一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌，该菌株分类命名为纺锤芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）L13，已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7068。本发明还提供所述蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌在促进蓝莓根系生长中应用。本发明的蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌是从蓝莓根际土壤中筛选的，适应蓝莓特定的根际土壤环境，并能促进蓝莓生长。

权利要求

1.一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌，其特征在于：该菌株分类命名为纺锤芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）L13，已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7068。

2.权利要求1所述的蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌在促进蓝莓生长中应用。

说明书

一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 蓝莓(Vaccinum ssp.)，又称为越桔、越橘、蓝浆果，为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium L.)植物。蓝莓果实为浆果，富含各种维生素、熊果苷、花青苷、SOD、鞣化酸和黄酮类等抗氧化合物，是一种首先在美国发展起来的利用价值高、经济效益显著，具有极高的营养价值、保健作用和药用价值的营养保健果品。国际粮农组织将其列为人类五大健康食品之一，是果树中的珍品。

[0003] 蓝莓为寡营养植物，过多施肥或施肥不当易导致树体受到伤害。而且目前蓝莓种植时使用的肥料大多是传统的果树肥料，不仅针对性差，还很容易造成土壤板结，对蓝莓品质影响很大。微生物肥料不仅能改良土壤，改善土壤区系的生态环境，还能有效提高植物对土壤养分的吸收。中国专利CN201110128890.0公开了蓝莓菌根真菌（晶粒鬼伞）及其分离方法和用途，主要涉及了一株从长白山野生越橘属植物根系中分离获得的用于接种蓝莓的菌根真菌及其在促进蓝莓生长和提高产量方面的应用。中国专利CN201010180670.8公开了蓝莓培育及种植用微生态制剂、制备方法和使用方法，是用有机磷细菌、胶冻样芽孢杆菌、乳酸杆菌、蜡状芽孢杆菌、光合菌、固氮根瘤菌、假丝酵母和丝状真菌分别纯化培养后将各菌液混合配制而成。目前还未见蓝莓专用的根际促生细菌筛选和应用的报道。

[0004] 植物根际促生细菌是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌统称，对植物生长及病害防治有极其重要的作用。植物根际促生细菌可分泌植物促生物质，包括植物激素、维生素、氨基酸和其它活性有机小分子及衍生物等；还可改善植物根际的营养环境，有效控制植物病害等。据不完全统计，已发现包括假单胞菌和芽抱杆菌等20多个属的植物根际促生细菌具有防病促生潜能的报道。但植物根际促生细菌具有很强的专一性，蓝莓生长条件又比较特殊，只适宜在有机质含量高的酸性土壤（4.0～4.8）生长，而在pH4.0～4.8环境下绝大多数微生物不能正常生长。因此，筛选专用于蓝莓的根际促生细菌，对促进蓝莓生长、提高蓝莓的产量和质量有重要的意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌及其应用。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌，该菌株分类命名为纺锤芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）L13，已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7068。

[0008] 所述蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌的菌落特征及菌体形态：

[0009] 纺锤芽孢杆菌L13在LB平板上培养24h后形成乳白色菌落，圆形，不透明，边缘整+齐光滑，中间有突起褶皱，菌体细胞大小为（0.5-2.5）μm×（1.2-10）μm，产芽孢，G，细胞呈杆状。

[0010] 所述蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌的生理生化特征：

[0011] 淀粉水解试验阴性，明胶液化试验阳性，葡萄糖产酸阴性，葡萄糖产气阴性，伏-普试验阴性，甲基红试验阴性，吲哚试验阴性，硝酸盐还原实验阴性。

[0012] 将所述蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：L13与Bacillus fusiformis同处于一个最小分支上，其16S rDNA序列与Bacillusfusiformis(AF169537)的相似性达98%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)。

[0013] 所述蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌可产吲哚乙酸（IAA），对调节植物生长和发育具有重要作用。

[0014] 本发明的有益效果：

[0015] 本发明的蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌筛选制成菌剂后接种到蓝莓幼苗，可明显促进蓝莓根系生长，增加蓝莓的株高和茎粗，与对照相比，差异达到显著水平。因此，本发明为将来开发蓝莓专用的微生物肥料提供了优良的菌株资源。

具体实施方式

[0016] 下面结合实施例对本发明进一步说明。

[0017] 一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌，该菌株分类命名为纺锤芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）L13，已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7068。

[0018] 实施例1蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌的筛选

[0019] （1）筛选过程：

[0020] 通过梯度稀释法，从山东省胶南市沃林蓝莓生产基地的蓝莓根际土样中分离出216株分离物。通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到LB斜面上保存备用。通过保绿法筛选出14株保绿效果较好的菌株，结合萝卜子叶增重法，最终筛选出1株具有良好促生效果的细菌，记为L13。

[0021] （2）菌落特征及菌体形态：

[0022] 纺锤芽孢杆菌L13在LB平板上培养24h后形成乳白色菌落，圆形，不透明，边缘整+齐光滑，中间有突起褶皱，菌体细胞大小为（0.5-2.5）μm×（1.2-10）μm，产芽孢，G，细胞呈杆状。

[0023] （3）生理生化特征：

[0024] 淀粉水解试验阴性，明胶液化试验阳性，葡萄糖产酸阴性，葡萄糖产气阴性，伏-普试验阴性，甲基红试验阴性，吲哚试验阴性，硝酸盐还原实验阴性。

[0025] （4）产吲哚乙酸（IAA）能力测定

[0026] 将纺锤芽孢杆菌L13接种于LB培养基，28℃，180rpm摇床培养4d。用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski(50mL35%HClO4+1mL0.5M FeCl3)比色液，避光静置30min，测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量，通过IAA梯度稀释的标准曲线计算-1IAA的含量。通过测定，纺锤芽孢杆菌L13产IAA含量为17.38μg/(mL·OD600) 。

[0027] （5）16S rDNA序列分析

[0028] 16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：L13与Bacillus fusiformis同处于一个最小分支上，其16S rDNA序列与Bacillus fusiformis(AF169537)的相似性达98%。结合菌落形态，生理生化特征和16SrDNA序列分析，鉴定为纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)。

[0029] 实施例2蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌对蓝莓生长具有促生作用

[0030] 将保存的蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌L13在LB斜面上活化，挑取一环接入牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH7.0-7.2，以上均为质量百分比）中，于37℃，180rpm条件下振荡培养2天。发酵液6000rpm下离心5min，无菌生理盐8
水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节菌悬液（2.0×10cfu/m）制成接种剂。将蓝莓容器苗定植后，取20ml用无菌水稀释10倍均匀浇灌于蓝莓根部周围。以浇灌等量无菌生理盐水作为对照，三个月后测定蓝莓的根系、苗高及地径情况，结果如表所示。

[0031] 从表中可以看出，蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌悬液处理的蓝莓不定根长度、不定根茎部粗、株高和茎粗分别比对照提高了14.40%、12.04%、11.23%和9.95%，差异均达显著水平。以上表明：菌株L13对蓝莓的生长具有明显的促进作用。

[0032]

[0033]

[0034] 不定根是指长度10cm以上，基部直径0.1cm以上，长度10cm以上的根系；不定根茎部粗指根基部2cm处的粗度；株高指从地表到茎顶端的长度，茎粗指距地面5cm处的粗度。同一列中相同字母表示差异不显著，否则表示差异显著(p<0.05)。