一株合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶的粪肠球菌及其应用

摘要

本发明公开了一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SW08，已于2012年10月19日保藏于中国典型微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO: M2012417。该菌能够在酸性环境下快速降解氨基甲酸乙酯和尿素，对发酵食品中氨基甲酸乙酯的消除起到了积极的作用。

权利要求

1.一株合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶的粪肠球菌SW08(Enterococcus faecalis SW08)，于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012417。

2.权利要求1所述的粪肠球菌应用于氨基甲酸乙酯水解酶的生产。

3.权利要求1所述的粪肠球菌应用于氨基甲酸乙酯的降解。

说明书

一株合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶的粪肠球菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种粪肠球菌及其应用，特别是一种能合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶的粪肠球菌及其应用。

背景技术

[0002] 氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)，在医学上有重要用途，曾一度被用作治疗多发性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作为麻醉剂使用。近年研究发现，氨基甲酸乙酯是一种人类潜在致癌物质，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸乙酯列为2A类致癌物。氨基甲酸乙酯是一种伴随发酵食品（如酒精饮料、豆酱、酱油等）的生产过程中产生的副产物，对食品安全和生物体健康都有着严重的影响和危害。面对氨基甲酸乙酯所造成的食品安全问题，以微生物及酶降解实现食品中氨基甲酸乙酯的无危害化，是较理想的解决方案。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一株合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶的粪肠球菌(Enterococcus faecals)SW08，已于2012年10月19日保藏于中国典型微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC M2012417，保藏地址为中国武汉武汉大学。菌落为白色圆形，表面干燥光滑，边缘规则，不透明，菌落大小1-2mm，兼性厌氧或厌氧，可用营养肉汤培养基通气培养或用MRS培养基厌氧静置培养。菌体革兰氏阳性，有荚膜，1000×显微镜下观察细胞呈球形。

[0004] 所述粪肠球菌分离自成年雌性小鼠胃肠道，其保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入营养肉汤培养基中，在30℃，200rpm，培养16h，取500μL培养液移入含有500μL40%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。

[0005] 上述的营养肉汤培养基为二型营养肉汤培养基，配方为蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，如需固体培养基，再添加2%琼脂。

[0006] 本发明的另一个目的是提供上述粪肠球菌粗酶液的提取方法。

[0007] 本发明的另一个目的是提供上述粪肠球菌的应用，其合成的耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶可以在NaCl浓度大于15%的条件下的条件下快速分解发酵食品中的副产物氨基甲酸乙酯并产生乙醇和氨气。其在最适pH7.0时具有最高酶活11U/g，在NaCl浓度大于15%的条件下， 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌所产生的耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶能够保持40%的酶活。

[0008] 本发明提供的粪肠球菌能合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶，在pH为7.0时具有最高酶活，能在高渗条件下快速分解氨基甲酸乙酯。在pH为7.0的条件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活为11U/g，在NaCl浓度大于15%的条件下，其能保持40%的氨基甲酸乙酯水解酶酶活。

附图说明

[0009] 图1粪肠球菌显微照片

[0010] 图2pH对粪肠球菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影响

[0011] 图3粪肠球菌氨基甲酸乙酯水解酶对NaCl的耐受性

具体实施方式

[0012] 实施例1：粪肠球菌筛选方法

[0013] 将25g每只5周大雌性昆明小鼠进行五天的强饲氨基甲酸乙酯溶液(200mg/kg body weight/day)后解剖，并用浓度为0.9%的生理盐水冲洗小鼠肠道组织，取组织悬浮液1mL于1000×g下离心10min，取上清液接种于富集培养基中（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g，氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH7.0），30℃下通气培养20h。培养液于2000×g离心5min，取上清涂布于筛选培养基（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯30g，琼脂20g，水1000mL，pH5.0）中培养三天。挑选菌落形态较大的菌株转移到营养肉汤培养基中培养20h后进行保藏。

[0014] 挑取-80℃保藏的菌株在营养肉汤琼脂固体培养基上划线，于37℃培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，37℃在转速为200rpm的摇床培养24h，离心5min(12000rpm,4℃)后收集菌体，再用pH7.0的磷酸盐缓冲液重悬浮菌体至0.1g/mL。通过超声破碎进行酶粗提液的提取，对粗酶液进行氨基甲酸乙酯水解酶酶活测定检测到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶活性的菌株，通过16S rDNA序列分析可知该菌株为一株粪肠球菌，已于2012年10月19日保藏于中国典型微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC M2012417，保藏地址为中国武汉武汉大学。

[0015] 实施例2：粪肠球菌中氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的提取方法

[0016] 挑取-80℃保藏的菌株在营养肉汤琼脂固体培养基上划线，于37℃培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，37℃在转速为200rpm的摇床培养24h，收集菌液50mL于冷冻高速离心机中低温离心10min(10000rpm,4℃)后收集菌体，菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS或50mM Tris-HCl（缓冲液pH应根据所筛选的蛋白稳定范围选取）重悬 洗涤三次。再用pH7.0的PBS缓冲液悬浮菌体至0.1g/mL。将菌液在-80℃冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。将反复冻融的菌液，置于冰水浴中进行超声破碎（必要时可加入适量的溶菌酶），超声条件：25W，工作2S，间隔2S，重复工作30min，直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间
60min。将菌体超声破碎后于低温离心机中离心10min(10000rpm,4℃)，将上清液转移到干净的Eppendorf管中，低温保存。

[0017] 实施例3：氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的酶活检测方法

[0018] 氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液酶活检测方法的原理是利用在一定条件下，氨基甲酸乙酯降解酶科将氨基甲酸乙酯分解生成乙醇，氨气和二氧化碳。氨与苯酚-次氯酸钠反应形成靛酚蓝显蓝色，用分光光度计在630nm处测其吸光值，分析氨的生成量，从而得到氨基甲酸乙酯水解酶的酶活。

[0019] 酶活测定试剂的配制：

[0020] 显色剂I：称取15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL [0021] 显色剂II：称取13.125g氢氧化钠和7.5mL次氯酸钠用超纯水定容至250mL [0022] 终止剂：称取10g三氯乙酸用超纯水定容至100mL

[0023] NH4+标准溶液制备：1mL氨水溶于超纯水中并定容至145mL，配成0.1mol/L的+NH4 溶液，并以此为母液，用超纯水将之稀释并配制成0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、+
0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH4 标准溶液。

[0024] 氨离子标准曲线的绘制：分别精确移取1mL NH4+标准梯度液置于顺序编号的10mL比色管中。37℃下恒温保温15min，立即吸取1mL终止剂于比色管中，振荡混匀。再依次加入1mL显色剂I和显色剂II，强烈振荡，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至10mL，在+630nm下比色测定OD值，以OD值为纵坐标，NH4 梯度为横坐标作图，得到标准曲线。 [0025] 酶活的测定

[0026] 取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和超纯水。然后在两管中分别加入1mL超纯水，在37℃恒温水浴箱中反应15min后，在两管各加入1mL三氯乙酸终止剂，混匀后加入1mL的显色剂I和1mL显色剂Ⅱ，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，630nm处比色，并记录OD值。

[0027] 酶活计算公式：酶活力＝ΔOD630×n×k×10/15

[0028] 式中：ΔOD630：酶反应后样品测定与空白试验光密度值之差

[0029] n：酶活测定液稀释倍数

[0030] k：标准曲线斜率的倒数

[0031] 10：1mL样品液稀释至10mL的倍数

[0032] 15：酶反应的时间(min)（酶反应的时间为15min）

[0033] 酶活定义

[0034] 酶活力定义：在常压、37℃条件下每分钟分解底物产生1μmol氨为一个酶活力单位。

[0035] 实施例4：氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液最适pH的确定

[0036] 按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。

[0037]

[0038] 准备二组各7支10mL比色管，第一组7支比色管中，在每支都加入8mL上表中相应的缓冲液，然后加入3%氨基甲酸乙酯溶液1mL,加入一定量的氨基甲酸乙酯水解酶粗提液（酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到线性范围内的的光吸收值A630。另一组7支试管也是每支都加入8mL上表中相应的缓冲液，但不再加氨基甲酸乙酯溶液而加入等量的去离子水，分别作为测定时的对照管。所有的试管都用水补足到10mL。按上述实施例三中酶活测定方法进行反应检测酶活。

[0039] 以酶活（U/g）为纵坐标，以pH为横坐标，绘制下氨基甲酸乙酯水解酶活性与pH的关系曲线。分析曲线并确定氨基甲酸乙酯水解酶的最适pH或pH范围。绘制得到的图谱见附图2。

[0040] 实施例五：氨基甲酸乙酯粗酶液耐盐性的研究

[0041] 将酶液在NaCl浓度分别为0%,5%,10%,15%,18%的缓冲液中，在酶活稳定的较低温度下保温20min，按照实施例三中的方法测定相应条件下的酶活，绘制盐浓度-残余酶活的关系曲线见附图3，确定酶的耐盐稳定性。