NJ-21染色体DNA经Sau3AI内切酶部分消化，Sau3AI内切酶酶切60min后，制得插入片段。酶切60min后，染色体DNA刚好酶切完全，适用于构建基因组文库；当酶切时间超过80min后，酶切过度，各片段不是平均分布，而多为小片段，不利于建库。因此选酶切60min作为菌株NJ-21染色体DNA的不完全酶切时间。

[0034] （3）基因组文库的构建

[0035] 按照pET22b载体（购自Novagen公司）和插入片段约1:3的摩尔比作连接反应。反应体系于16℃连接过夜，浓缩连接产物至3μl，分别取1μl转化感受态细胞E.coli DH5α，培养后涂布与含有氨苄青霉素（50μg/ml）、IPTG（20μg/ml）和X-Gal（40μg/ml）的LB平板培养基上，于37℃静置培养过夜至可见菌落，根据菌落蓝白斑反应筛选转化子。
随机挑取约20000个菌落作为基因组文库的克隆保存，从平板中随机挑选16个白色单菌落，提取质粒，用BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M经PCR扩增目的片断，引物序列如下：

[0036] BcaBEST Primer M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

[0037] BcaBEST Primer RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

[0038] PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸240s，30个循环；72℃延伸10min。

[0039] 经检测每个克隆均有外源DNA，最小插入片段为800bp左右，最大插入片段6kb左右，平均插入片段大小约为4kb左右。

[0040] 实施例2

[0041] 低温β-琼胶酶NJ21全序列的获取

[0042] 从基因组文库中筛选一个周围有明显水解圈的克隆。提取重组质粒，提取重组质粒并测序，获得低温β-琼胶酶NJ21完整的ORF。ORF的完整长度为2382bp，共编码794个氨基酸，计算其理论分子量为88kDal。

[0043] 实施例3

[0044] 低温β-琼胶酶NJ21的重组表达质粒和重组菌株的构建

[0045] 将本发明获得的低温β-琼胶酶基因NJ21克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。首先基于全长序列，设计扩增全基因的引物：

[0046] 上游引物F-ACGCGTCGACATGAACGCCAGTAAAAAGCTTTTGT；

[0047] 下游引物R-CCGCTCGAGTTATTTTGAACCGAAACGACGCTCG；

[0048] PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用XhoⅠ内切酶和SalⅠ内切酶双酶切PCR产物，切胶回收酶切后的片段，和同样经过XhoⅠ内切酶和SalⅠ内切酶双酶切的质粒pET22b连接，转化到大肠杆菌TOP10中，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒（购自Tiangen公司）提取阳性克隆的质粒，经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为低温β-琼胶酶基因NJ21；该基因编码793氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0049] 将上述制得的阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中，构建表达重组菌株；具体过程如下：

[0050] 取-80℃保存的BL21，于冰上融化，以预冷的移液管枪尖吸取10μl重组质粒，加入刚刚融化的BL21；轻摇混匀，冰浴放置30min，迅速转移到42℃水浴中，准确放置90秒；迅速转移到冰上，冷却2min；然后加入800μl LB液体培养基，于37℃，150rpm，45min；涂布含氨苄青霉素100μg/mL的LB平板培养基过夜培养。

[0051] 实施例4

[0052] 利用重组表达菌株表达低温β-琼胶酶NJ21

[0053] 将实施例3构建好的表达重组菌株转接到100ml含有氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基中，37℃扩大培养直至菌液OD600值达0.5时，15℃冷却30min，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为0.5mmol/L，15℃摇床培养24h。低温离2+
心收集上清，浓缩冻干。然后进行Ni 亲和层析，由于表达的重组蛋白N端含有6×His tag，能亲和吸附到层析柱中，经不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱后，收集洗脱液。经SDS-PAGE电泳检测，如图3所示，切胶分离得到低温β-琼胶酶NJ21。

[0054] 实施例5

[0055] 低温β-琼胶酶NJ21的活性检测和酶特性分析

[0056] 利用DNS（3,5-二硝基水杨酸）方法测定实施例4制得的低温β-琼胶酶NJ21活性。具体操作如下：

[0057] 分别取1mL灭活的与没灭活的低温β-琼胶酶NJ21酶液和2mL底物溶液(含有0.25wt%的琼脂糖)于30℃温度恒温水浴反应30min，取1mL反应产物加入到1.5mL DNS溶液中，沸水浴5min。而后迅速冷却至室温，加蒸馏水至25mL，混匀在520nm波长下测OD值。
测得的β-琼胶酶活性为1200U/ml。

[0058] 另外，将实施例4制得的低温β-琼胶酶NJ21酶液直接滴于固体平板培养基上，在4℃放置7天后，可以观察到明显的凹陷，用碘液染色后可以看到透明圈，表明低温β-琼胶酶NJ21是具有琼胶降解活性的，为后续的研究和应用提供了良好材料。

[0059] 为测定不同温度对低温β-琼胶酶NJ21活力的影响，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃进行酶促反应30min，DNS法测定低温β-琼胶酶NJ21的酶活。以酶活最高值为100%计算其相对酶活力。

[0060] 为测定不同pH对低温β-琼胶酶NJ21活力的影响，分别用不同的pH的PBS缓冲液(pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、Tris–HCl缓冲液(pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)配制成质量分数为2%的琼脂糖溶液作为底物，30℃进行酶促反应30min用DNS法测定低温β-琼胶酶NJ21的酶活。以最高酶活力为100%计算其相对酶活力。

[0061] 经测定，低温β-琼胶酶NJ21的最适pH为7.5(图1)，最适反应温度为30℃(如图2)，在温度为5℃的条件下，该酶仍具有40%左右的酶活，较现有β-琼胶酶具有明显的低温耐受性特性。