空间铜绿假单胞菌LCT-PA220菌株

摘要

本发明涉及一株太空环境下致病菌--铜绿假单胞菌的空间株LCT-PA220的生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，可获得全面、准确的空间铜绿假单胞菌株突变的差异表达基因和分子。

权利要求

1.空间铜绿假单胞菌LCT-PA220菌株，其特征在于：保藏号为CGMCCNO.6523，其特征在于：革兰氏染色阴性，单个排列的无芽胞杆菌；相对于对照菌株，对氯霉素、头孢他啶、头孢三嗪耐药性提高，而对阿奇霉素敏感性提高；不代谢左旋盐藻糖、右旋甘露醇、糊精、右旋麦芽糖、右旋聚纤维二糖、β(1→6)葡二糖、松二糖、乳糖、车前二糖、3甲基-葡萄糖、左旋盐藻糖、N-乙酰-β-右旋葡糖胺酶、右旋甘露醇、阿(拉伯)糖醇、半乳糖、右旋6-磷酸葡萄糖、右旋丝氨酸，而代谢产物减少的包括右旋甘露糖、右旋果糖、右旋半乳糖、甘油、6-磷酸果糖。

说明书

空间铜绿假单胞菌LCT-PA220菌株

技术领域

[0001] 本发明所涉及生物技术领域。具体地说，涉及一种空间环境下的新菌株--铜绿假单胞菌，生物学特性、全基因组学测序、转录组测序和差异蛋白组学分析。

背景技术

[0002] 铜绿假单胞菌是临床上常见的条件致病菌，长期应用激素、免疫抑制剂，进行肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后或侵入性治疗操作后的病人易导致本菌感染，被认为是医院内感染的重要病原菌之一。其具备生存条件要求低，定植广泛，耐药水平高等特点，是临床微生物学研究热点菌种。

[0003] 随着我国“神舟”系列飞船、“天宫一号”、空间站等庞大的航天计划的实施，载人航天的医学保障需求日益突出，对空间生物医学的研究提出了更高的要求，同时也为空间生物医学研究提供了难得的实验平台。我们此次搭载“神舟八号”飞船，共搭载包括铜绿假单胞菌在内的64株细菌。该飞船在轨运行16天13小时(397小时)的时间，行程1100万公里。

[0004] 在国外针对空间领域铜绿假单胞菌的研究中，Guadarrama等发现模拟微重力环境下，微重力处理组铜绿假单胞菌PA103菌株生长周期与对照组相比没有显著变化，外毒素产量无明显差异，但作者同时也指出，结果可能与培养基条件，微重力生物效应回转器回旋速度及回旋时间有关。而2008及2010年Crabbè等发表的研究结果表明，在模拟微重力条件下，铜绿假单胞菌藻酸盐、弹性蛋白酶、鼠李糖脂产生增加，但绿脓菌素的产量无明显差异。在真实太空环境下，铜绿假单胞菌缺乏类似报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于：提供一种新的空间环境下的铜绿假单胞菌 LCT-PA220菌株，其保藏号为CGMCC NO。上述提供菌株的各项生物学特性、差异表达基因和差异蛋白也是本发明的保护范围，其特征包括：

[0006] 1)菌株生物学特性

[0007] 革兰氏染色阴性，单个排列的无芽胞杆菌；相对于对照菌株，对氯霉素、头孢他啶、头孢三嗪耐药性提高，而对阿奇霉素敏感性提高；不代谢左旋盐藻糖、右旋甘露醇、糊精、右旋麦芽糖、右旋聚纤维二糖、β(1→6)葡二糖、松二糖、乳糖、车前二糖、3甲基-葡萄糖、左旋盐藻糖、N-乙酰-β-右旋葡糖胺酶、右旋甘露醇、阿(拉伯)糖醇、半乳糖、右旋6-磷酸葡萄糖、右旋丝氨酸，而代谢产物减少的包括右旋甘露糖、右旋果糖、右旋半乳糖、甘油、6-磷酸果糖。

[0008] 2)生物信息学特性

[0009] a)差异蛋白表达

[0010] 与对照菌株比较，差异表达基因(FDR≤0.001和|log2Ratio|≥2)见附件1。

[0011] b)蛋白组学

[0012] 同重同位素相对与绝对定量(Isobaric tags for relative and absolutequantitation，iTRAQ)法进行样

[0013] 本蛋白定量分析。当蛋白质定量值的蛋白丰度差异倍数超过1.2倍以上，且经检验其p-value值小于0.05，视为单次重复间的差异蛋白，重复出现两次以上者被视为最终差异蛋白，符合条件差异蛋白见附件2。三次重复鉴定中达到要求差异蛋白如表1所示。

[0014] 表1三次量复鉴定的差异蛋白

[0015]

[0016]

附图说明

[0017] 图1LCT-PA220革兰氏染色

[0018] 图2生化谱实验板图2a LCT-PA220菌株，图2b地面对照菌株

[0019] 图3LCT-PA220的差异表达基因

[0020] 图4LCT-PA220的差异蛋白

[0021] 附件说明

[0022] 附件1空间铜绿假单胞菌LCT-PA220差异基因表达

[0023] 附件2空间铜绿假单胞菌LCT-PA220差异蛋白

具体实施方式

[0024] 下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0025] 下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0026] 实施实例一：空间菌株搭载

[0027] 2011年10月20日，装有搭载菌株的样品管随“神舟八号”飞船飞行16天13小时(397小时)。飞船返回后，菌株处理流程如下：打开样品包，取出样品管，500rpm离心5分钟；利用高温镊子在样品管的第一个样品区顶盖正上方钻孔，注意避免各样品区的交叉污染，每次操作一个样品区；手持接种环，利用酒精灯火焰灭菌，灭菌时先将接种环直立灭菌待烧红后，再横向烧金属柄部分，通过火焰3-4次；用接种环无菌挑取半固体培养基中的菌落；将所取菌落划线接种于MH琼脂平板；将平板放置37℃培养箱中培养12-16h；将样品区内剩余菌落连同培养基全部转移至增菌肉汤培养管；37℃250rpm振荡摇菌8-12h；第二天观察细菌生长情况，将MH琼脂平板中菌落保存于含细菌冷冻液的冻存管内；增菌肉汤培养管中细菌按照甘油终浓度为10％-20％分装保存；将上述分装冻存好的细菌转移至-80度冰箱冻存备用。

[0028] 实施实例二：菌株鉴定和表现型特点

[0029] 1.菌株的鉴定和进化关系

[0030] 1)PCR扩增16S rDNA。

[0031] 16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约1.5kb。将已分纯的 单菌直接经菌液PCR扩增16S rDNA，扩增所用引物序列如下：

[0032] SgF：AGAGTTTGATCATGGCTCAG

[0033] SgR：TAGGGTTACCTTGTTACGACTT

[0034] 16S rDNA PCR产物用96孔mil lpor e纯化系统纯化后准确定量，经ABI3730xl全自动序列分析仪测序，测序结果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测序结果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1350bp(双向测序)即用于同源性分析(利用Eztaxon server2.1数据库中进行比对)，确定菌株大致的分类地位。

[0035] 2)进化关系分析

[0036] 所有单菌16S序列经Mega5.0软件clusterW多重比对，构建Neighbor-Joining tree。

[0037] 2.表现型分析

[0038] a)显微形态如图1所示经革兰氏染色观察，LCT-PA220对比LCT-PA102未出现明显的形态变化，均为单个排列的无芽胞、革兰氏阴性杆菌。

[0039] b)生化谱实验取出菌株的斜面，用灭菌竹签蘸取菌种接种在LB液体培养基中(4ml体系)，培养24h。然后取2ml菌液6000r/s离心5min，弃上清培养基，留下离心的菌体，然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体，6000r/s离心5min，再次弃去上清，再用Biolog接种液进行悬浮菌体，最后再转至15ml的接种液中。调至浓度约107-108；接种，将以上菌悬液倒至接种皿中，震荡均匀，用12道(或8道)排枪进行加样，每个Biolog板孔加样100ul，共96孔，加完样后，盖上Biolog板盖，放置在37℃下培养，24h和48h进行观察。结果如图
2所示：两块板的相同孔所加入的底物相同，如果产生颜色变化，则根据OD值可以比对出代谢产物变化。相对与 对照菌株，LCT-PA220不代谢左旋盐藻糖、右旋甘露醇、糊精、右旋麦芽糖、右旋聚纤维二糖、β(1→6)葡二糖、松二糖、乳糖、车前二糖、3甲基-葡萄糖、左旋盐藻糖、N-乙酰-β-右旋葡糖胺酶、右旋甘露醇、阿(拉伯)糖醇、半乳糖、右旋6-磷酸葡萄糖、右旋丝氨酸，而代谢产物减少的包括右旋甘露糖、右旋果糖、右旋半乳糖、甘油、6-磷酸果糖。

[0040] c)耐药性检测纸片法进行药敏试验，所用抗生素表1：

[0041] 表1药敏试验所应用抗生素

[0042]

[0043] 药敏试验的结果如表2所示，相比于地面对照组，耐药性方面未出现显著的变化，可见LCT-PA220菌株对氯霉素、头孢他啶、头孢三嗪耐药性提高，而对阿奇霉素敏感性提高。

[0044] 表2药敏试验结果

[0045]菌株编号 青 氨 V 达 菌 奇 环 洁 万 复 氯 舒 丁 链 满 培 他
LCT-PA220 - - - 2 2.1 2.5 2.8 - - - - 2.3 2 0.8 1 2 2.8
对照菌株 - - - 2.5 2.6 1.6 3 - - - 0.6 2.6 2 0.8 0.8 2.2 2.9[0046] 实施实例三：生物信息学分析

[0047] 1.基因组

[0048] (1)原始数据DNA的处理

[0049] 采用高通量Illumina测序技术对该样品的DNA进行Paired-End测序。首先采用超声法Covaris或者Bioruptor将大片段DNA随机打断 并产生主带≤800bp的一系列DNA片段，然后用T4DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的片段连接产物，再使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段；最后，用合格的文库(构建了350bp小片段文库和6,000bp大片段文库，期望数据量分别为300Mb和150Mb)进行cluster制备和测序。

[0050] (2)组装

[0051] 运用SOAP denovo 1.05短序列组装软件(网址及版本号http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html；版本：1.06)对处理后的reads数据进行组装，经多次调整主要参数，得到最优的组装结果。

[0052] (3)组装结果评价。

[0053] GC含量与Depth关联分析：利用测序reads与组装结果比对，计算组装结果Depth值和GC含量，进而反映GC含量和测序深度的分布，如测序过程中GC偏向性不严重，散点图会呈现出近似于泊松分布的形状。

[0054] 15-mer分析：横坐标为深度，纵坐标为各深度下的频数占总频数的比例。在不考虑测序错误率，基因组的杂合度和重复度的情况下，逐位点取15-mer，绘图，则15-mer的分布应该服从泊松分布

[0055] (4)重复序列注释。

[0056] 通过RepeatMasker软件(使用Repbase数据库)和RepeatProteinMasker软件(使用RepeatMaske自带的转座子蛋白库)两种方法来预测转座子；通过TRF(Tandem
Repeat Finder)软件预测串联重复序列；

[0057] (5)基因预测。

[0058] a)基因预测采用Glimmer3.0软件从组装结果中获得基因序列，用于后续的基因功能注释进化等分析。

[0059] b)基因岛预测基于SIGI-HMM软件所预测的全部基因岛序列作为基因岛库，将目标基因组与该库进行BLAT(Standalone BLAT v.34)比对，基于该比对结果中的比对长度、基因岛大小、比对上的基因岛起止位置等信息来确定目标基因组中可能的GIs。

[0060] c)前噬菌体预测通过将所测基因组与前噬菌体库进行BLAT(Standalone BLAT v.34)比对，基于该比对结果中的比对长度，前噬菌体大小、以及比上的前噬菌体起止位置等信息来判定目标基因组中可能的前噬菌体。

[0061] d)CRISPR预测使用CRISPRFinder软件，识别CRISPRs，得到DRs和spacers。

[0062] e)Non-codingRNA注释通过与参考序列rRNA比对找到rRNA，或rRNAmmer软件预测rRNA；通过tRNAscan软件预测tRNA区域和tRNA的二级结构；通过Rfam软件预测sRNA；

[0063] (6)基因功能注释。

[0064] 将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。所有的注释均使用BLAST软件结合各个数据库的特点完成，注释的蛋白库和其他特异性库为：KEGG、COG、GO、NR、Swissprot、Trembl、VFDB、ARDB、CAZY和RegulonDB等，为了保证其生物意义，保留一条比对效果最好的结果，作为此条基因的注释。

[0065] (7)环形图。

[0066] 根使用(GC)/(G+C)的计算方法来进行GC skew分析，同时根据COG的注释结果和基因的位置信息绘出COG注释的基因在基因组上的分布情况；

[0067] (8)共线性分析。

[0068] 通过目标菌蛋白集(核酸集)与参考菌蛋白集(核酸集)两两比对，将目标菌的基因组序列根据参考菌的基因组序列进行排序构图。

[0069] 2.转录组

[0070] 提取菌株总RNA，用试剂盒去除rRNA后。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖TM凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeq 2000进行测序。将原始序列数据去除杂质数据后、评价Reads在基因组上的分布基因覆盖度、基因表达量差异、分析差异表达基因、筛选差异基因表达模式聚类分析、GO功能分析、KEGG Pathway分析和预测新转录本分析等。

[0071] 3.蛋白质组

[0072] (1)iTRAQ法定量蛋白质组学的实验基本流程：第一步，从样品中提取蛋白。第二步，对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白。第三步，用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质的浓度测定。第四步，等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳。第五步，酶解蛋白。第六步，用iTRAQ试剂标记肽段。第七步，将标记后的肽段进行等量混合。第八步，对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(Strong Cation Exchange Choematography，SCX)进行预分离。第九步，进行液相串联质谱(liquid chromatography couple dwith tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

[0073] (2)iTRAQ定量蛋白质组学的基本信息分析流程：首先对于质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表。其次建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定。最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关 系。

[0074] 本文所述的空间铜绿假单胞菌LCT-PA220菌株，可根据抗生素耐药性的改变及分子机理，应用于筛选和鉴定临床抗生素耐药靶点，为开发临床难治性屎肠球菌感染的诊治产品提供参考。

[0075] 关于保藏的LCT-PA220菌株的说明

[0076] A.菌种的保藏单位名称和地址

[0077] 名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0078] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

[0079] B.交机构保藏的日期

[0080] 2012年9月5日

[0081] C.保藏机构给予的保藏号

[0082] CGMCC No.6523

[0083] D.菌株分类命名：铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa

[0084] 附件1

[0085]

[0086]

[0087]

[0088] 附件2

[0089]

[0090]