植物根部特异表达Bt-cry6A晶体蛋白在根结线虫防治中的应用

摘要

本发明“植物根部特异表达Bt-cry6A晶体蛋白在根结线虫防治中的应用”涉及植物转基因技术，本发明提供用于在植物的根中特异表达Bt-cry6A基因的重组表达载体pBP-bt06，以及将该表达载体转化番茄的转基因方法。本发明合成的基因是对密码子进行优化的。将优化后的编码Bt-Cry6A晶体蛋白的人工基因转入番茄品种。实验结果表明，本发明成功获得了在根部特异表达Bt-cry6A基因的转基因番茄。

权利要求

1.用于在番茄根部特异表达Bt-cry6A基因的重组表达载体pBP-bt06，骨架载体为pBI121，启动子为DNAβpromotor，外源基因为SEQ ID No.4所示的优化Bt-cry6A基因。

2.转入有权利要求1所述的重组表达载体pBP-bt06的菌株。

3.根据权利要求2所述的菌株，指转入有权利要求1所述的重组表达载体pBP-bt06的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。

4.一种获得抗根结线虫的转基因番茄的方法，包括如下步骤：

(1)构建含有苏云金芽孢杆菌的Bt-cry6A基因的根部特异性重组表达载体，(2)将重组表达载体转入到番茄中，筛选能够表达Bt-cry6A蛋白的阳性转化子，所述重组载体指权利要求1所述的重组表达载体pBP-bt06。

5.根据权利要求4所述的方法，所述将重组表达载体转入到番茄中，筛选能够表达Bt-cry06蛋白的阳性转化子，包括如下步骤：(1)准备植物转化外植体，

(2)制备农杆菌转化液，所述农杆菌指转入有重组表达载体pBP-bt06的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，(3)农杆菌转化液侵染外植体，然后共培养，

(4)对共培养的外植体进行选择培养以分化愈伤组织，

(5)生根培养分化的愈伤组织获得转基因植株。

6.根据权利要求5所述的方法，

所述准备植物转化外植体包括外植体预培养，指将取自番茄幼苗的外植体放置在MS+50μg/μl乙酰丁香酮的固体培养基上，光照预培养2天，所述共培养指采用MS+100μg/μl乙酰丁香酮的固体培养基，避光培养2天，所述选择培养指采用MS+2mg/L6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧苄青霉素+50μg/ml卡那霉素+10μg/ml玉米素的培养基，26-28℃，光照培养16h，所述生根培养指长到2～3厘米的分化良好的愈伤组织转移到生根培养基MS+0.25mg/LIAA+25μg/ml卡那霉素+200μg/ml头孢霉素上。

7.根据权利要求5或6所述的方法，所述制备农杆菌转化液指采用1/2浓度的液体MS+200μg/μl乙酰丁香酮为悬浮剂悬浮菌体。

说明书

植物根部特异表达Bt-cry6A晶体蛋白在根结线虫防治中

的应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物病虫防治技术领域，特别是涉及一种由根部特异启动子DNA-βpromoter驱动的Bt-cry6A基因植物表达载体及其在根结线虫防治和研究中的应用。

背景技术

[0002] 根结线虫是农业生产上危害最为严重的植物寄生线虫之一，其适应性强、传播途径多样、寄主范围包括单子叶与双子叶草本或木本植物等2000多种植物。近年来，随着对线虫侵染方式，植物自身抗病防御体系研究的不断深入，以及分子生物学理论和生物工程技术的不断发展，抗线虫基因的分子遗传操作技术已趋向成熟，为利用植物自身防御体系及线虫自身生理生化特点，通过基因工程手段，建立一个具有高效、经济、环保的线虫综合控防策略成为可能（Atkinson HJ,Urwin PE,McPherson MJ.Engineering plants for nematode resistance.Annual Review of Phytopathology，2003.41(1):615-639.；Williamson VM,Hussey RS.Nematode pathogenesis and resistance in plants.Plant Cell，1996，8：1735-1745；Williamson VM.Plant nematode resistance genes.Current Opinion in Plant Biology,1999,2:327-331；Williamson VM,Gleason CA.Plant-nematode interactions.Current Opinion in Plant Biology，2003，6：
327-333）。

[0003] 在过去的植物基因工程研究中，人们常使用组成型启动子表达外源基因，在这类启动子的控制下，外源基因在转基因植物所有的细胞以及整个发育阶段都表达。然而外源基因在受体植物体内持续、高效地表达，可能会改变植物的某些性状，从而对植物生长发育产生不利影响，严重地会导致植株死亡；另外，这种持续的组成型表达，从植物能量消耗角度来讲也是一种浪费，还可能带来食品安全性问题。严格地讲，组织特异性的启动子更适用于生产外源蛋白，因为这些蛋白可以集中表达在植物的某些部位从而更便于产物的加收。此外，根是植物生长发育的重要器官，也是根结线虫侵染植物的主要途径，研究根特异性启动子对根结线虫的防治具有重要意义。所以从植物生长发育和经济有效的角度以及抗病性的研究方面考虑，根组织特异性启动子也具有研究和应用价值。关翠平分离鉴定TYLCCNVY10分子上DNAβC1基因启动子（GeneBank登录号A3J19675)，组织化学检测表明，该启动子能够驱动gus基因在转基因植株的根部及韧皮部细胞特异性表达，是花椰菜花叶病毒(CMV)355启动子活性的10~16%（Cuiping Guan,Xueping Zhou，Phloem specific promoter from a satellite associated with a DNAvirus，Virus Research115(2006)150-157）。

[0004] 产芽孢的苏芸金杆菌是一种能够杀死昆虫的土壤微生物，这种微生物分泌两种蛋白，一种是外毒素，另一种是内毒素。外毒素是由vip3a基因编码，在营养生长期从菌体中分泌出来，研究表明β-外毒素对线虫有效（Devidas and Rehberger,1992）（Devidas P.and Rehberger L.A.The effects of exotoxin(Thuringiensin)from Bacillus thuringiensis on Meloidogyne incognita and Caenorhabditis elegans.Plant and Soil.1992,145(1):115-120.）。第二类毒素为δ-内毒素，是由cry基因族编码，在孢子产生时以包涵体的形式产生的。cry5B编码的蛋白对秀丽线虫具有毒性，且线虫的中肠受到了破坏，对于雄虫、二龄幼虫和不育的突变体具有致命的效果；秀丽线虫的突变体对cry5B产生了抗性，对cry6A敏感，这一点表明线虫与蛋白的结合区域具有一定的特异性（Marroquin L.D.,Elyassnia D.,Griffitts J.S.,Feitelson J.S.and Aroian R.V.Bacillus thuringiensis(Bt)toxin susceptibility and isolation of resistance mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.Genetics.2000,155(4):1693-1699）。Marroquin研究表明了这种蛋白在根中的表达对线虫具有有效的防治作用（Marroquin L.D.,Elyassnia D.,Griffitts J.S.,FeitelsonJ.S.and Aroian R.V.Bacillus thuringiensis(Bt)toxin susceptibility and isolation of resistance mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.Genetics.2000,155(4):1693-1699）。

[0005] 目前，利用Bt防治植物寄生线虫的研究很少，尤其是在根部表达Bt杀虫基因，迄今没有这方面的报道。

发明内容

[0006] 本发明根据上述领域存在的空白和根结线虫防治的需要，提供一种由根部特异启动子DNAβ驱动Bt-cry6A基因超表达的植物表达载体及该载体用于防治根结线虫的方法。

[0007] 用于在植物根部特异表达Bt-cry6A基因的重组表达载体pBP-bt06，骨架载体为pBI121，启动子为DNAβpromotor，外源基因为序列为SEQ ID No.4所示的优化Bt-cry6A基因。

[0008] 转入有上述重组表达载体的菌株。

[0009] 所述菌株指转入有pBP-bt06的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105。

[0010] 一种研究苏云芽孢杆菌基因功能的新方法,其特征在于，将上述重组表达载体转化到根癌农杆菌中，然后转化植物，通过观察转基因植株，确定此基因对根结线虫的防治效果。

[0011] 一种获得抗根结线虫的转基因植物的方法，包括如下步骤：

[0012] （1）构建含有苏云金芽孢杆菌的Bt-cry6A基因的根部特异性重组表达载体，[0013] （2）将重组表达载体转入到宿主植物中，筛选能够表达Bt-cry6A蛋白的阳性转化子。

[0014] 所述重组载体是pBP-bt06。

[0015] 所述将重组表达载体转入到番茄中，筛选能够表达Bt-cry6A蛋白的阳性转化子，包括如下步骤：

[0016] （1）准备植物转化外植体，

[0017] （2）制备农杆菌转化液，

[0018] （3）农杆菌转化液侵染外植体，然后共培养，

[0019] （4）对共培养的外植体进行选择培养以分化愈伤组织，

[0020] （5）生根培养分化的愈伤组织获得转基因植株。

[0021] 所述准备植物转化外植体包括外植体预培养，指将取自番茄幼苗的外植体放置在MS+50μg/μl乙酰丁香酮的固体培养基上，光照预培养2天，

[0022] 所述共培养指采用MS+100μg/μl乙酰丁香酮固体培养基，避光培养2天。

[0023] 所述选择培养指采用MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧苄青霉素+50μg/ml卡那霉素+10μg/ml玉米素，26-28℃，光照培养16h，

[0024] 所述生根培养指长到2～3厘米的分化良好的愈伤组织转移到生根培养基MS+0.25mg/LIAA+25μg/ml卡那霉素+200μg/ml头孢霉素上。

[0025] 所述制备农杆菌转化液指采用1/2浓度的液体MS＋200μg/μl的乙酰丁香酮为悬浮剂悬浮菌体。

[0026] 本发明提供优化的Bt-Cry6A核苷酸序列。为使Bt-Cry6A基因其更适合于在植物中表达，本发明对表达Bt-Cry6A晶体蛋白Seq ID No2的初始核苷酸序列Seq ID No3的密码子进行优化并合成。合成后的核苷酸序列Seq ID No.4。

[0027] 本发明提供一种由根部特异启动子驱动Bt基因超表达的植物载体，其特点就是在骨架载体中插入有特异性启动子和BT基因，关于骨架载体，本领域技术人员可能选出很多用于超表达载体构建的常规骨架载体，构建方法也是替换掉原有的组成型启动子，插入Bt-cry6A基因。

[0028] 本发明优选骨架载体为农杆菌介导的表达载体，农杆菌能够携带目的基因转移到多种生物体内，除了自然界的植物之外，还包括酵母、丝状真菌以及人的细胞等。与传统的转化方法相比，AMT技术转化效率高且遗传稳定性好的优点，因此，构建成农杆菌介导的超表达载体有利于使作用片段转入到较多种类的宿主中使其表达目的基因，用于毒杀根结线虫。

[0029] 本发明的优选实施方式中，以pBI121为骨架载体，以DNA-βpromotor基因中的如Seq ID No.1所示的全长及Bt-cry6A基因中的如Seq ID No.4所示的全长构建了超表达载体pBP-bt06。

[0030] 本发明还提供了将构建的超表达载体pBP-bt06转入到番茄中获得转基因番茄的优选具体实施方式，经验证获得了根部特异性表达Bt-cry6A蛋白的转基因植株。经鉴定该转基因植株的Bt-cry6A蛋白基因只在根部表达，在植物地上部分并不表达。

[0031] 本发明的实施例中，将构建的超表达载体pBP-bt06转入到番茄中，获得了可用于根部特异性表达Bt-cry6A蛋白的转基因植株。经鉴定在特异基因只在根部表达，在植物地上部分并不表达。

[0032] 番茄是受根结线虫危害最严重的蔬菜作物之一，也是植物分子生物学与生物技术研究的模式作物，具有较好的基因组信息研究、突变体材料；侵害番茄的根结线虫有7种以上，其中主要是南方根结线虫。与烟草和拟南芥相比，以番茄为受体材料，对线虫的抗性研究更具有实际意义。本发明将Bt-cry6A基因转入番茄中，对转基因番茄植株接种南方根结线虫，结果表明，转基因植株的根结和卵块数量显著降低。为番茄提供了可靠有效的线虫防治策略。

[0033] 本发明将空载体以相同方法转入番茄中作为参照，将2龄幼虫接种到T1代植株，45天后发现转本发明的表达Bt-cry6A基因植株的根结和卵块数量显著低于对照组植株，并且转空载体植株的根结和卵块数量与非转基因植物无差别。充分说明Bt-cry6A基因可抑制线虫的发育与寄生，表明此发明在根结线虫的防治中具有重要的应用价值。

附图说明

[0034] 图1.载体pBI121结构图

[0035] 图2.目的基因DNAβpromoter结构图

[0036] 图3.载体pBP121结构图

[0037] 图4.目的基因Bt-cry6A结构示意图

[0038] 图5.载体pBP-bt06构建流程图

[0039] 图6.酶切鉴定重组载体pBP-bt06图

[0040] 图7.T0代转基因番茄植株靶标基因在叶片和根尖的PCR检测

[0041] 图8.转基因T0代植株的Southern杂交检测

[0042] 图9.T0代转基因番茄植株RT-PCR检测

[0043] 图10.转基因番茄的根部接种线虫45天后的根部照片

[0044] A：转基因植株的根部；B：转空载体植株的根部；C：对照植株的根部具体实施方式

[0045] 以下通过试验及数据具体说明本发明的实施和其取得的有益效果。

[0046] 生物材料：

[0047] 南方根结线虫（Meloidogyne incognita），本实验室保存。

[0048] 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105，本实验室保存。

[0049] 植 物材 料 番 茄（Solanum lycopersicum），品 种 Moneymaker（在 MAGDALENA ROSSI,FIONA L.GOGGIN,STEPHEN B.MILLIGAN,ISGOUHI KALOSHIAN,DIANE E.ULLMAN,AND VALERIE M.WILLIAMSON.The nematode resistance gene Mi of tomato confers resistance against the potato aphid.Proc.Natl.Acad.Sci.USA:95(1998):9750–9754.中记载），本实验保存。

[0050] 骨架载体pBI121为已知载体（见Rugang Chen,Hanxia Li,Liying Zhang,Junhong Zhang,Jinghua Xiao,Zhibiao Ye.CaMi,a root-knot nematode resistance gene from hot pepper(Capsium annuum L.)confers nematode resistance in tomato.Plant Cell Rep(2007)26:895–905），由本实验室保存。

[0051] 特 异 启 动 子 DNA-βpromotor 基 因（Cuiping Guan,Xueping Zhou，Phloem specific promoter from a satellite associated with a DNA virus，Virus Research115(2006):150–157），由浙江大学周雪平教授惠赠。

[0052] 苏云芽孢杆菌目的基因Bt-cry6A由本实验合成。

[0053] 申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，可向公众发放用于验证试验。

[0054] 主要仪器和试剂

[0055] 仪器：冷冻离心机、恒温培养箱、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、水浴锅、移液器、匀浆器、离心管、枪头、烧杯和pH计等。

[0056] 试剂：

[0057] 柱式DNA小量抽提试剂盒和柱式DNA胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker2Kplus和克隆所用的大肠杆菌感受态细胞等均购自全式金生物公司；

[0058] TA克隆试剂盒、限制性内切酶HindIII、BamH Ⅰ、Xba Ⅰ和Sac Ⅰ等均购自Takara生物公司。

[0059] MS培养基粉末购自SIGMA公司。

[0060] TAE缓冲液（50×）：Tris碱242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/L EDTA（pH8.0）100ml。

[0061] LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

[0062] MS+AS：

[0063] 卡那霉素：溶于水中，配制浓度为10mg/ml，储存于-20℃；

[0064] 氨苄青霉素：溶于水中，配制浓度为10mg/ml，储存于-20℃；

[0065] 利福平：溶于甲醇中，配制浓度为10mg/ml，储存于-20℃，使用时稀释为34μg/ml；

[0066] 头孢霉素：溶于水中，200mg/ml，储存于-20℃，使用时稀释为400μg/ml。

[0067] 乙酰丁香酮（AS）：100mM，用无水乙醇溶解，放置于-20℃。

[0068] 实施例1：构建根部特异启动子DNA-β驱动的植物表达载体pBP-121[0069] 载体pBP-121的构建，主要以常规载体pBI-121为骨架（图1），对其T-DNA区加以改造，用限制性内切酶HindIII、BamH Ⅰ将的35S启动子片段双酶切切掉，回收载体大片段（约14kb）；同时，用同样的内切酶酶切带有目的基因DNAβpromotor的T载体，回收目的基因片段（SEQ ID No.1）。而DNAβpromotor片段（图2）的粘性末端和pBI-121线状载体的粘性末端恰好匹配，连接后构建植物表达载体pBP-121（图3）。酶切鉴定阳性克隆后测序确认。实施例2：构建根部特异启动子DNA-β驱动Bt-cry6A基因的超表达植物载体—pBP-bt06

[0070] 载体pBP-bt06的构建，主要以构建的含根部特异启动子的载体pBP-121为骨架，对其T-DNA区加以改造，用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ将启动子下段的GusA基因切掉，电泳回收载体大片段（约13kb）；而线状载体和外源合成基因核苷酸序列如SEQ ID No.4的粘性末端恰好匹配，连接后构建植物表达载体pBP-bt06。酶切鉴定阳性克隆后测序确认,外源合成基因核苷酸序列如SEQ ID No.4。构建流程示意图见图5。构建过程中得到的载体均转化大肠杆菌DH5α菌株，培养后提取质粒，并用XbaI/SacI双酶切检测其正确性（图6）。经检测载体构建成功，用于后续实验。

[0071] 实施例3.获得抗线虫转基因植株

[0072] 本实验以根癌农杆菌为介导，把装载有Bt-cry6A基因的pBP-bt06转化到番茄中。通过优化转化条件，提供了成功将pBP-bt06转化到番茄中，并获得转基因植株的方法。

[0073] 3.1根癌农杆菌的培养

[0074] 1．将根癌农杆菌划线接种在LB培养基上，28℃恒温培养2-3天；

[0075] 2．挑取单个菌落接种于基本培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h；

[0076] 3．在离心管中收集菌体，加入液体诱导培养基，使OD600调节至0.20左右，28℃，200rpm振荡培养6h，OD600升高到0.4左右时即可停止。

[0077] 3.2农杆菌感受态制作：

[0078] （1）挑取农杆菌EHA106单菌落，接种于20ml液体LB培养基中（含有50mg/L的利福平），28℃，200rpm培养48h；

[0079] （2）转接500μl摇培的EHA106至50ml液体LB（含有50mg/L的利福平）培养基中，28℃，200rpm培养至OD600值为0.6左右；

[0080] （3）将菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，弃上清；

[0081] （4）用50ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；

[0082] （5）用25ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；

[0083] （6）用10ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；

[0084] （7）用1-2ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，分装50μl/管，液氮中速冻后-80℃保存。3.3电转法转化农杆菌：

[0085] 1．冰上融化农杆菌感受态细胞50μl;

[0086] 2．将1μl pBP-bt06和pBP-121质粒分别加入到50μl农杆菌感受态细胞中，轻弹混匀，在离心管中混匀后转移到电击杯中，冰浴30s-60s；

[0087] 3．将电击杯放在适当的位置，按住电击按钮进行电击；

[0088] 4．加500μl不含任何抗生素的LB液体培养基，28℃，220rpm，振荡培养3h，活化菌体；

[0089] 5．用灭菌枪头将菌液混匀，吸取100μl均匀涂于LB固体培养基（卡那50mg/L和利福平50mg/L）上，28℃培养48h。

[0090] 6．提取农杆菌质粒进行酶切鉴定或通过菌液PCR进行检测。

[0091] 3.4侵染菌液的制备：

[0092] 1．取转化后的农杆菌划线接种于LB固体培养基上，28℃培养48h，至单菌落出现；

[0093] 2．挑取单菌落接种于LB液体培养基中，28℃，220rpm，振荡培养，OD600达到0.6左右时终止；

[0094] 3．5000rpm离心10min，弃上清，沉淀物即为收集的菌体；

[0095] 4．将菌体用1/2浓度的液体MS培养基洗涤两遍。

[0096] 5．为提高农杆菌的转化效率，加悬浮液悬浮菌体，悬浮液为1/2浓度的液体MS加入200μg/μl的乙酰丁香酮（AS），悬浮后立即用于侵染。

[0097] 3.5番茄转化外植体的准备

[0098] 1．番茄种子用无菌水浸泡洗涤两遍。

[0099] 2．用70%的乙醇浸泡番茄种子2min。

[0100] 3．弃去乙醇，加无菌水洗涤两次。

[0101] 4．弃去无菌水，用20%的次氯酸钠消毒15min。轻摇容器，加大种子与溶液的接触。

[0102] 5．弃去次氯酸钠，用无菌水漂洗5-6次后吸干多余水分。

[0103] 6．将种子移入装有MS培养基的三角瓶中，每瓶20～30粒，均匀摆放。

[0104] 7．26-28℃避光培养出芽后光照培养6-7天至子叶张开角度120度。3.6番茄转化外植体的预培养

[0105] 将待切番茄幼苗放在牛皮上，用镊子夹住幼苗胚轴部分，使两片子叶重叠、平铺于培养皿底部，将子叶顶端切去，然后在靠近叶柄部位切一刀，切下方形子叶块；胚轴截为小段。放置在MS+50μg/μl AS培养基上，光照，预培养2天。

[0106] 3.7番茄外植体转化共培养

[0107] 1．将预培养2d的子叶和胚轴从培养皿中移出，放入盛有农杆菌菌液的锥形瓶中，轻轻摇荡，侵染10min，控制侵染时间，以免时间较长农杆菌过量，污染外植体，同时时间长外植体容易褐化，时间短则侵染效率低。

[0108] 2．取出后用液体MS冲洗后置无菌滤纸上吸干，转入MS+100μg/μlAS共培养基平皿。

[0109] 3．避光，共培养2天。

[0110] 3.8番茄转化外植体选择分化

[0111] 将共培养结束的外植体转到筛选培养基上（MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧苄青霉素+50μg/ml卡那霉素+10μg/ml玉米素），26-28℃，16h光照培养，分化绿色愈伤组织。

[0112] 3.9番茄转化继代

[0113] 每2周继代一次，弃去愈伤生长不良者，将苗移入新的培养基中。待小苗长到2-3cm，再转到生根培养基上（MS+0.25mg/LIAA+25μg/ml卡那霉素+200μg/ml头孢霉素）。
待小苗长出4-5条根，并有大量侧根生出时进行炼苗，待根系发达后移栽到灭菌的土中。待苗长到四片叶时，取根和叶片进行鉴定。

[0114] 3.10植物基因组DNA提取

[0115] 1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ，60℃水浴预热。

[0116] 2.分别取番茄新鲜叶片和根尖，在研钵中加液氮磨成粉状后至于1.5ml离心管中，立即加入预热的提取缓冲液Ⅰ，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30-60分钟(时间长，DNA产量高)，不时摇动。

[0117] 3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

[0118] 4.室温下5000rpm离心5分钟。

[0119] 5.仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

[0120] 6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。

[0121] 7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

[0122] 8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。

[0123] 9.加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10分钟，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

[0124] 10.加入1/10体积的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀。

[0125] 11.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。

[0126] 12.将DNA重溶解于1ml TE，-20贮存。

[0127] 13.取2μl DNA样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。

[0128] 3.11转基因番茄植株的PCR检测

[0129] 以具有卡那抗性的转基因番茄植株新鲜叶片和根尖提取的DNA分别作PCR扩增模板。利用下列特异引物进行PCR扩增。根尖DNA能扩增出特异条带的植株即初步鉴定为阳性植株，由于是根部特异表达，因此叶片部分无特异条带。

[0130] 扩增引物序列如下：

[0131] 检测Bt-cry6A基因的特异引物

[0132] BT6F1：TCTAGAATGATTATCGAT

[0133] BT6R1：GGATCCTTAGTTGTTGTA

[0134] PCR反应体系：

[0135]

[0136]

[0137] PCR反应程序：95℃30sec

[0138] 58℃30sec

[0139] 72℃2min 35cycles

[0140] 72℃10min

[0141] PCR产物用浓度为1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

[0142] 随机提取5株转基因阳性番茄，以靶标基因的特异引物进行PCR检测，可以看出5份材料的根部均可扩增出约1500bp的特异条带，而对应的叶片DNA则没有扩增特异性条带，对照载体质粒，同样扩增出约1500bp的特异条带，分别测序结果与合成的Bt-cry6A基因完全一致。说明启动子是根部特异启动子，靶标基因只在根部表达，而在叶部不表达(图7)。实验同时验证在其它器官，如茎，花，果实等，同样没有特异片段。

[0143] 3.12转基因番茄的Southern杂交鉴定

[0144] 取PCR检测阳性番茄植株，提取植物总DNA，按下表建立单酶切反应体系：

[0145]

[0146] 37℃酶切过夜后用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后进行southern杂交检测。

[0147] 对转基因的T0代植株进行Southern检测，探针分别为464bp的Bt-cry6A基因的片段Sequence No.5，扩增探针序列的引物为BT6F2：GACATCGCTTCATACG GT，BT6R2:TAAACCACGAATCCCAAC。随机选取PCR阳性植株，大量提取基因组DNA进行Southern检测。基因组DNA转膜前用EcoR I单酶切，以检测外源基因插入位点情况。结果表明，基因组DNA EcoR I。单酶切后，可见到外源DNA在番茄基因组中有不同的插入位点，有的是一个插入位点，有的是多个插入位点，从而确证目的基因已插入并整合到番茄基因组上（图8）。

[0148] 3.13RT-PCR检测

[0149] 提取获得的12株转基因阳性植株的根尖RNA,采用TRIZOL Reagent试剂盒，按照说明书操作；反转录合成cDNA后进行PCR检测，回收PCR产物测序分析。提取12份材料的RNA，进行反转录PCR，引物为BT6F3：CATTGTTGGGATTCGTGG，BT6R3：TCTGCCTAGAGTTAGTTG。其中10份材料扩增出特异的片段（402bp）Sequence No.6，回收PCR产物进行测序，测序结果表明与转基因的片段序列一致。说明靶标基因已整合到植物基因组中并在植物基因组中表达（图9）。

[0150] 3.14接种南方根结线虫

[0151] 将鉴定的12株转基因阳性番茄接种线虫，每株200条线虫，同时以转入空载体基因的番茄和温室栽培的番茄做对照。45天后观察根结和卵块数量(图8)，结果表明，转基因番茄的根结和卵块数量与对照存在p=0.05和p=0.01水平上具有显著差异，转基因番茄的根结数量为转空载体植株的67%左右，但是转基因番茄的卵块数量为对照的45%左右（表1）。同时，卵块的孵化率明显不同，转基因植株上的卵块孵化率仅为对照的38%左右。充分说明Bt-cry6A基因可以抑制线虫的寄生、发育与繁殖。说明Bt-cry6A在植物抗线虫的基因工程中具有应用价值，同时由于载体是根部特异的，因此不影响地上部分，具有一定的转基因安全性，因此，植物根部特异表达Bt-cry6A晶体蛋白可在根结线虫防治中进行应用。

[0152] 表1番茄根部根结和卵块数量

[0153]Number of root knots Number of egg masses
Control 76.3±4.5aA 58.2±3.5aA
空载体 75.7±1.5aA 56.7±1.5aA
Bt-cry6A 50.3±1.5bB 30.2±1.5bB