合成的滑液组合物及其制备方法

摘要

公开了人工的或合成的滑液及其制备这种滑液的方法。所述液体含有选定的蛋白质、磷脂和透明质酸并模拟了人体滑液的特性。

权利要求

1.合成的液体组合物，含有

a)6-18mg/ml的白蛋白；

b)4-12mg/ml的γ球蛋白，其中所述白蛋白与所述γ球蛋白之比为1.7:1至2.3:1；

c)0.04-0.1mg/ml的磷脂；

d)2-4mg/ml的透明质酸；

e)在磷酸盐缓冲液中，所述组合物的pH值为7.0-7.4，且重量克分子渗透浓度为

280-320mOsm/kg，其中所述合成的液体组合物整体上不含牛或其它哺乳动物血清作为所述合成的液体的组分。

2.如权利要求1的液体组合物，含有12mg/ml的白蛋白。

3.如权利要求1的液体组合物，含有7mg/ml的γ球蛋白。

4.如权利要求1的液体组合物，含有0.1mg/ml所述磷脂。

5.如权利要求4的液体组合物，其中所述磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱。

6.如权利要求1的液体组合物，含有2mg/ml的透明质酸。

7.如权利要求1的液体组合物，其中所述液体为非牛顿性液体。

8.如权利要求1的液体组合物，其中在37℃下所述液体组合物的粘度随剪切率的增加而降低。

9.一种制备合成滑液的方法，包括：a)加入磷脂至磷酸盐缓冲液中形成混悬液；

b)搅拌所述混悬液选定的一段时间；

c)加入透明质酸至所述混悬液中，并混合以溶解所述透明质酸于所述混悬液中；

d)加入白蛋白，并混合以溶解所述白蛋白至所述混悬液中；和e)加入γ球蛋白，并混合以溶解所述γ球蛋白至所述混悬液中，使得形成包含

6-18mg/ml白蛋白、4-12mg/mlγ球蛋白、0.04-0.1mg/ml磷脂和2-4mg/ml透明质酸的合成的液体组合物，其中所述合成的液体组合物整体上不含牛或其它哺乳动物血清作为所述合成的液体的组分，且其中所述白蛋白与所述γ球蛋白之比为1.7:1至2.3:1。

10.如权利要求9的方法，包括在超声浴中搅拌所述磷酸盐缓冲液内的所述磷脂混悬液。

11.如权利要求9的方法，其中所述磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱。

12.如权利要求10的方法，其中所述混悬液在所述超声浴中搅拌10-30分钟。

13.用于测试整形外科植入物磨损的方法，包括：a)提供具有至少一对相面对的关节表面的整形外科植入物样品；

b)将合成的液体组合物引入所述关节表面之间，所述组合物含有：i.具有下述物质的磷酸盐缓冲液；

ii.6-18mg/ml的白蛋白；

iii.4-12mg/ml的γ球蛋白，其中所述白蛋白与所述γ球蛋白之比为1.7:1至

2.3:1；

iv.0.04-0.1mg/ml的磷脂；

v.2-4mg/ml的透明质酸；且vi.所述组合物的pH值为7.0-7.4，且重量克分子渗透浓度为280-320mOsm/kg其中所述合成的液体组合物整体上不含牛或其它哺乳动物血清作为所述合成的液体的组分；

c)使所述关节表面的至少一面相对于所述另一关节表面移动。

14.如权利要求1的液体组合物，含有：a)12mg/ml的白蛋白；

b)7mg/ml的γ球蛋白；

c)0.1mg/ml的磷脂；

d)2mg/ml的透明质酸；

e)在磷酸盐缓冲液中，所述组合物的pH值为7.1，且重量克分子渗透浓度为297mOsm/kg。

15.如权利要求1的合成液体组合物，主要由磷酸盐缓冲液中的白蛋白、γ球蛋白、二棕榈酰磷脂酰胆碱和透明质酸组成。

16.合成的液体组合物，含有

a)6-18mg/ml的白蛋白；

b)4-12mg/ml的γ球蛋白；

c)0.04-0.1mg/ml的磷脂；

d)2-4mg/ml的透明质酸；

e)在磷酸盐缓冲液中，所述组合物的pH值为7.0-7.4，且重量克分子渗透浓度为

280-320mOsm/kg，其中，所述白蛋白与所述γ球蛋白之比在1.7:1至2.3:1之间。

说明书

合成的滑液组合物及其制备方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2010年7月27日提交的美国临时申请US 61/368,145的优先权，将其全部援引加入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及人造或合成的润滑液及制备所述润滑液的方法。更具体而言，本发明涉及用于整形外科植入物的摩擦学测试中的人造或合成的润滑液。

背景技术

[0004] 滑液是在人体关节(例如膝部、臀部和肩部)的软骨和滑膜之间的滑液腔中贴合关节表面存在的生物体液。滑液为软骨提供营养并用作关节的润滑剂。软骨和滑膜的细胞分泌滑液，并且该液体润滑并减少了关节表面之间的摩擦。

[0005] 人体的滑液由大约85％的水组成。其源自血浆的渗析液，它本身由水、溶解的蛋白、葡萄糖、凝血因子、矿质离子、激素等组成。蛋白质，白蛋白和球蛋白存在于滑液中，并被认为对关节表面的润滑起到重要的作用。在人体的滑液中还发现了其它蛋白，包括糖蛋白，例如AGP、A1AT和关节液糖蛋白(lubricin)。

[0006] 存在于人体滑液中的另一组分是透明质酸。透明质酸也被认为对润滑起到了作用。人体滑液还包括其它组分，例如多糖和磷脂。磷脂，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)也存在与滑液中。DPPC通常被认作表面活性剂，并也被认为在关节的润滑中起到了作用。

[0007] 伴随着人造整形外科植入物在整形外科伤病中越来越多的使用，整形外科植入物中关节表面的摩擦学成为了重要的研究领域。由于人造整形外科植入物的开发者试图延长整形外科植入物的使用寿命，获知这些装置置入体内时关节表面的磨损和摩擦的数量和程度，在整形外科领域中引起了越来越浓厚的兴趣。因此，如今可知滑液在人造整形外科植入物的摩擦学中势必起到重要作用。

[0008] 用人体滑液测试植入物并不实用且不能令人满意有至少几种原因。首先，没有足够的人体滑液用于满足整形外科植入物的测试。并且人体滑液的组分是患者特异性的，且很容易改变。源自人体的滑液的特性可以变化，且可被关节生理学和关节中疾病的状态(如果有的话)这些因素而影响。因此，即使人体滑液可轻易并大量获得，在这种液体中进行整形外科植入物的测试也很可能会导致多变的结果，并可能掩盖使用这种液体的任何研究的结果。

[0009] 因此，已开发了用于研究整形外科植入物摩擦学的人体滑液的替代产品。开发出这些替代产品，当这些液体与通常用于整形外科植入物的材料，例如但不限于超高分子量聚乙烯(UHMWPE)和钴铬合金接触时，以模仿或在其他方面模拟人体滑液的性能和特点。

[0010] 某些早期的滑液替代品是基于水和/或盐的溶液，例如公知的林格氏液。然而这些液体不能充分模拟或像人体滑液那样作用，并经常引起非生理学磨损率和磨损结构。因此开发了其他的被认为是更接近于人体滑液特性的润滑剂。

[0011] 牛血清和基于牛血清的溶液被通常用作摩擦学测试中人体滑液的替代品。牛血清可以是正常的牛血清、小牛血清和/或胎牛血清。牛血清通常与水和其它组分混合，例如缓冲液和抗生素。例如，公开号US 2007/0160680的专利申请公开了包括小牛血清的人造润滑剂。该润滑剂还包括附加剂，例如透明质酸和在滑液中自然存在类型的磷脂。此外，所公开的人造润滑液中还包括抗生素、螯合剂和缓冲液。

[0012] 公开号US2008/0214417的专利申请公开了有关基于小牛血清、胎牛血清和阿尔法(alpha)小牛血清的人造滑液的研究。其它研究，包括牛血清用于人造滑液的用途，以及不含牛血清或其组分的其它配方的研究在非专利文献中有所报导。参见Ahlroos T.，Saikko，V.；″Wear of Prosthetic Joint Materials in Various Lubricants，″Wear，211(1)：113-119，1997。

[0013] 然而毫无疑问牛血清不能充分模拟人体滑液。被提出的一个问题是当考虑被认为有助于润滑的成分时，目前的牛血清基润滑剂是否充分类似人体滑液。例如在人体滑液中发现的蛋白率不能由仅基于牛血清的合成润滑剂充分地代表。并且整体的牛血清内含物引入了额外的变量，这并不令人满意且会扭曲任何摩擦学测试的结果。

[0014] 因此，不断需要人造润滑剂，在其组分中包括但不限于蛋白含量和蛋白比，以及在其特性上包括(但不限于)它的非牛顿特性等方面与人体滑液更加类似。还需要人造滑液保持长期的稳定性且不会迅速老化。此外，还需要人造滑液可再生并排除由一些当前人造滑液润滑剂引入的变量。

发明内容

[0015] 本文从几方面公开了该组合物及方法。

[0016] 一方面，本发明涉及合成的液体组合物，其在磷酸盐缓冲液中含有约6-18mg/ml的白蛋白、约4-12mg/ml的γ球蛋白、约0.04-0.1mg/ml的磷脂和约2-4mg/ml的透明质酸。该组合物的pH值为约7.0-7.4且重量克分子渗透浓度为约280-320mOsm/kg。

[0017] 另一方面，本发明涉及模拟了人体滑液选定特性的合成的液体组合物。该组合物在磷酸盐缓冲液中含有约6-18mg/ml的白蛋白、约4-12mg/ml的γ球蛋白、约0.04-0.1mg/ml的磷脂和约2-4mg/ml的透明质酸。该组合物的pH值为约7.0-7.4且重量克分子渗透浓度为约280-320mOsm/kg。

[0018] 另一方面，本发明涉及制备合成滑液的方法。该方法包括将约0.04-0.1mg/ml的磷脂加入磷酸盐缓冲液中形成混悬液。该方法进一步包括搅拌该混悬液选定的时段，并将约2-4mg/ml的透明质酸加入混悬液中，并混合以将透明质酸溶解于混悬液中。进一步地，加入6-18mg/ml的白蛋白，混合，并溶解于混悬液中。该方法还包括将4-12mg/ml的γ球蛋白加入混悬液中，并搅拌以将γ球蛋白溶解于混悬液中。

[0019] 而在另一方面，本发明涉及测试整形外科植入物磨损的方法。该方法包括提供至少具有一对相面对的关节表面的整形外科植入物样品。该方法包括将合成的液体组合物引入关节表面之间。该组合物包括具有约6-18mg/ml的白蛋白、约4-12mg/ml的γ球蛋白、约0.04-0.1mg/ml的磷脂和约2-4mg/ml的透明质酸的磷酸盐缓冲溶液。该组合物的pH值为约7.0-7.4且重量克分子渗透浓度为约280-320mOsm/kg。该方法进一步包括使上述关节表面之一相对于另一关节表面移动。

[0020] 在更具体的方面，本发明涉及合成的液体组合物，其含有在磷酸盐缓冲溶液中的约12mg/ml的白蛋白、约7mg/ml的γ球蛋白、约0.1mg/ml的二棕榈酰磷脂酰胆碱和约2mg/ml的透明质酸的磷酸。该组合物的pH值为约7.1且重量克分子渗透浓度为约297mOsm/kg。

[0021] 在另一方面，本发明涉及合成的液体组合物，其主要由磷酸盐缓冲液中白蛋白、γ球蛋白、二棕榈酰磷脂酰胆碱和透明质酸组成。

附图说明

[0022] 图1为本文所述人造滑液非牛顿特性的图示；以及

[0023] 图2为在本文所述磷酸盐缓冲液(a)、牛血清(b)和合成滑液(c)中，比较钴铬合金(CoCr)盘上的超高分子量聚乙烯(UHMWPE)销的摩擦系数(COF)随时间变化的销盘(POD)测试结果的图示。

具体实施方式

[0024] 本文公开了用于整形外科植入物磨损/摩擦测试和整形外科植入物常规的摩擦学测试的合成的或人工的润滑液。本文所述术语“合成的”和“人工的”溶液是指不是全部或完全来自于人体或其它哺乳动物的溶液，尽管有些溶液的组分来自人体或其它哺乳动物。因此合成的溶液或人工的溶液可以包括一种或多种由人体或哺乳动物制备和/或来自人体或动物体的组分的溶液，该溶液作为整体不存在于人体或哺乳动物体中。在本文中所述和要求保护的液体、合成液体或人工液体可以包括某些蛋白(例如白蛋白或γ球蛋白)或其它衍生自例如人体滑液、血清、牛血清、牛血及类似物的其它组分。然而，其不包括将牛或其它哺乳动物的血清整体作为人工滑液的组分。

[0025] 本文公开的合成的或人工的液体显示出或具有模拟或模仿人体滑液选定的特性。例如，本文公开的以及下述的合成液体可以是与人体滑液一样的非牛顿性液体。此外，本文所述合成的滑液的蛋白含量与人体滑液中发现的蛋白含量类似。总之，本文所述合成的滑液可包括与人体滑液中发现的蛋白比(例如白蛋白和γ球蛋白比)相似的蛋白比。本文所述该合成的或人工的滑液还具有提高的稳定性，并且长期不容易老化。此外，本文所述合成的滑液可再生，且较当前使用的包括基于、源自或大量含有牛血清的合成滑液通常带来更少的变量。

[0026] 本文所述合成的滑液组合物包括溶解了许多其它组分的初始溶液。在一个实施方式中，该初始溶液是pH值至少为7.0的缓冲电解液。在另一实施方式中，该初始溶液的pH值在约7.0至7.4之间。在一更具体的实施方式中，初始溶液为磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液(PBS)是已知的含有约137mM氯化钠(NaCI)、约2.7mM氯化钾(KCI)、10mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)、2mM磷酸二氢钾(KH2PO4)，pH值为约7.4的溶液。其它溶液也可用作本文所述合成滑液的初始溶液。例如也可使用林格氏液或经改进的林格氏液。林格氏液是电解溶液且包括除缓冲剂之外的上述PBS组分中的一些成分。因此可将缓冲剂加入林格氏或林格型溶液中，制备初始溶液。

[0027] 本文所述该合成的滑液还包括蛋白质并特别含有在人体滑液中存在的某种选定的蛋白。因而该合成的滑液可包括白蛋白及一种或多种的在人体滑液中常见的球蛋白。更具体的是，白蛋白和γ球蛋白含于本发明公开的合成滑液中，且可以源自牛血清、牛血或其它可获得的哺乳动物的来源。虽然这些蛋白可源自，例如牛血清，但整体牛血清不包括在本文公开的合成滑液中。

[0028] 如上所述，在牛血清中的蛋白含量和蛋白比不同于人体滑液中发现的。此外，总的牛血清可引入不想要的且不能控制的变量。因此，根据本文所述的合成滑液，其含有牛血清(或其它哺乳动物血清)中发现的某些经选定的蛋白组分。这给出了更可控的组合物，其一可改变以更加类似人体滑液的蛋白含量和比例，并模拟常规的人体滑液。

[0029] 在一个实施方式中，在本文所述合成滑液组合中总蛋白含量可为约10-30mg/ml。更优选的，总的蛋白含量可为约15-25mg/ml，并更优选约18mg/ml。

[0030] 除了总的蛋白含量，本文所述合成的滑液优选含有的蛋白比与人体滑液中通常发现的即白蛋白与γ球蛋白的蛋白比类似。据报道在人体滑液中白蛋白和γ球蛋白的比为约1.7∶1至2.3∶1之间。类似地，本发明的合成滑液中的白蛋白与γ球蛋白之比在约1.5∶1与2.5∶1之间，且优选白蛋白与球蛋白之比约1.7∶1。

[0031] 至于单独的蛋白，在本发明合成滑液组合物中的白蛋白浓度优选为约6-18mg/ml。更优选白蛋白浓度可为约10-14mg/ml，且更优选约12mg/ml。至于γ球蛋白，其在合成滑液组合物中存在的浓度为约4-12mg/ml，且更优选6-8mg/ml，并最优选约7mg/ml。

[0032] 如上所述，人体滑液还天然包括已知的表面活性剂并被认为有助于润滑的磷脂。因此，本发明合成的滑液组合物可含有选定浓度的一种或多种磷脂。在一个实施方式中，合成的滑液组合物含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。在合成滑液组合物中的DPPC浓度可为约0.04-0.15mg/ml，且更优选约0.08-0.12mg/ml。更优选的浓度为约0.1mg/ml。

[0033] 本发明合成滑液组合物的其它组分还有具润滑作用的透明质酸。包含于合成滑液配方中的透明质酸的浓度为约1-4mg/ml，且更优选约2mg/ml。

[0034] 因此，在一个实施方式中，合成滑液组合物含有约6-18mg/ml的白蛋白；约4-12mg/ml的γ球蛋白、约0.04-0.15mg/ml的DPPC和约1-4mg/ml之间的透明质酸，在磷酸盐缓冲液中，pH值为约7.0-7.4，且重量克分子渗透浓度为约280-320mOsm/kg。

[0035] 在更具体的实施方式中，本文所述合成的滑液含有约12mg/ml的白蛋白；约7mg/ml的γ球蛋白；约0.1mg/ml的DPPC和约2mg/ml的透明质酸，在pH值约7.1且重量克分子渗透浓度为约297mOsm/kg的磷酸盐缓冲液中。该组合物被认为是稳定的，且能维持pH值(约7.1)至少90天。

[0036] 当然，需要注意的是，其它添加剂也可包含在本发明的组合物中。然而，在一个实施方式中，未加入其它添加剂，包括在牛血清或人类或牛滑液中通常发现的其它组分，例如，阿尔法1球蛋白、阿尔法2球蛋白或贝塔球蛋白。因此，在一个实施方式中，本发明的人工的滑液组合物主要由磷酸盐缓冲液中的白蛋白、γ球蛋白、DPPC和透明质酸组成。

[0037] 磷酸盐缓冲液的制备是本领域公知的，在此不作详述。通常将磷酸盐缓冲液片溶解于一定量的蒸馏水中。这种片剂是配制用于溶解到特定量的蒸馏水中以提供备用PBS溶液的。有可使用于标准体积(例如100ml、500ml、1,000ml)中的片剂。

[0038] 一旦制备了PBS溶液，将磷脂，通常为DPPC加入该PBS溶液中获得上述所需浓度。随后搅拌DPPC/PBS混悬液使得磷脂在PBS中分散。通常可将该混悬液置于超声波浴中选定的一段时间，使得磷脂分散并形成微粒。超声波浴处理的通常时长为10至30分钟。然而如果微粒不能充分分散，可以延长时间。

[0039] 充分搅拌后(例如通过超声处理)，将形成的混悬液从超声器移开并可加入其他剩余组分。优选通过搅拌(例如在搅拌台上)，或通过除超声外的其他搅拌方式混合剩余的组分，因为超声可导致剩余组分的老化。因此，在混悬液中加入并溶解大量的透明质酸。还加入白蛋白并搅拌至溶解到看不到颗粒。最后，加入选定量的γ球蛋白并搅拌至溶解到看不到颗粒。透明质酸、白蛋白和γ球蛋白的量为选定的能达到上述组分浓度的量。虽然优选上述顺序混合和搅拌剩余组分，但透明质酸、白蛋白和γ球蛋白可按任意顺序加入。

[0040] 如上所述，本文所述合成的滑液组合物可用于在医学领域广泛使用的整形外科植入物的磨损和摩擦以及常规摩擦学的测试中。这些测试在整形外科植入物产业中是常规的，在此对用于这些测试的方法及设备不作详述。通常，往复装置用于模拟关节的运动，并据此测量整形外科植入物的摩擦和磨损。该往复装置使得关节表面彼此之间相对运动。该步骤重复并通常循环多次。

[0041] 本文所述该合成的滑液具有堪比人体滑液的特性。例如，合成的滑液显示了非常类似人体滑液的非牛顿特性。在一个实施例中，在37°不同剪切率下测定本文所述合成滑液的粘度。样品的规格约100ml。使用具有转子18的Brookfield LV-DV-1+型旋转粘度计(Brookfield LV-DV-1Plus Rotational Viscosimeter)。图1显示了在磷酸盐缓冲液中含有约12mg/ml白蛋白、7mg/mlγ球蛋白、0.1mg/ml的DPPC和2mg/ml透明质酸；pH值约7.1且重量克分子渗透浓度约为297mOsm/kg的合成滑液的结果值以及非牛顿性行为。如图1所述，当剪切率增加，合成滑液的粘性降低。

[0042] 研究

[0043] 研究中，分析并比较了三(3)种液体的润滑性。进行的研究基本与ASTMG99-05一致。使用的液体是得自Sigma-Aldrich的磷酸盐缓冲液(PBS)、得自Hyclone的牛血清，并且本文所述合成滑液，含有在磷酸盐缓冲液中大约12mg/ml的白蛋白、7mg/ml的γ球蛋白、0.1mg/ml的DPPC和2mg/ml的透明质酸；pH值约7.1，且重量克分子渗透浓度约为297mOsm/kg。定制改良的销-转-盘装置(pin-on-rotating-disk device)(LSRH-Tribometer，Pin-Disc Machine，型号3-108；CSM Instruments SA，Peseux，Switzerland)装有超高分子量聚乙烯(UHMWPE)销，与钴-铬合金(CoCr)盘接合。各样品室分别装有上述确定的三(3)种润滑液的一种，使销盘触点被充分浸入。记录信号中较高的振幅代表在给定润滑液中UHMWPE与CoCr部件“粘附和滑动”行为的增加。如附图2所示三(3)种测试液体中，合成滑液最稳定。

[0044] 可以理解的是上述实施例仅示例性说明本发明主旨的一些原则性应用。还可以理解的是本领域技术人员可作出某些改变，在不脱离所要求保护主旨的精神实质和保护范围内，其包括本文分别公开或要求保护特征的那些组合。基于这些理由，本发明的范围不仅限于上述说明书，还有下述的权利要求书，且可以理解的是权利要求所述技术特征包括本文分别公开或要求保护的技术特征的组合。