一种脂肪细胞中自噬的监测方法

摘要

本发明公开了一种脂肪细胞中自噬的监测方法，成熟脂肪细胞由于其特殊的结构，胞内充满大量脂滴，使细胞器和核向周边移位，电镜下难以看到典型的自噬体。但本发明经过多次实验，不断改进实验条件，终于成功的在成熟的3T3-L1脂肪细胞内观察到处于各个自噬阶段的自噬结构。此外，由于成熟脂肪具有不易转染的特点，普通的质粒转染很难达到预期的效果。因此，本发明利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪细胞，荧光显微镜下观察感染效率达到80%以上。在营养饥饿情况下，本发明成功观察到GFP-LC3点状聚集现象。成熟脂肪细胞内自噬监测方法的建立为以后研究自噬与脂代谢的关系奠定了基础。

权利要求

1.一种脂肪细胞中自噬的监测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）培养及诱导分化3T3-L1前脂肪细胞获得成熟的脂肪细胞，用0.2%BSA-DMEM孵育

12h，裂解所获得的脂肪细胞，抽提其蛋白质，具体过程为：

3T3-L1前脂肪细胞株的培养与传代：

3T3-L1成纤维细胞培养于正常高糖DMEM溶液中，置于37℃，5%CO2孵箱，待显微镜下观察细胞已贴壁，呈梭形、透亮，更换培养液至细胞至90%融合时进行传代，将培养液从培养瓶中吸出，加入0.25%胰酶4ml进行消化，显微镜下可见细胞由不规则的多角形或梭形收缩成圆形，该过程约需2min，加入正常培养液终止胰酶的反应，用移液管反复吹打瓶壁上残留的细胞，使细胞脱离培养瓶壁，吸入已装有培养液的离心管中，1000rpm离心3min，沉淀细胞，离心后，弃去上清，再加入正常培养液，用移液管吹打，使细胞分散开，根据接种密度取部分含细胞的培养液接种于12孔板或6孔板中，5%CO2的培于养箱中37℃培养；

3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化：

在细胞传代后的隔天换正常培养液，正常培养液为体积分数80%DMEM+20%胎牛血清，继续培养48h，待细胞融合后，加入诱导液A，诱导液A为正常高糖DMEM含0.5mM IBMX,1μMDEX,1.7μM INS，开始诱导，第0天，培养48h，第2天，撤去诱导液A，换以含

1.7μM胰岛素的培养液，即诱导液B，再培养48h，第4天，撤去诱导液B，以后均换以正常髙糖DMEM培养液，此时可见少数细胞形态呈圆形，并有少量脂滴出现，以后隔天换一次培养液，第8天可见90%以上细胞呈圆形并出现大量脂滴，即表示3T3-L1前脂肪细胞已诱导成功，成为成熟的脂肪细胞，将诱导好的脂肪细胞用0.2%BSA-DMEM孵育12h；

移去培养液，以冰冷的PBS洗3次，加入细胞裂解液，每ml裂解液加10μl磷酸酶抑制剂，4℃保存，5μl蛋白酶抑制剂和10μg/ml的PMSF，冰上放置30min；用细胞刮勺刮下细胞，移至离心管；视情况进行超声裂解，频率为5Hz，每次3s，间隔5s，匀浆3～6次；4℃，

12000rpm离心15min，转移至另一离心管，吸取上清液，上清液为细胞裂解液，即为所抽提的蛋白质；

（2）采用BCA法对蛋白质进行定量，计算所获得的蛋白质样品的浓度，然后进行蛋白免疫印迹分析；

（3）以小鼠的肝脏cDNA为模板，根据Genebank的小鼠LC3b基因NM_025735.2编码区设计引物，根据载体质粒上的多克隆位点选择LC3b编码区不含有的酶切位点加入到引物的上下游,上游引物的序列为：CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位点为Xho Ⅰ；下游引物的序列为CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位点为BamH Ⅰ；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪观察条带大小，保存图像，然后PCR产物割胶回收，以小鼠cDNA为模板经PCR反应扩增出LC3b DNA片段，后者和载体pLVX-IRES-ZsGreen1经Xho Ⅰ和BamH Ⅰ限制酶37℃酶切4h后，分别取双酶切后的6ul的LC3b片段和2ul的pLVX-IRES-ZsGreen1进行T4DNA连接酶4℃连接过夜，将连接产物10ul转化感受态细胞DH5α，冰上放置30min后，42℃水浴90s，后加入900ul LB培养基，150r/min，37℃摇床摇菌，将菌液12000r/min离心，1min后均匀涂到Amp抗性的琼脂培养基上，待液体吸收后倒置培养皿，37℃，过夜，挑单一菌落摇菌14-16小时，小量抽提质粒，经Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，取酶切验证后的质粒进行测序分析；

（4）用PLVX-LC3b-IRES-ZsGreen1质粒，delta8.9质粒和VSVG转染293T细胞，收集病毒上清，进行慢病毒滴度的测定；

（5）病毒转染成熟3T3-L1脂肪细胞，共聚焦显微镜观察及电镜观察自噬体。

说明书

一种脂肪细胞中自噬的监测方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肪细胞中自噬的监测方法。

背景技术

[0002] 1962年，Ashford和Porten发现自噬现象。通过定向敲除自噬必需的基因，发现自噬作用在多方面发挥重要作用，如肿瘤抑制，神经保护，红细胞分化,另有报道，自噬涉及到生长发育、衰老、组织稳态的控制。神经变性、肿瘤、Huntington病、Parkinson病、肌病和心肌病等都涉及到自噬调节紊乱，自噬还诱导2型程序性死亡。

[0003] 随着近十年来自噬领域研究的“爆炸式”的发展，吸引着不同专业背景的科学家从各个角度进入这一领域。最近研究发现，自噬在调节脂质代谢和脂肪细胞的分化方面发挥重要作用。自噬在脂肪细胞功能中的作用研究虽然刚刚起步，目前代表性的文献只有2-3篇，但已经显示出巨大的研究前景。同时，对成熟的脂肪细胞上自噬的调控机制的研究目前几乎空白。

[0004] 因此，在脂肪细胞中建立一套成熟的监测自噬的技术方法就具有重要意义。成熟脂肪细胞由于其特殊的结构，胞内充满大量脂滴，使细胞器和核向周边移位，电镜下难以看到典型的自噬体。但我们经过多次实验，不断改进实验条件，终于成功的在成熟的3T3-L1脂肪细胞内观察到处于各个自噬阶段的自噬结构。此外，由于成熟脂肪脂肪具有不易转染的特点，普通的质粒转染很难达到预期的效果。因此，我们利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪细胞，荧光显微镜下观察感染效率达到80%以上。在营养饥饿情况下，我们成功观察到GFP-LC3点状聚集现象。成熟脂肪细胞内自噬监测方法的建立为我们以后研究自噬与脂代谢的关系奠定了基础。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于在脂肪细胞中建立一套监测自噬的技术方法。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 一种脂肪细胞中自噬的监测方法，包括以下步骤：

[0008] （1）培养及诱导分化3T3-L1前脂肪细胞获得成熟的脂肪细胞，用0.2%BSA-DMEM孵育12h，裂解所获得的脂肪细胞，抽提其蛋白质；

[0009] （2）采用BCA法对蛋白质进行定量，计算所获得的蛋白质样品的浓度，然后进行蛋白免疫印迹分析；

[0010] （3）以小鼠的肝脏cDNA为模板，根据Genebank的小鼠LC3b基因编码区设计引物，根据载体质粒上的多克隆位点选择LC3编码区不含有的酶切位点加入到引物的上下游，上游引物的序列为：CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位点为XhoⅠ；下游引物的序列为CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位点为BamHⅠ；PCR产物割胶回收，扩增出LC3b DNA片段，取双酶切后的的LC3片段和的pLVX-IRES-ZsGreen1进行T4DNA连接酶连接，培养产物，提取质粒，取酶切验证后的质粒进行测序分析；

[0011] （4）用PlVX-LC3-IRES-ZsGreen1质粒，delta8.9质粒和VSVG转染293T细胞，收集病毒上清，进行慢病毒滴度的测定；

[0012] （5）病毒转染成熟3T3-L1脂肪细胞，共聚焦显微镜观察及电镜观察自噬体。

[0013] 成熟脂肪细胞由于其特殊的结构，胞内充满大量脂滴，使细胞器和核向周边移位，电镜下难以看到典型的自噬体。但本发明经过多次实验，不断改进实验条件，终于成功的在成熟的3T3-L1脂肪细胞内观察到处于各个自噬阶段的自噬结构。此外，由于成熟脂肪具有不易转染的特点，普通的质粒转染很难达到预期的效果。因此，本发明利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪细胞，荧光显微镜下观察感染效率达到80%以上。在营养饥饿情况下，本发明成功观察到GFP-LC3点状聚集现象。成熟脂肪细胞内自噬监测方法的建立为我们以后研究自噬与脂代谢的关系奠定了基础。

具体实施方式

[0014] 实施例：

[0015] 3T3-L1前脂肪细胞株的培养与传代

[0016] 3T3-L1成纤维细胞培养于正常高糖DMEM溶液中，置于37℃，5%CO2孵箱，待显微镜下观察细胞已贴壁，呈梭形、透亮，更换培养液至细胞至90%融合时进行传代。将培养液从培养瓶中吸出，加入0.25%胰酶4ml进行消化，显微镜下可见细胞由不规则的多角形或梭形收缩成圆形，该过程约需2min。加入正常培养液终止胰酶的反应，用移液管反复吹打瓶壁上残留的细胞，使细胞脱离培养瓶壁，吸入已装有培养液的离心管中，1000rpm离心3min，沉淀细胞。离心后，弃去上清，再加入正常培养液，用移液管吹打，使细胞分散开。根据接种密度取部分含细胞的培养液接种于12孔板或6孔板中，5%CO2的培于养箱中37℃培养。

[0017] 3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化

[0018] 在细胞传代后的隔天换正常培养液（体积分数80%DMEM+20%胎牛血清），继续培养48h。待细胞融合后，加入诱导液A（正常高糖DMEM含0.5mM IBMX,1μM DEX,1.7μM INS）开始诱导（第0天），培养48h。第2天，撤去诱导液A，换以含1.7μM胰岛素的培养液（诱导液B）再培养48h。第4天，撤去诱导液B，以后均换以正常髙糖DMEM培养液，此时可见少数细胞形态呈圆形，并有少量脂滴出现。以后隔天换一次培养液。第8天可见90%以上细胞呈圆形并出现大量脂滴，即表示3T3-L1前脂肪细胞已诱导成功，成为成熟的脂肪细胞。将诱导好的脂肪细胞用0.2%BSA-DMEM孵育12h，即可进行后续实验。

[0019] 移去培养液，以冰冷的PBS洗3次，加入细胞裂解液，每ml裂解液加10μl磷酸酶抑制剂（4℃保存），5μl蛋白酶抑制剂(sigma产品，和-20℃保存)和PMSF（10μg/ml），冰上放置30min；用细胞刮勺刮下细胞，移至离心管；视情况进行超声裂解，频率为5Hz，每次3s，间隔5s，匀浆3～6次；4℃，12000rpm离心15min，转移至另一离心管，吸取上清液，上清液为细胞裂解液，即为所抽提的蛋白质；

[0020] 蛋白质定量

[0021] 配制浓度为0，0.25mg/ml，0.5mg/ml,1mg/ml,1.5mg/ml,2mg/ml标准品BSA；配制测定试剂A和B的混合液，体积比A：B为50：1；取96孔酶标仪专用测定板，在待加测定样品的孔中加去离子水22.5μl，之后在每孔加入待测样品2.5μl；在设定待加标准品的孔中，分别加入25μl标准品；每孔加入，配好的A和B混合液160μl；用锡箔纸封好酶标板，在酶标仪上用中等强度震荡20秒；37℃水浴30分钟；将酶标板取出，冷却至室温，分光光度计540nm检测吸光度，按照标准品的检测结果绘制标准曲线，计算样品浓度；

[0022] 蛋白免疫印迹分析

[0023] 测定好浓度的各处理组蛋白样本，用裂解液调至同浓度后，加入蛋白样本上样缓冲液4×loading buffer，混合均匀，99℃变性10min后，立即放入0℃的冰水浴中冷却，即可上样电泳或放入-20℃冰箱冷藏。

[0024] SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备及灌胶：

[0025] 分离胶：分离胶按下表成分配好后，迅速搅拌匀，倒入装置好的玻璃槽中约4/5高，上面轻轻地覆以无水乙醇隔离胶体与空气，并使表面平整。待胶体凝结后，倒掉乙醇，并以超纯水冲洗干净。以无尘纸吸干表面水分。

[0026] 积层胶：取配制好积层胶，迅速搅拌均匀后，倒入玻璃槽内，插入样品梳，注意不要产生气泡。待胶体凝结，上样前取出样品梳。

[0027]

[0028] 分离范围：12%分离胶：12-60KD；10%分离胶：20-80KD

[0029] SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入1×电泳缓冲液；样品离心，室温冷却，依次将样品加到样品孔底部；5μl蛋白Marker直接上样；积层胶电泳电压用80V，待溴酚蓝指示到分离胶和积层胶交界处时，分离胶改用100V，直至溴酚蓝指示电泳至凝胶底部或稍长时间，一般电泳时间为1.5-2小时；将凝胶放入去离子水中漂洗数秒；剪4张Whatman3mm滤纸和1张NC膜，其大小与凝胶大小完全吻合，将3mm滤纸浸泡在转膜缓冲液中5分钟；塑料网孔支架置于转膜缓冲液中，小心取下凝胶（可用胶片）将凝胶放入去离子水中漂洗数秒，在电极支架上放上浸泡于转移缓冲液中的海绵垫，其上放2张3mm滤纸，叠放整齐，赶净气泡，将凝胶放在3mm滤纸上，注意凝胶与滤纸之间不要有气泡，再将NC膜准确放在凝胶上，最后将2张3mm滤纸放在NC膜上面并确保各层精确对齐和没有气泡；将有膜的一面朝阳极安装转移装置，接通电源，100V转移约2小时；转膜结束后，取下膜，可以通过预染的彩色中分子量Marker判断转移效率标记正反面；

[0030] 丽春红染色

[0031] 将NC膜置丽春红S中染色后，可见多条粉红色蛋白条带；用铅笔标记蛋白Marker的位置，然后用蒸馏水洗至膜发白（可在脱色摇床洗脱）；

[0032] 将膜按需要剪下所需部分，放入含有5％脱脂奶粉的TBS封闭液中室温平缓摇动2h，或4℃封闭过夜。（5％脱脂奶粉：1g脱脂奶粉+1×TBS20ml）。

[0033] 免疫印迹

[0034] 封闭后用PBS洗膜几次，将封闭液洗掉；一抗按1:1000的比例配置，取5ml抗体稀释液，加入5μl一抗，将抗体倒入杂交瓶内，将膜蛋白放入瓶中，蛋白面朝里，室温杂交2h，或4℃杂交过夜；杂交瓶中取出膜蛋白，用PBST洗膜，加入洗膜液后，放在摇床上洗膜，每5min换一次液，共洗四次；按加一抗的方法，加入杂交瓶中二抗（GAPDG按1:20000配置），室温杂交1h；取出膜，在摇床上洗膜，5min换一次液，前三次用PBST，最后一次用PBS；荧光检测：取ECL Plus发光检测试剂Solution A与Solution B按40:1比例混合，将经过充分洗涤的膜有蛋白质的一面向上，将检测试剂加在有蛋白质的一面，置入暗盒中，然后放置x光片。曝光时间根据目的条带的强度与背景信号强弱而定，一般30秒；褪膜(stripping)如果待检测的两个蛋白质的分子量相同或相近，需要stripping，将NC膜上的一抗和二抗等褪去，然后再与另外的抗体杂交；用TBST洗膜15分钟2次；将膜浸泡于洗脱液（stripping buffer）中50℃10min，洗去杂交条带；用TBST洗膜15分钟2次；室温封闭1小时，其余与上同，Stripping一次蛋白会损失20-50％，所以尽量减少stripping次数；

[0035] GFP-LC3慢病毒的构建：以小鼠的肝脏cDNA为模板，根据Genebank的小鼠LC3b基因（NM_025735.2）编码区设计引物。根据载体质粒上的多克隆位点（multiplecloning site，MCS）选择LC3编码区不含有的酶切位点加入到引物的上下游。上游引物的序列为：

[0036] CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位点为XhoⅠ；下游引物的序列为CGCGGATCC

[0037] CCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位点为BamHⅠ。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪观察条带大小，保存图像，然后PCR产物割胶回收。

[0038] 以小 鼠cDNA为模 板经PCR反 应扩增 出LC3b DNA片段，后者 和载 体pLVX-IRES-ZsGreen1经XhoⅠ和BamHⅠ限制酶37℃酶切4h后，分别取双酶切后的6ul的LC3片段和2ul的pLVX-IRES-ZsGreen1进行T4DNA连接酶4℃连接过夜（或16℃，3h）。将连接产物10ul转化感受态细胞DH5a，冰上放置30min后，42℃水浴90s，后加入900ul LB培养基，150r/min，37℃摇床摇菌。将菌液12000r/min离心，1min后均匀涂到Amp抗性的琼脂培养基上，待液体吸收后倒置培养皿，37℃，过夜。挑单一菌落摇菌14-16小时，小量抽提质粒。经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，取酶切验证后的质粒进行测序分析。

[0039] 将293T细胞铺板于10cm培养皿，24h内转染病毒的三种质粒，细胞密度在80%左右。15ug PlVX-LC3-IRES-ZsGreen1质粒，delta8.9质粒和6ug VSVG将9ug质粒加入到1.5ml Opti-MEM减血清培养基；同时将18ul Lipofectamine2000加入到1.5ml Opti-MEM减血清培养基，然后将两者混合静置20min后滴入细胞培养皿。分别在转染后的24h、48h收集病毒上清，1000r/min，离心3min去除死细胞，后经0.45um滤器过滤。将病毒上清置于超速离心管内，4℃,25000×g超速离心120min。10%FBS重悬病毒沉淀，4℃冰箱保存。同时，转染空载pLVX-IRES-ZsGreen1，VSVG和delta8.9至293T细胞，收集病毒浓缩后做阴性对照。

[0040] 慢病毒滴度的测定，按照上海市吉凯基因化学技术有限公司的操作手册进行：

[0041] 滴度测定前一天，293T细胞接种96孔板，每孔5×103个细胞；准备8个无菌的EP管，每管内加入90ul新鲜完全培养液（11995DMEM+10%FBS）；将待测的病毒液11ul加入到第一个EP管，混匀，吸取11ul加到第二个EP管内。依次操作，加到最后一管为止；吸取各管稀释后的病毒液90ul，加到96孔板，第一管病毒液为9.9ul，记为101第二管记为100，依次类推，第8管为10-6；96孔板37℃，5%CO2培养48小时，然后加入新鲜培养液100ul继续培养24小时，再更换正常培养液150ul；96小时后观察各孔荧光。随病毒稀释倍数增加，荧光细胞数减少。计数最后两个孔的荧光细胞数。用得到的细胞数除以相应的病毒稀释倍数即为病毒原液的滴度值。

[0042] 将293T细胞铺板于10cm培养皿，24h内转染病毒的三种质粒，细胞密度在80%左右。15ug PlVX-LC3-IRES-ZsGreen1质粒，delta8.9质粒和6ug VSVG将9ug质粒加入到1.5ml Opti-MEM减血清培养基；同时将18ul Lipofectamine2000加入到1.5ml Opti-MEM减血清培养基，然后将两者混合静置20min后滴入细胞培养皿。分别在转染后的24h、48h收集病毒上清，1000r/min，离心3min去除死细胞，后经0.45um滤器过滤。将病毒上清置于超速离心管内，4℃,25000×g超速离心120min。10%FBS重悬病毒沉淀，4℃冰箱保存。同时，转染空载pLVX-IRES-ZsGreen1，VSVG和delta8.9至293T细胞，收集病毒浓缩后做阴性对照。

[0043] 病毒转染及共聚焦显微镜观察

[0044] 将病毒浓缩液加入诱导分化第五天的成熟3T3-L1脂肪细胞，MOI=50，同时加入Polybrene（终浓度为8mg/L）。病毒作用48h后，换正常培养液，加药处理前用0.2%BSA-DMEM孵育12h。从病毒加入细胞开始，到共聚焦显微镜下观察前共作用96h。如果共聚焦显微镜下观察，病毒感染效率不高，其间可再加一次病毒浓缩液。

[0045] 电镜观察自噬体

[0046] 将细胞接种到75mm细胞培养瓶中，诱导分化，到诱导分化第5天，细胞内出现小的脂滴，开始进行各种处理。药物作用所需时间后，用37℃温PBS轻轻洗细胞3次，然后加入2%戊二醛固定液固定，送电镜室观察。

[0047] 自噬的一个特点是它的动态调节，基础状态下细胞内自噬处于低水平，但在各种激动剂刺激下其活性可明显增加。在培养的细胞或活组织内，最常见的诱导自噬的方法是营养剥夺。此外，其他的刺激也会引起自噬，如应激、激素刺激、药物刺激（雷帕霉素等）等。自噬在某些疾病中也可以被抑制，如肿瘤、神经变性疾病、感染性疾病等。既然自噬与多种病例生理过程密切相关，建立一套科学的监测自噬的方法就显得尤为重要。

[0048] 自噬现象首先是通过电子显微镜发现的。自噬是一个动态和连续的过程，先形成自噬小体，后与溶酶体融合，逐渐降解胞内成分。在超微结构，自噬小体被定义为；含有未被消化的细胞质成分的双膜结构，且未与溶酶体结合。双膜结构包裹的细胞质成分包括线粒体，内质网碎片等，由于这一阶段自噬体的结构特点明显，很容易通过电镜观察鉴定自噬体的存在。与自噬小体相比，自噬溶酶体的观察相对难一些。自噬溶酶体是由自噬小体和溶酶体形成的混合细胞器，它由不完整的双膜结构，其内包裹着处于不同降解阶段的细胞质成分。早期可以观察到细胞器成分，但在降解晚期就很难辨别自噬溶酶体内的成分了。因此，降解晚期很难区分自噬溶酶体和内吞作用形成的小囊泡或其他来源的液泡。即使这样，在大多数病理和生理情况下，我们仍然可以通过检测早期和晚期自噬体结构的产生来反应整个细胞所处的自噬状态。成熟脂肪细胞由于其特殊的结构，胞内充满大量脂滴，使细胞器和核向周边移位，电镜下难以看到典型的自噬体。但我们经过多次实验，不断改进实验条件，终于成功的在成熟的3T3-L1脂肪细胞内观察到处于各个自噬阶段的自噬结构，为以后