一种抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白的制备方法

摘要

一种抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白的制备方法，涉及一种藻蓝蛋白。提供工艺简单、操作性强的一种抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白的制备方法。1）将原料食用红藻清洗干净后烘干，粉碎成粉末状；2）将步骤1）得到的食用红藻粉末溶于水中，组织捣碎后，超声破碎；3)将步骤2）超声破碎后的样品离心获取上清，用(NH4)2SO4盐析；4）盐析后样品上样于凝胶柱，收集A620/A280＞2.0流出部分；5)收集样品经PBS缓冲液透析后，上样于阴离子交换柱，得抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白。在R-藻蓝蛋白制备过程中，各项操作均可在常温下进行；制备获得的R-藻蓝蛋白浓度高，具有抗食物过敏活性。

权利要求

1.一种抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将原料食用红藻清洗干净后烘干，粉碎成粉末状；所述食用红藻选自紫菜、江蓠、红毛菜中的至少一种；所述烘干的温度为30～40℃；

2)将步骤1)得到的食用红藻粉末溶于水中，组织捣碎后，超声破碎；所述食用红藻粉末与水的质量比为1∶15～30；所述组织捣碎的时间为20～60min；所述超声破碎的时间为20～30min；

3)将步骤2)超声破碎后的样品离心获取上清，用(NH4)2SO4盐析；所述(NH4)2SO4的质量百分比浓度为20％～35％；

4)盐析后样品上样于凝胶柱，收集A620/A280>2.0流出部分；

5)收集样品经PBS缓冲液透析后，上样于阴离子交换柱，得抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白；

所述PBS缓冲液的浓度为5～20mM；所述PBS缓冲液的组成为5～20mM Na2HPO4，5～20mM NaH2PO4，pH 6.5～7.5。

说明书

一种抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种藻蓝蛋白，尤其是涉及利用硫酸铵盐析结合柱层析的一种抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白的制备方法。

背景技术

[0002] 食物过敏是过敏人群对某些食物蛋白产生的不良免疫反应，通常会导致一系列症状，比如哮喘、荨麻疹、腹泻等，严重影响过敏人群的生活质量，甚至危及生命安全。美国流行病学调查显示，3.9%的美国儿童患有食物过敏症，其发病率从1997到2007年增长了18%（Branum AM.Food allergy among children in the United States.Pediatrics.2009,124(6):1549-1555）。国内流行病学调查显示，约有6%的人患有食物过敏，致敏食物主要为水产品、牛奶和鸡蛋，过敏症状主要为皮疹、皮肤瘙痒和消化道异常（吕相征.健康人群食物过敏状况的初步调查.中国食品卫生杂志.2005,17(2):119-120）。食物过敏反应通常伴随血清中过敏原特异性IgE的升高以及以Th2极化为特征的免疫反应。检测血清中IgE水平及Th2型淋巴细胞中相关细胞因子IL-4、IL-13的表达量对于食物过敏评价具有重要的意义（Sampson HA.Utility of food-specific IgE concentrations in predicting symptomatic food allergy.Journal of Allergy and Clinical Immunology.2001,107(5):891-896）。

[0003] 食物过敏的预防治疗可分为避免食用过敏食品和药物治疗。避免食用过敏食品影响过敏患者的生活质量，药物治疗通常存在副作用。因此，研究开发低致敏性或抗过敏性的食品药品具有重要的意义。目前，从动植物中提取天然活性物质用于预防或治疗食物过敏性疾病，具有材料来源广泛、毒副作用小、可针对多种过敏食物等优点。

[0004] 我国海域辽阔，海洋生物资源十分丰富。红藻是重要的海洋生物资源，紫菜、江蓠和红毛菜等在我国沿海有大量养殖，是重要的食用海藻。文献报道，红藻具有抗氧化（钱晓婕，等.坛紫菜中藻胆蛋白的提取及其抗氧化活性研究.中国海洋药物杂志.2008,27(2):42-45）、抗疲劳（赵婷婷，等.不同分子量坛紫菜多糖的制备及抗衰老活性研究.北京:中国科学院海洋研究所.2007:51-54）和免疫调节（李胜军.紫菜多糖对免疫低功小鼠的免疫调节作用.北京:中国医科大学.2005:14-30）等功效。从红藻中提取各类活性物质对明确其有效成分对于充分利用海洋资源、开发功能性食品等具有重要的意义。

[0005] 藻蓝蛋白是一种存在于海藻细胞内的光合辅助色素，与藻红蛋白和别藻蓝蛋白组成藻胆蛋白，能高效捕获光能。R-藻蓝蛋白、R-藻红蛋白及别藻蓝蛋白的特征吸收峰分别在620nm、565nm及650nm，国际上常用藻胆蛋白所处特征吸收波长的吸光度与检测蛋白常用的吸光度A280作为评价藻胆蛋白纯度的指标，例如，评价藻蓝蛋白纯度常用A620/A280的比值，并且比值越高表明蛋白纯度越高。根据存在于海藻种类的不同，藻蓝蛋白可分为C-藻蓝蛋白、R-藻蓝蛋白等类型；相对于存在蓝藻中的C-藻蓝蛋白已被广泛研究的现状，存在红藻中的R-藻蓝蛋白因与R-藻红蛋白、别藻蓝蛋白的结构和性质相似，导致R-藻蓝蛋白的分离纯化较困难，有关R-藻蓝蛋白的研究也鲜见报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供工艺简单、操作性强的一种抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白的制备方法。

[0007] 本发明包括以下步骤：

[0008] 1）将原料食用红藻清洗干净后烘干，粉碎成粉末状；

[0009] 2）将步骤1）得到的食用红藻粉末溶于水中，组织捣碎后，超声破碎；

[0010] 3)将步骤2）超声破碎后的样品离心获取上清，用(NH4)2SO4盐析；

[0011] 4）盐析后样品上样于凝胶柱，收集A620/A280>2.0流出部分；

[0012] 5)收集样品经PBS缓冲液透析后，上样于阴离子交换柱，得抗过敏高纯度R-藻蓝蛋白。

[0013] 在步骤1）中，所述食用红藻可选自紫菜、江蓠、红毛菜等中的至少一种；所述烘干的温度可为30～40℃。

[0014] 在步骤2）中，所述食用红藻粉末与水的质量比可为1∶（15～30）；所述组织捣碎的时间可为20～60min，所述超声破碎的时间可为20～30min。

[0015] 在步骤3)中，所述(NH4)2SO4的质量百分比浓度可为20%～35%。

[0016] 在步骤5)中，所述PBS缓冲液的浓度可为5～20mM，所述PBS缓冲液的组成可为5～20mM Na2HPO4，5～20mM NaH2PO4，pH6.5～7.5。

[0017] 本发明以食用红藻（如紫菜、江蓠和红毛菜等）为原材料，通过细胞破碎、硫酸铵盐析、柱层析等方法。本发明的优点是：在R-藻蓝蛋白制备过程中，各项操作均可在常温下进行；制备获得的R-藻蓝蛋白浓度高（A620/A280>6.0），具有抗食物过敏活性。

附图说明

[0018] 图1为硫酸铵分段盐析结果。在图1中，各标记为：1，0%~20%；2，20%~25%；3，25%~30%；4，30%~35%；5，35%~40%；6，40%~45%；7，45%~50%；8，50%~55%。

[0019] 图2为R-藻蓝蛋白纯化Sephacryl S-200柱层析图谱。在图2中，各标记为：◆为A280，总蛋白浓度；■为A620，R-藻蓝蛋白特征吸收峰；▲为A565，R-藻红蛋白特征吸收峰；○为A650，别藻蓝蛋白特征吸收峰。

[0020] 图3为R-藻蓝蛋白纯化DEAE-Sepharose柱层析图谱。在图3中，各标记为：◆为A280，总蛋白浓度；■为A620，R-藻蓝蛋白特征吸收峰；▲为A565，R-藻红蛋白特征吸收峰；×为A650，别藻蓝蛋白特征吸收峰。

[0021] 图4为实施例1获得的藻胆蛋白。在图4中，各标记为：1，R-藻红蛋白；2，别藻蓝蛋白；3，R-藻蓝蛋白。

[0022] 图5为实施例1获得的R-藻蓝蛋白特征吸收峰。

[0023] 图6为实施例1中R-藻蓝蛋白的SDS-PAGE图谱。在图6中，各标记为：M，Marker；1，R-藻蓝蛋白+β-巯基乙醇；2，R-藻蓝蛋白。

[0024] 图7为实施例1中R-藻蓝蛋白的Native-PAGE图谱。

[0025] 图8为实施例2获得的R-藻蓝蛋白。在图8中，各标记为：1，R-藻蓝蛋白稀释品；2，高浓度R-藻蓝蛋白。

[0026] 图9为实施例2获得的R-藻蓝蛋白特征吸收峰。

[0027] 图10为实施例2中藻蓝蛋白的SDS-PAGE图谱。在图10中，各标记为：M，Marker；R-PC，藻蓝蛋白。

[0028] 图11为实施例2中R-藻蓝蛋白的Native-PAGE图谱。

[0029] 图12为BALB/c小鼠过敏模型致敏阶段的特异性IgE水平。在图12中，Before i.p为注射前；1st i.p为第一次注射；2st i.p为第二次注射；各标记为：●，注射TM组；△，注射PBS组；*，注射TM+R-藻蓝蛋白组。

[0030] 图13为小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-gamma的蛋白水平检测结果。

[0031] 图14为小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IL-4的蛋白水平检测结果。

[0032] 图15为小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IL-13的蛋白水平检测结果。

[0033] 图16为小鼠脾脏淋巴细胞中IFN-gamma基因的相对表达量检测结果。

[0034] 图17为小鼠脾脏淋巴细胞中IL-4基因的相对表达量检测结果。

[0035] 图18为小鼠脾脏淋巴细胞中IL-13基因的相对表达量检测结果。

具体实施方式

[0036] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

[0037] 实施例1：坛紫菜饼中R-藻蓝蛋白的制备方法，包括以下步骤：

[0038] (1)紫菜饼的前处理：选用市售的坛紫菜饼为原料，要求无污染、无异味。用清水洗净紫菜外表所附的泥沙和污物；

[0039] (2)烘干和粉碎：将清洗干净的坛紫菜放置于30℃烘箱中烘干，用粉碎机粉碎成粉末状，烘干时间不能太长以保证R-藻蓝蛋白的生物活性；

[0040] (3)组织捣碎和超声波破碎：将粉末状坛紫菜称重溶于30倍体积的纯水，组织捣碎20min，超声破碎20min，以促进R-藻蓝蛋白从细胞中溶出；

[0041] (4)细胞破碎后离心获取上清，20%～35%(NH4)2SO4盐析（图1）；

[0042] (5)盐析后样品上样于Sephacryl S-200层析柱，收集A620/A280>2.0组分，流速控制在1mL/min（图2）；

[0043] (6)收集组分置于5mM PBS pH6.5缓冲液中透析，期间更换透析液3次；

[0044] (7)透析后样品上样于DEAE-sepharose阴离子交换柱，经过5mM pH6.5PBS+0.05M NaCl流洗，5mM pH5.0PBS+0.05M NaCl到200mM NaH2PO3+200mM NaCl梯度洗脱，获得洗脱曲线（图3，最终获得高纯度R-藻蓝蛋白（A620/A280>6.0）（图4）。紫外可见光谱扫描显示R-藻蓝蛋白有两个特征吸收峰，分别在555nm和617nm（图5）；SDS-PAGE显示其由两个亚基组成（图6）；Native-PAGE显示无杂条带，表明R-藻蓝蛋白得到纯化（图7）。

[0045] 实施例2：新鲜坛紫菜R-藻蓝蛋白的制备方法，与实施例1有所不同，具体步骤如下：

[0046] (1)新鲜坛紫菜的前处理：选用新鲜坛紫菜为原料，要求无污染、无异味。用清水洗净紫菜外表所附的泥沙和污物；

[0047] (2)烘干和粉碎：将清洗干净的坛紫菜放置于40℃烘箱中烘干，用粉碎机粉碎成粉末状，烘干时间不能太长以保证R-藻蓝蛋白的生物活性；

[0048] (3)组织捣碎和超声波破碎：将粉末状坛紫菜称重溶于15倍体积的纯水，组织捣碎60min，超声破碎30min，以促进R-藻蓝蛋白从细胞中溶出；

[0049] (4)细胞破碎后离心获取上清，20%～35%(NH4)2SO4盐析；

[0050] (5)盐析后样品上样于Sephacryl S-200层析柱，收集A620/A280>2.0组分，流速控制在0.8mL/min；

[0051] (6)收集组分置于20mM PBS pH7.5缓冲液中透析，期间更换透析液3次；

[0052] (7)透析后样品上样于DEAE-sepharose阴离子交换柱，经20mM pH7.5PBS+50mM NaCl流洗，20mM pH6.0PBS+50mM NaCl到150mM NaH2PO3+200mM NaCl梯度洗脱，最终获得高纯度R-藻蓝蛋白（A620/A280>6.0）（图8）。紫外可见光谱扫描显示R-藻蓝蛋白有两个特征吸收峰，分别在555nm和617nm（图9）；SDS-PAGE显示由两个亚基组成（图10），Native-PAGE显示无杂条带，表明R-藻蓝蛋白得到纯化（图11）。

[0053] 实施例3：R-藻蓝蛋白抗过敏性质分析

[0054] （1）SDS-PAGE及Native-PAGE。配制12%凝胶，取10μL SDS化的R-藻蓝蛋白样品上样，银染后凝胶成像系统拍照；配制Native-PAGE，R-藻蓝蛋白与溴酚蓝混合后10μL上样，银染后凝胶成像系统拍照。

[0055] （2）动物实验方法。以BALB/c近交系雌性小鼠作为研究对象，利用甲壳类水产品主要过敏原原肌球蛋白（Tropomyosin,TM）敏化小鼠，建立过敏动物模型。实验分为PBS阴性对照组、TM致敏组和TM+R-藻蓝蛋白实验组，每组6只。在0、24天分别注射PBS、TM和TM+R-藻蓝蛋白，第25天取血利用间接性ELISA的方法检测小鼠血清中IgE水平（图12）。结果显示，R-藻蓝蛋白能够降低致敏小鼠血清中IgE的含量。

[0056] （3）细胞实验方法。取致敏组BALB/c近交系雌性小鼠脾脏，分离淋巴细胞。利用PBS、TM、TM+R-藻蓝蛋白刺激培养72h，离心取上清，检测各组过敏相关细胞因子IL-4、IL-13及IFN-gamma蛋白水平分泌量，结果显示R-藻蓝蛋白能够提高Th1型细胞因子IFN-gamma的蛋白水平分泌量（图13），相反，能够降低促使过敏发生的Th2型细胞因子IL-4（图14）和IL-13的蛋白水平分泌量（图15）；取致敏组BALB/c近交系雌性小鼠脾脏，分离淋巴细胞。利用PBS、TM、TM+R-藻蓝蛋白刺激培养72h，收集淋巴细胞沉淀分离提取RNA，反转录后利用荧光定量PCR技术检测以上三种细胞因子基因表达量。结果显示，R-藻蓝蛋白能够增加Th1型细胞因子IFN-gamma的基因表达量（图16），相反，能够降低促使过敏发生的Th2型细胞因子IL-4（图17）及IL-13（图18）的基因表达量。