本发明涉及了一种花生中逆境胁迫AhMYBL6基因的克隆及功能表达方法，通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的合成、使用RT-PCR进行克隆合成出了逆境胁迫AhMYBL6基因，该基因开放阅读框为861bp，共编码287个氨基酸；基因氨基酸序列与大豆的MYB家族蛋白GmMYB4,GmMYB29,GmMYB29A2同源性均达到了60%以上。通过荧光定量PCR验证了AhMYBL6在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，AhMYBL6在各种胁迫处理1h后表达量均有明显提高，并且此后一直维持在较高的水平，在低温处理的叶片中AhMYBL6的表达量最高提高了20多倍，将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性，AhMYBL6基因能显著提高花生的抗逆性。
1.一种花生逆境胁迫AhMYBL6 基因的克隆方法，主要包括以下步骤：
（1）材料的准备与处理：材料选择花生花育19，花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22℃-28℃，生长2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；
材料的低温处理，将三叶期花生幼苗放入4℃光照培养箱中进行处理，取处理时间分别为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；
对于抗旱，用PEG6000处理；将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或重量浓度为20%PEG6000溶液中，在处理0h，1h，3h，6h，12h，
24h，48h和72h分别取花生的根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用；
按照试剂盒操作手册的方法用天根的RNeasy Mini Kit分离提取花生幼苗cDNA，用RQ1 RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成；用M-MLV Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2 μg RNA，在42°C条件下经过60 min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5 min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用；
通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA Taq DNA polymerase，在25-μL体系中加入以下成分：含MgCl2的2.5 μL 10× PCR buffer ；2.5 μL 10 mM dNTPs；1 μL cDNA 模板；0.5 μL LA polymerase和17.5 μL ddH2O；PCR反应条件为：(a) 94℃，5 min；
(b) 94℃，45 s；55℃，45 s；72℃，90 s；共35 cycles； (c) 72℃， 10 min；
扩增基因全长所用引物为AhMYB6-S: 5’-GAAGCAAAGATGGTGA GA-3’和AhMYB6-A:
5’-AGCCCTAATCAAAGACGA-3’；
PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用Axygen胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector 并测序；
其特征在于所述的AhMYBL6 基因的核苷酸序列是序列表中SEQUENCE 1。
2.根据权利要求1所述的花生逆境胁迫AhMYBL6 基因的克隆方法，其特征在于：所述的AhMYBL6 基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与大豆的MYB家族蛋白GmMYB4, GmMYB29, GmMYB29A2同源性均达到了60%以上。
3.根据权利要求1所述的花生逆境胁迫AhMYBL6 基因的克隆方法，其特征在于：所述的AhMYBL6 基因的氨基酸序列是序列表中SEQUENCE 2。
4.根据权利要求1至3任一种花生逆境胁迫AhMYBL6 基因功能表达方法，使用荧光定量Real-time RT-PCR对AhMYBL6 基因逆境下的表达进行分析，其方法如下：-1
荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8 ng.μL ，用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taq polymerase，用的仪器是LightCycler 2.0 instrument system，每反应体系加2 μL稀释的cDNA；
PCR反应程序如下：(a) 95℃， 10 s；(b) 95℃，5 s，40 cycles；(c) 60℃，30 s；(d)
72℃，10 s；PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃，β-actin为RT-PCR的内参基因。
5.根据权利要求4花生逆境胁迫AhMYBL6 基因功能表达方法，其特征在于：AhMYB6荧光定量RT-PCR用的引物序列为：QAhMYBL6-S：5’- ACCACCACTA CAACAACA-3’ 和QAhMYBL6-A：5’-ATCATCAATTCCTGCCTCT-3’。
6.根据权利要求4花生逆境胁迫AhMYBL6 基因功能表达方法，其特征在于：所述的内参基因β-actin 所用引物序列为：Qactin-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGG ATGC-3’ 和 Qactin-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
一种花生中逆境胁迫AhMYBL6 基因的克隆及功能表达方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种花生逆境胁迫AhMYBL6 基因的克隆及功能表达方法。
背景技术
[0002] 花生为豆科落花生属作物，富含油脂和蛋白，是我国重要的油料作物和经济作物。花生的产量和品质受干旱、盐碱等胁迫影响非常严重，全国每年因干旱引起的花生减产率达20％以上。但由于花生品种资源遗传基础狭窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐盐的基因源，利用常规育种方法难以培育出高抗品种。随着分子生物学的快速发展，近年来利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了显著成果，对胁迫相关基因和信号转导途径也有了更深入的了解。
[0003] MYB蛋白是近年来从植物中发现的一类转录因子，根据保守结构域的重复数，MYB家族蛋白分为四个亚家族：1R-MYB，2R-MYB，3R-MYB和4R-MYB。该类转录因子在植物发育，激素信号转导，病原抗性及非生物胁迫抗性中均有重要功能。该家族基因的表达受干旱、冷害、盐胁迫等诱导。现已在水稻、小麦、拟南芥、烟草、大豆和番茄等植物中发现了该类基因。 [0004] 已有研究表明，几个R2R3-MYB 基因参与了植物对干旱、高盐及低温逆境的响应(Chen et al. 2006; Agarwal et al. 2006) 。Ma等（2009）在水稻中超表达OsMYB3R-2，转基因水稻对低温胁迫的抗性提高。Pasquali等（2008）在苹果中超表达水稻的OsMYB4能够提高转基因植株对低温和干旱的抗性。Zhang等（2012）将小麦的TaMYB56-B在拟南芥中超表达能够提高拟南芥对冷冻和盐胁迫的抗性。大量研究表明在各种非生物胁迫过程中，MYB家族蛋白的积累对植物在胁迫条件下起潜在的保护作用，但目前尚未见该类基困在花生中克隆和功能研究的报道。
发明内容
[0005] 为了提高花生生长的抗逆境能力，增强其耐盐、抗旱、耐低温能力，发明了一种花生逆境胁迫基因AhMYBL6 的克隆及功能表达方法。
[0006] 技术方案
[0007] 一种花生逆境胁迫AhMYBL6 基因的克隆及功能表达方法，主要包括以下步骤：
[0008] （1）材料的准备与处理：材料为花生花育19（Arachis hypogaea L. cultivar Huayu19）。花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗（28℃/22℃）。生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理。
[0009] 低温处理，将三叶期花生幼苗至于4℃光照培养箱中进行处理，分别于处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；对于抗旱，用PEG6000处理。将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或重量浓度20%PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，
24h，48h和72h分别取花生的根作为材料。所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。 [0010] （2） RNA的提取和cDNA的合成
[0011] 本实验用天根的RNeasy Mini Kit (Qiagen)分离提取花生幼苗RNA。RQ1 RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2 μg RNA。在42°C条件下经过60 min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5 min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。
[0012] （3）基因克隆
[0013] 通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA TaqTM DNA polymerase (TaKaRa)，在25-μL体系中加入以下成分：2.5 μL 10× PCR buffer （含MgCl2）；2.5 μL10 mM dNTPs；1 μL cDNA 模板；0.5 μL LA polymerase和17.5 μL ddH2O。PCR反应条件为：(a) 94℃，5 min；(b) 94℃，45 s；55℃，45 s；72℃，90 s；共35 cycles； (c) 72℃，
10 min。扩增基因全长所用引物为AhMYB6-S: 5’-GAAGCAAAGATGGTGA GA-3’和AhMYB6-A:
5’-AGCCCTAATCAAAGACGA-3’。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Axygen)进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector (Takara) 并测序(Sangon, Shanghai)。
[0014] 本发明的AhMYBL6 基因开放阅读框为861bp，共编码287个氨基酸。
[0015] 本发明的AhMYBL6基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与大豆的MYB家族蛋白GmMYB4, GmMYB29, GmMYB29A2同源性均达到了60%以上。
[0016] 本发明的AhMYBL6 基因的核苷酸序列是序列表中SEQUENCE 1。
[0017] 本发明的AhMYBL6 基因的氨基酸序列是序列表中SEQUENCE 2。
[0018] 用荧光定量Real-time RT-PCR对AhMYBL6 基因进行功能表达：
[0019] 荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8 ng μL-1，用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taq polymerase (Takara)，用的仪器是LightCycler 2.0 instrument system (Roche, Germany)，每反应体系加2 μL稀释的cDNA。PCR反应程序如下：(1) 95℃， 10 s；(2)95℃，5 s，40 cycles；(3) 60℃，30 s；(4) 72℃，10 s。PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃。β-actin 为荧光定量PCR内参基因。
[0020] AhMYB6 荧光定量RT-PCR用的引物序列 为：QAhMYBL6-S：5’- ACCACCACTA CAACAACA-3’ 和QAhMYBL6-A：5’-ATCATCAATTCCTGCCTCT-3’。
[0021] 内参基因β-actin 所用引物序列 为：Qactin-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGG ATGC-3’ 和 Qactin-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
[0022] 本发明的显著效果
[0023] 通过荧光定量PCR验证了AhMYBL6 在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高（图2）。从图2可以看出，AhMYBL6 在各种胁迫处理1h后表达量均有明显提高，并且此后一直维持在较高的水平，在低温处理的叶片中AhMYBL6的表达量最高提高了20多倍（图2，B）。以上结果表明AhMYBL6可能在花生对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。说明AhMYBL6 基因能显著提高花生的抗逆性。
附图说明
[0024] 图1 花生AhMYBL蛋白与大豆中MYB家族蛋白氨基酸序列比较
[0025] NCBI上蛋白编号：GmMYB4，XP_003518022；GmMYB29，NP_001241360；GmMYB29A2，BAA81732。
[0026] 图2 AhMYBL6 在低温，NaCl，PEG6000处理下表达模式分析
[0027] A：AhMYBL6在低温处理的花生根中表达变化；B：AhMYBL6在低温处理的花生叶片中表达变化；C：AhMYBL6 在200mM NaCl处理的花生根中表达变化；D：AhMYBL6在20% PEG6000处理的花生根中表达变化。
具体实施方式
[0028] 下面结合附图与具体实施例进一步说明本发明，但并不是对本发明的进一步限定。
[0029] 本发明的具体实施过程为：
[0030] 1 实验材料与方法
[0031] 1.1 实验材料
[0032] 实验材料为花生花育19（Arachis hypogaea L. cultivar Huayu19）。花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗（28℃/22℃）。生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理实验。
[0033] 对于低温处理，将三叶期花生幼苗至于4℃光照培养箱中进行处理，分别于处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生叶片和根作为实验材料；对于耐盐用NaCL处理；
对于抗旱，用PEG6000处理。将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或20%PEG6000溶液中，在处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的根作为实验材料。所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。 [0034] 的提取和cDNA的合成
[0035] 本实验用天根的RNeasy Mini Kit (Qiagen)分离提取花生幼苗RNA。RQ1 RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2 μg RNA。在42°C条件下经过60 min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5 min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。
[0036] 基因克隆
[0037] 通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA TaqTM DNA polymerase (TaKaRa)，在25-μL体系中加入以下成分：2.5 μL 10× PCR buffer （含MgCl2）；2.5 μL10 mM dNTPs；1 μL cDNA 模板；0.5 μL LA polymerase和17.5 μL ddH2O。PCR反应条件为：(1) 94℃，5 min；(2) 94℃，45 s；55℃，45 s；72℃，90 s；共35 cycles； (3) 72℃，
10 min。扩增基因全长所用引物为AhMYB6-S: 5’-GAAGCAAAGATGGTGA GA-3’和AhMYB6-A:
5’-AGCCCTAATCAAAGACGA-3’。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Axygen)进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector (Takara) 并测序(Sangon, Shanghai)。
[0038] 荧光定量Real-time RT-PCR
[0039] 荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8 ng μL-1，用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taq polymerase (Takara)，用的仪器是LightCycler 2.0 instrument system (Roche, Germany)，每反应体系加2 μL稀释的cDNA。PCR反应程序如下：(1) 95℃， 10 s；(2)95℃，5 s，40 cycles；(3) 60℃，30 s；(4) 72℃，10 s。PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃。β-actin 为实验的内参基因。
[0040] AhMYB6 荧 光定 量 验 证用 的 引物 序 列 为：QAhMYBL6-S：5’- ACCACCACTA CAACAACA-3’ 和QAhMYBL6-A：5’-ATCATCAATTCCTGCCTCT-3’。
[0041] 内参基因β-actin 所用引物序列 为：Qactin-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGG ATGC-3’ 和 Qactin-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
[0042] 实验结果
[0043] 2.1 AhMYBL6 核苷酸全长及其编码的氨基酸序列
[0044] 通过PCR扩增及测序，得到了目的基因，该基因开放阅读框为861bp，共编码287个氨基酸。将该基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与大豆的MYB家族蛋白GmMYB4, GmMYB29, GmMYB29A2同源性均达到了60%以上（图1），故将该基因命名为AhMYBL6 （Arachis hypogaea MYB Like 6）。
[0045] AnMYBL6在非生物胁迫下的表达模式分析
[0046] 通过荧光定量PCR验证了AhMYBL6 在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高（图2）。从图2可以看出，AhMYBL6 在各种胁迫处理1h后表达量均有明显提高，并且此后一直维持在较高的水平，在低温处理的叶片中AhMYBL6的表达量最高提高了20多倍（图2，B）。以上结果表明AhMYBL6可能在花生对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。说明这个基因能显著提高花生的抗逆性。
