用于棉花种子鉴定的引物和试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于棉花种子鉴定的引物组及其试剂盒，其包括60对核心引物，本发明的核心引物组为棉花品种的生产鉴别提供了有力工具，具有快速、准确等优点，也为今后生产中发生的假冒伪劣、套牌冒牌等坑农害农事件的发生提供了强有力的鉴别工具，为当地种子管理部门处理问题种子纠纷提供了可靠方法和技术保证，极大地保护了棉花育种者、种子生产经营单位和广大棉农的生产利益。通过本套核心标记进行品种的指纹图谱进行鉴定，无需再进行分子标记的大量筛选，节约成本和时间，达到事半功倍的效果。

权利要求

1.一种鉴定棉花品种的方法，其特征在于包括如下步骤： 待测样品棉花总DNA提取与纯化；

测定棉花总DNA纯度和浓度的；

采用引物组中的引物分别对棉花总DNA进行PCR扩增反应； 对扩增产物同时进行凝胶电泳，并获取凝胶电泳图像； 将凝胶电泳图像与标准谱图进行比对以确定棉花类型；棉花种子是新疆棉花种子； 所述的引物组包括以下60对引物，所述的引物组所不含有其它引物对：

2.权利要求1所述的鉴定棉花品种的方法，其特征在于所述的棉花种子是新疆陆地棉种子。

3.根据权利要求2所述的鉴定棉花品种的方法，其特征在于还包括构建新疆棉花种子标准谱图的步骤。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的鉴定棉花品种的方法，所述的鉴定是指鉴定棉花品种的纯度和/或真伪。

说明书

用于棉花种子鉴定的引物和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种鉴定棉花品种的方法，属于分子生物学技术领域。 背景技术

[0002] 棉花是纺织工业的主要原料。我国棉花年产量在500万吨左右，价值量在750亿元左右，是仅次于粮食的第二大农作物，全国有2亿多农民直接参与棉花的生产。纺织业产业链长，目前我国纤维加工量已占世界的48％。近年来，石油价格上涨推高了化纤成本，促使纺织企业提高用棉比例，棉花和化纤的比例已达到1∶1。随着全球经济的复苏，纺织品需求上升，国内棉花需求还将保持增长态势。

[0003] 新疆棉花基地的战略地位十分重要，其作用不可替代。新疆是我国最大的优质棉、商品棉生产基地和出口基地，棉花总产、单产、种植面积已连续18年稳居全国首位，棉花产量占全国总产量的40％。棉花是新疆经济支柱产业，原棉产值达到300亿元，占全疆种植业产值的65％和农林牧渔业总产值的1/3；棉花收入占全区农民收入的35％，占南疆主产区农民收入的60％；棉花加工产值占全疆工业产值的60-80％；全疆15％的财政收入、产棉县50％的财政收入来自棉花及其相关产业。“十一五”期间，新疆棉花种植面积稳定在2100万亩以上，棉花产量保持在250-300万吨。2003年以来新疆累计调出棉花1800多万吨，超出同期全国棉花进口量200多万吨；2004至2006年，我国棉花年进口增至364万吨，进口依存度由28％上升至38％；2006-2008年新疆年均调出棉花300万吨，有力地支持了我国棉纺工业的高速发展，也为保持国内棉花70％的自给率奠定了基础。假如没有新疆棉花 的支撑，我国对国际棉花市场的依存度将超过50％以上，棉花产业将重蹈大豆、油脂产业的覆辙。

[0004] 新疆棉花发展潜力大，今后在全国棉花产业中的地位更加重要。通过优化生态布局，棉花生产形成了北疆早熟棉区和南疆早中熟棉区等主产区。新品种应用，在提高单产、改善品质方面起到了决定性作用。在栽培上，新疆棉花单产提高主要依靠增加密度，靠大群体提高总铃数，实现产量突破。技术上，推广矮密早栽培技术、膜下滴灌技术、平衡施肥技术。全区棉花单产2009年已达到119公斤，比1995年增长33％，高于全国其它地区平均单产35公斤。其中，兵团平均单产达到155公斤。新疆棉花品质好、品级高，平均纱支达到36支，比全国平均纱支水平高4支。

[0005] 近年来，随着新疆棉花生产的快速发展，病虫害日危害加重。新疆棉花生产要求选育适合当地棉花生产发展，适应市场需求的丰产潜力大、稳产性好、适应性强的新品种。品种研发滞后，影响棉花核心竞争力提高。进一步拓宽遗传基础，加强产量和抗性育种，选育不同纤维类型的高品质棉花新品种、实现纤维类型生产多元化有重要意义。 [0006] 目前新疆棉花每年的用种需求量巨大，每年达10万吨以上。在如此巨大的用种量需求下，生产中假劣伪冒、套牌贴牌种子时有发生，常给育种家、种子企业和棉农带来巨大损失，同时这种混乱的局面也不利于种子管理部门的监管，为保证新疆棉花生产的正常发展和种子市场的规范管理，建立一套行之有效、简单快速检测技术显得尤为必要。 [0007] DNA指纹图谱技术快速发展，为品种鉴定、纯度检测、品种亲缘关系与分类研究及品种专利权的正当维护等提供了很好的解决途径。DNA指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱，它是建立在DNA分子标记的基础之上的。这种电泳图谱多态性丰富，具有高度的个体特异性和环境稳定性，就象人的指纹一样，因而被称为“指纹图谱”。指纹图谱是鉴别品种、品系(含杂交亲本、自交系)的有力工具，具有快速、准确等优 点。因此指纹图谱技术非常适合于品种资源的鉴定工作。该技术已在各种作物品种资源和纯度鉴定研究中得到应用，并发挥着越来越重要的作用。正是在这样的市场环境大背景下，开展新疆棉花品种指纹图谱技术的建立与应用对解决上述问题具有重要作用。

[0008] DNA指纹图谱技术现状

[0009] 众所周知，作物品种资源作为国家的重要战略资源之一，它是作物高产稳产的重要基础，在未来的生命科学和农业科学研究领域中将占据越来越重要的地位(Tanksley and McCouch，1997)。目前，我国种子生产和经营单位管理还不太规范，不合格种子，甚至假种屡屡混入市场并用于生产，造成粮食减产，同时也极大地损害了品种专利拥有者的利益和农民的经济利益，因此进行品种资源鉴定显得尤为重要。早期，人们多采用形态学方法对品种进行识别，即植物的外部特征特性，如株高、穗长、粒色、干粒重等。该方法简便、经济，但是由于许多形态学性状鉴定周期长、受环境影响大(刘勋甲等，1998，湖北农业科学，(1)：33-35；(3)：27-32；梁明山等，2001)，并且随着育种亲本的利用集中化，品种鉴定愈来愈困难，传统的形态学方法已越来越不适应品种鉴定和纯度分析的需要。

[0010] 近年来，随着生物技术的不断发展，诞生了一系列DNA分子标记技术，如限制性片段长度多态性(restfiction fragment length polymorphism，简称RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，简称RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，简称AFLP)、简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，简称SSLP)、随机扩增微卫星多态性(random amplified micro-satellite polymorphism，简称RAMP)、序列标签位点(sequence-tagged sites，简称STS)、DNA扩增指纹(DNA amplified fingerprinting，DAF)、扩增子长度多态性(amplicon length polymorphism，简称ALP)、特异扩增子多态性(specific ampiliconpolymorphism，简称SAP)、单链构象多态性 (singlestrand conformation polymorphi sm，简称SSCP)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，简称SNPs)等(李梅芳和周开达，2001；邹喻苹和葛颂，2003；王忠华，2005)。

[0011] 与上述形态标记相比，DNA分子标记具有以下多种优点：(1)直接以遗传物质DNA的形式表现，在生物体的不同组织和发育时期均可检测到，受季节和环境的影响较少；(2)数量多、分布广，遍及整个基因组；(3)多态性高，自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；(4)表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；(5)有许多分子标记表现为共显性(codominance)，能够鉴别出作物品种或品系的纯合基因型与杂合基因型，为育种利用提供极大的便利(贾继增，1996)。遗传标记主要分为：形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记等四品种型。

[0012] 形态标记形态标记是一种外部形态特征，如矮秆、变态叶、雄性不育等。从形态学或表型性状来检测遗传变异是最直接也最简便易行的方法。广义形态标记包括色素、生理特性、生殖特性抗病虫性等有关的标记。由于表型和基因型之间存在着基因表达、调控、个体发育等复杂的中间环节，如何根据表型上的差异来反映基因型上的差异就成为形态学方法检测遗传变异的关键所在。棉花中通常所用的表型性状包括株高、子叶节高、主茎茸毛、果枝数、株型、铃形、叶形、铃的大小、叶片裂缺等。形态标记缺点是数量较少，遗传表达有时不太稳定，易受环境条件及基因显隐性的影响。

[0013] 细胞学标记细胞遗传学研究发现，染色体核型(染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等)和带型(C带、N带、G带等)分析可测定基因所在的染色体及相对位置，也可通过染色体置换等进行基因的定位。染色体数目的变化(如单体、缺体、三体、四体)和染色体结构的变异(如缺失、易位、倒位、重复等)也都各有其特定的细胞学特征，也可作为一种细胞标 记。显然，细胞学标记的数目也很有限。对于染色体数目相同的物种，用细胞学标记很难区别。

[0014] 生化标记生化标记也叫蛋白质标记，主要包括等位酶和同工酶标记。这品种型标记不易受环境影响，能很好的反映遗传多样性。但其检测手段复杂，数量有限，不能满足标记辅助选择的需要。

[0015] 分子标记20世纪80年代以后发展起来的分子标记技术是以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记具有遗传多态性高、共显性，信息完整、在基因组中大量存在且均匀分布、选择中性、稳定性、重现性好、信息量大，分析效率高、检测手段简单快捷、开发和使用成本低等特点。因此，分子标记技术自出现以来被广泛应用在作物遗传育种、植物亲缘关系鉴别、物种起源演化、遗传多样性分析、基因组作图、基因定位、基因库构建等方面。现在DNA标记技术已有数十种，而且技术本身也被不断的改进和发展。

[0016] 根据分子标记产生的特点，通常可以将之分为五类。

[0017] 第一类：以Southern杂交技术为基础，如限制性片段长度多态性(RFLP)。 [0018] 第二类：以PCR技术为基础，如随机扩增多态性DNA(RAPD)、序列标签位点(STS)、表达序列标签(EST)、序列特征扩增片段(SCAR)、酶切扩增多态性(CAP)、扩增片段长度多态性(AFLP)。

[0019] 第三类：以重复序列为基础，如简单序列重复(SSR)、简单序列间重复(ISSR)、单核苷酸多态性(SNP)。

[0020] 第四类：以单链构象多态性为基础，如单链物质多态性(SSCP)。

[0021] 第五类：原位杂交技术(ISH)，包括荧光原位杂交(FISH)、原位杂交(GISH)等。 [0022] 本发明技术应用情况

[0023] SSR(simple sequence repeat)，简单序列重复，又称微卫星DNA (microsatellite DNA)，是近几年在PCR基础上发展起来的第二代分子标记。SSR是一种真核生物基因组中普遍存在的重复序列，重复序列一般由1-6个碱基组成，重复次数在不同物种或同一物种不同基因型之间是高度可变的。这些重复序列两端大多是保守的单拷贝序列，因此可以根据保守序列设计特异引物，通过PCR技术将中间的核心重复序列扩增出来，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术可获得其长度多态性(张立荣等，2002)。SSR具有RFLP的所有遗传学优点，且避免了RFLP技术中的使用放射性同位素的缺点，又比RAPD的重复性和稳定性高，因而目前已成为遗传标记中的研究热点。

[0024] 但是，如何获得合适的引物组，既能提到种子鉴定的能力，又不过多的增加工作量是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

[0025] 本发明针对现有鉴定方法周期长，为棉花品种的生产鉴别提供了有力工具，本发明采用如下的技术方案：

[0026] 本发明一方面涉及一种鉴定棉花品种的方法，其特征在于包括如下步骤： [0027] 待测样品棉花总DNA提取与纯化；

[0028] 测定棉花总DNA纯度和浓度的；

[0029] 采用引物组中的引物分别对棉花总DNA进行PCR扩增反应；

[0030] 对扩增产物同时进行凝胶电泳，并获取凝胶电泳图像；

[0031] 将凝胶电泳图像与标准谱图进行比对以确定棉花类型。

[0032] 所述的引物组包括以下60对引物：

[0033]

[0034]

[0035]

[0036]

[0037] 在一个优选的实施方式中，所述的引物组所包括的其它引物不超过15对，优选的不超过10对，进一步优选的不超过5对，更进一步的优选不含有其它引物对。 [0038] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的棉花种子优选是新疆棉花种子。 [0039] 在本发明的一个优选实施方式中，还包括采用上述步骤构建新疆棉花种子的标准谱图。

[0040] 本发明的方法为棉花品种的生产鉴别提供了有力工具，具有快速、准确等优点，也为今后生产中发生的假冒伪劣、套牌冒牌等坑农害农事件的发生提供了强有力的鉴别工具，为当地种子管理部门处理问题种子纠纷提 供了可靠方法和技术保证，极大地保护了棉花育种者、种子生产经营单位和广大棉农的生产利益。一旦发生假冒种子生产纠纷问题，无论是种子管理部门、生产单位、经营单位或农户都可以通过本发明技术建立的60对SSR核心标记进行快速准确的鉴别，达到生产应用的目的。另外生产上新审定品种也可以通过本套核心标记进行品种的指纹图谱保护，无需再进行分子标记的大量筛选，节约成本和时间，达到事半功倍的效果。

附图说明

[0041] 图片说明：图1-5是棉花品种的指纹图谱：N47和N48分别代表新陆中47和48号，N0代表品种军棉1号，B19代表品种新陆早19号。图1代表品种新陆中47号的指纹图谱，其中第1条(最左侧)带为D2000 DNA Ladder Marker(D2000 plus DNA Ladder是由单独制备的PCR产物混合而成，共有8条DNA片段，为便于电泳后观察，特异性加强750bp条带，其浓度约为100ng/5μl，其它条带的DNA浓度约为50ng/5μl。第2-49条带引物顺序分别为见表1：

[0042] 表1

[0043]

[0044]

[0045] 图2-4依次类推。由于本发明技术所用引物为60对，因此在一张图片上难以完全反应出来(只能有48对)，因此剩余的12对引物在图5上显示，图2上共有四个品种，分别为新陆中47号、新陆中48号、军棉1号和新陆早19号，每个品种的都有12对引物。引物顺序为如表2所示。所有图片信息均以此引物顺序进行指纹扩增。

[0046] 表2

[0047]

[0048]

具体实施方式

[0049] 收集新疆陆地棉栽培种数量共计4个(截止到2010年自育审定的品种)，品种包括新陆中47，48号、军棉1号、新陆早19号。品种来源于各品种选育单位，育种家及巴州种质资源保存库。

[0050] 实验方法

[0051] 棉花DNA提取液准备工作

[0052] (1)10M Hcl溶液(瓶装分析纯浓盐酸即为10M)

[0053] (2)10M NaOH溶液100ml 40.0×10×0.1＝40(g)

[0054] (3)3M NaAc溶液50ml 82.03×3×0.05＝12.3045(g)无水NaAc PH5.2

[0055] (4)1.0M Tris-Hcl溶液500ml(用10M Hcl调PH至8.0)121.14×1.0×0.5＝60.57(g)

[0056] (5)0.5M EDTA 溶 液 50ml( 注： 难 溶 )372.24×0.5×0.05 ＝ 9.306(g)，9.306gEDTA-Na2溶于蒸馏水中，用10M NaOH调PH至8.0，定容至50ml，灭菌室温保存。 [0057] (6)TE缓冲液(PH8.0)：1.0M Tris-Hcl溶液2.5ml和0.5M EDTA溶液0.5ml蒸馏水定容至250ml，定容后灭菌保存。

[0058] (7)氯仿∶异戊醇＝24∶1溶液配制200ml∶192ml氯仿+8ml异戊醇

[0059] (8)70％或75％酒精配制。

[0060] (9)DNA提取液配置见表2

[0061] 表3棉花DNA提取液配方(50ml)

[0062] Table 1 Nuclear extraction solution component(50ml)

[0063]

[0064] 棉花总DNA提取与纯化

[0065] 采用CTAB法提取棉花基因组DNA，即小量法DNA提取。

[0066] (1)加入2％的β-疏基乙醇于CTAB提取液中，充分摇匀置于65℃的水中预热。 [0067] (2)采集0.5-1g叶片，立即放入冰冻过的2ml离心管中，加入液氮，快速研磨成粉末状，加600ul预热的CTAB提取液中，迅速用力上下颠倒混匀，65℃水浴30分钟(从最后一个样放入后计时)，期间缓慢颠倒2-3次。

[0068] (3)取出离心管，加入等体积(600ul)的氯仿一异戊醇(24∶1)，盖上 盖子后，缓慢上下颠倒离心管10分钟后，用氯仿一异戊醇(24∶1)平衡离心管，8000rp/m 20℃，离心15min。

[0069] (4)取上清，于1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿一异戊醇(24∶1)，缓慢上下颠倒离心管10分钟后，用氯仿一异戊醇(24∶1)平衡离心管，10000rp/m20℃，离心10min。 [0070] (5)取上清，加0.60(0.3ml)倍体积-20℃预冷的异丙醇，缓慢颠倒离心管10次以上(DNA呈絮状沉淀)，静置于-20℃冰箱30min以上。

[0071] (6)静置好后，12000rpm离心7min；倾去上清，用70％酒精清洗2-3遍，无水乙醇洗一次，超净工作台上风吹30min。

[0072] (7)加入200μlTE，过夜溶解。

[0073] DNA的纯化步骤：

[0074] (8)加入5μl(1∶100体积)的RNA酶(10g(l)，37℃水浴1小时。

[0075] (9)加入等体积的氯仿一异戊醇(24∶1)，缓慢颠倒离心管30-50次，13000rp/m，离心10min。

[0076] (10)取上清，加0.1倍体积的3mol/l的NaAc(pH＝5.4)，混匀后，缓慢加入2倍体积的冰冷无水乙醇，静止5min后，絮状沉淀钩出，转到1.5ml的离心管中。 [0077] (11)加入70％和100％的酒精各洗一次，风干。

[0078] (12)溶于200ul的TE溶液中，置于-20℃的冰箱中保存备用。

[0079] 棉花总DNA纯度和浓度的测定

[0080] 使用由基因公司生产的Nanodrop-ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计检测DNA纯度和浓度。读取A260和A280吸光值。DNA浓度(ng/pl)＝稀释倍数×50×A260，可根据A260/A280来判断DNA纯度，比值若在1.6-2.0，证明DNA纯度较好。大于2.0，证明RNA污染；小于1.6，证明蛋白质、酚等污染，检测结果良好，用于后续试验。 [0081] 以北京天根100bp DNA Ladder作对照，通过1％琼脂糖凝胶电泳将进一 步确定其浓度和纯度，同时检测DNA的完整性。

[0082] DNA母液稀释：根据母液浓度，用ddH2O逐一将母液稀释为20ng/ul工作液，混匀后用于PCR扩增。

[0083] PCR扩增反应

[0084] (1)引物来源

[0085] 根据前人(Xiao，2009)文献资料，筛选均匀分布棉花26条染色体的SSR标记，遗传图谱大小约4140cM，以每5cM大小为间距选择已定位于染色体的SSR标记共计806对，引物类型丰富，包括BNL、CER、CIR、COT、CGR、DPL、DC、GH、JESPR、SHIN、TMB、HAU、NAU等13大类的引物，引物序列等信息均来自 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/和http://www.cottondb.org)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

[0086] (2)所用试剂

[0087] 反应所用Tag酶、dNTP、10×PCR buffer、PAGE胶Maker购自北京天根生化科技有限公司，Acr(丙烯酰胺)、Bis-Acr(甲叉丙烯酰胺)、PVP40、DNA Ladder、TEMED购自绿生源科技有限公司，AgNO3、NaOH、Na2CO3等其他常规试剂由北京双环化学试剂厂生产。 [0088] (3)主要仪器

[0089] PCR仪：BIOMETRA-TGRADIENT、GeneAmp PCR Systen 9700；Eppendorf高速冷冻离心机；北京市六一仪器公司生产DYY-6C型电泳系统(电泳仪和电泳槽)；摇床等。 [0090] (4)PCR反应体系与扩增程序(见表4表5)

[0091] 表4 PCR反应体系

[0092]

[0093]

[0094] 表5 PCR扩增程序

[0095]

[0096] 电泳溶液配制

[0097] 本实验电泳所用凝胶为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，具体配法如下： [0098] (1)8％PAGE胶：丙烯酰胺(Acrylamide)Acr 39g，Bis-Acr 1g，5×TEB100ml，加蒸馏水至500ml，过滤40℃保存。

[0099] (2)10％过硫酸铵(AP)：1gAP，去离子水定容至10ml。溶解后-20℃保 存。 [0100] (3)上样缓冲液：0.25g溴酚蓝+0.25g二甲苯氰+40g蔗糖，去离子水定容至100ml。

[0101] (4)5×TBE：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA(PH：8.0)3.72g，去离子水定容至1000ml。

[0102] 使用时稀释10倍(5倍)

[0103] (5)AgNO3溶液：0.5g AgNO3+750ul甲醛+500ml水

[0104] 凝胶制备及电泳过程

[0105] (1)用清水将玻璃板、胶条和梳子浸泡并用纱布反复擦洗干净，然后用清水和蒸馏水冲洗，自然晾干备用。

[0106] (2)取出已洗净的玻璃板，按要求组装，并用已配置的8％PAGE凝胶(约10ml每槽)封底，待胶凝固底封好后，将其固定在电泳槽上。

[0107] (3)在锥形瓶或烧杯中倒入已配置好的8％PAGE迅速加入AP和TEMED配制凝胶(聚丙烯酰胺变性胶配制：8％PAGE非变性胶配制20ml+10％过硫酸胺400ul+TEMED30ul)，并迅速灌胶，灌胶时避免出现气泡，灌满后插上梳子。放置15-20min，准备电泳。 [0108] (4)电泳前要在PCR扩增产物中加入2μl上样缓冲液。拔掉梳子，将电泳缓冲液(1×TBE)分别加入正极电泳槽和负极电泳槽中。缓冲液一定要超过短玻璃板上沿。清除胶面沉积的碎胶和气泡，每个点样孔加4μl样品，在180V恒电压下电泳70-80min，等蓝色指示剂刚刚跑出胶即可停止。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，清除玻璃板周围残胶，并对胶片进行标记，缓慢导入银染液中轻微摇晃。

[0109] 快速银染法

[0110] (1)用AgNO3染色15min-20min，银染时需加盖避光；

[0111] (2)用蒸馏水(或去离子水)漂洗20秒；

[0112] (3)显影：500ml水中加10gNaOH+0.3g Na2CO3+750ul甲醛，直至有 条带出现(约10-15min)；

[0113] (4)倒掉显色液，用蒸馏水(或去离子水)轻轻漂洗水洗2-3次。

[0114] (5)将保鲜膜平铺桌面，把显影胶片放置在薄膜上，放置平整后将胶另一面用薄膜对折包好，做好标记后，即可放置在灯箱上统计带型和照相。(该胶可以保存放置一段时间)

[0115] 结果分析：

[0116] 从图1-5中显示的结果可以看出，每个品种的图像中都有一个些特征的条带，通过比对这些条带，就可以确定待测品种的真伪和品种。采用本发明的方法对其它棉花品种进行鉴定，也能得出相似的结果。

[0117] 应当理解的是，上述具体实施方式仅是例举性说明，而不是对本发明的限制，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。