一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法

摘要

本发明涉及一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，包括：（1）引物合成；（2）草菇菌丝培养；（3）确定单核菌株的交配型基因类型；（4）草菇杂交试验；（5）PCR扩增判断。本发明与常规形态学检测、拮抗试验和出菇试验等方法相比，具有操作简便，检测时间短，准确性高的优点，可以利用交配型基因的分子标记筛选杂交菌株，有利于草菇杂交育种工作的开展，从而加快草菇新品种的研发工作，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，包括：

（1）比较草菇单孢分离菌株交配型A位点的基因序列，分析序列的保守性，针对草菇不同的单孢分离株分别设计特异性引物并合成；其中，草菇单孢分离菌株交配型为A1或A2，A位点的基因序列分别如SEQ ID No.1所示或如SEQ ID No.2所示；

A1对应的特异性引物为A1F：AGGGCATTCCAACCTATTCGCTTTC；A1R：AATGTGAACAGTTTGAGCGGAGT；

A2对应的特异性引物为A2F：CACTATCTCCTTGCGTTTGTTATG；A2R：ATAACCAAACGCCAGAAACACTA；

（2）将上述草菇单孢菌株接种于PDA平板培养基，32～34℃培养；挑取草菇菌丝，利用试剂盒检测菌株交配型基因类型；

（3）把上述已确定交配型基因类型的草菇单孢菌株分别接种PDA平板培养基上，32～

34℃下培养5～7d，在菌丝生长的部位打孔，把不同的单孢菌株两两接种在PDA平板培养基上，相距1厘米，32～34℃培养，两个菌落相交时，分别从两个菌落的外侧挑取菌块转移到PDA试管培养基上，32～34℃培养，3次继代培养；

（4）采用步骤（1）中的交配型基因的特异性引物对草菇杂交获得的菌株进行PCR扩增，草菇杂交菌株能扩增出针对两个母本的交配型基因的两条条带，单孢菌株只能扩增出一条条带，即可筛选出草菇杂交菌株。

2.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（2）和（3）中的PDA平板培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

3.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的试剂盒为Phire Plant Direct PCR Kit试剂盒。

4.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的PDA试管培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

5.根据权利要求1所述的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的PCR扩增反应条件为：

扩增 体系 :2×PCR buffer10μL，Phire Hot Start II DNA Polymerase0.4μL，

10μmol/L草菇菌株检测专用引物对各1μL，菌丝体稀释液0.5μL，ddH2O7.1μL；PCR反应条件：98℃2min；98℃5s，67℃5s，72℃20s，40个循环；72℃10min。

说明书

一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法

技术领域

[0001] 本发明属于筛选草菇杂交菌株领域，特别涉及一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法。

背景技术

[0002] 草菇（Volvariella volvacea）栽培起源于中国，迄今已有300多年的栽培历史，在我国南方地区广泛栽培。草菇味道鲜美，不仅具有丰富的营养价值，而且还具有重要的医疗保健作用，深受广大消费者喜爱。草菇作为一种高温栽培食用菌，同其它食用菌相比，其显著的特点是生长速度极快，从播种到收获一般只需要2周的时间，其年产量在我国食用菌产业中一直位居前十位。

[0003] 在经典遗传学研究中，草菇是食用菌中唯一的被认定为属于初级同宗结合繁殖模式的担子菌，但是目前对草菇的遗传学研究特别是繁殖模式的研究仍旧存在着很多争议，这些基础理论研究的不足制约了草菇杂交育种工作的开展，为草菇新品种的选育带来了很多困难，从而极大地限制了草菇栽培业的发展。

[0004] 草菇菌丝不具有锁状联合，缺乏筛选杂交菌株的方法，因此迫切需要开发有效的草菇杂交菌株筛选方法，以利于草菇新品种的选育。近年来对草菇交配型基因的研究以及对草菇基因组进行测序，已经获得多个草菇菌株的交配型A位点的基因序列，使利用交配型基因的分子标记快速筛选草菇杂交菌株成为可能。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，该方法与常规形态学检测、拮抗试验和出菇试验等方法相比，具有操作简便，检测时间短，准确性高的优点，可以利用交配型基因的分子标记筛选杂交菌株，有利于草菇杂交育种工作的开展，从而加快草菇新品种的研发工作，具有良好的应用前景。

[0006] 本发明的一种分子标记快速筛选草菇杂交菌株的方法，包括：

[0007] （1）比较草菇单孢分离菌株交配型A位点的基因序列，分析序列的保守性，针对草菇不同的单孢分离株分别设计特异性引物并合成；

[0008] （2）将上述草菇单孢菌株接种于PDA平板培养基，32~34℃培养；挑取草菇菌丝，利用试剂盒检测菌株交配型基因类型；

[0009] （3）把上述已确定交配型基因类型的草菇单孢菌株分别接种PDA平板培养基上，32~34℃下培养5~7d，在菌丝生长的部位打孔，把不同的单孢菌株两两接种在PDA平板培养基上，相距1厘米，32~34℃培养，两个菌落相交时，分别从两个菌落的外侧挑取菌块转移到PDA试管培养基上，32~34℃培养，3次继代培养；

[0010] （4）采用步骤（1）中的交配型基因的特异性引物对草菇杂交获得的菌株进行PCR扩增，草菇杂交菌株能扩增出针对两个母本的交配型基因的两条条带，单孢菌株只能扩增出一条条带，即可筛选出草菇杂交菌株。

[0011] 所述步骤（1）中的草菇单核菌株A1交配型A位点的基因序列如SEQ ID No.1所示；草菇单核菌株A2交配型A位点的基因序列如SEQ ID No.2所示。

[0012] 所述A1对应的特异性引物为A1F：AGGGCATTCCAACCTATTCGCTTTC；

[0013] A1R：AATGTGAACAGTTTGAGCGGAGT。

[0014] 所述A2对应的特异性引物为A2F：CACTATCTCCTTGCGTTTGTTATG；

[0015] A2R：ATAACCAAACGCCAGAAACACTA。

[0016] 所述步骤（2）和（3）中的PDA平板培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

[0017] 所述步骤（2）中的试剂盒为Phire Plant Direct PCR Kit试剂盒。

[0018] 所述步骤（3）中的PDA试管培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

[0019] 所述步骤（4）中的PCR扩增反应条件为：

[0020] 扩 增 体 系 (20μL):2×PCR buffer 10μL，Phire Hot Start II DNA Polymerase0.4μL，10μmol/L草菇菌株检测专用引物对各1μL，菌丝体稀释液0.5μL，ddH2O7.1μL；PCR反应条件：98℃2min；98℃5s，67℃5s，72℃20s，40个循环；72℃10min。

[0021] 本发明通过比较草菇单孢分离菌株交配型A位点的基因序列，分析序列的保守性，设计特异性引物，分别对草菇单孢分离菌株进行PCR扩增，根据扩增结果把单孢菌株进行分类，把具有不同交配型基因的单核菌株两两配对，利用交配型基因为分子标记的快速筛选杂交菌株，杂交菌株同时扩增出两条条带，分别对应于两个母本的交配型基因，而单孢分离菌株只能扩增出一条条带，建立以交配型基因为分子标记的快速筛选杂交菌株的分子生物学方法。

[0022] 有益效果

[0023] 本发明与常规形态学检测、拮抗试验和出菇试验等方法相比，具有操作简便，检测时间短，准确性高的优点，可以利用交配型基因的分子标记筛选杂交菌株，有利于草菇杂交育种工作的开展，从而加快草菇新品种的研发工作，具有良好的应用前景。

附图说明

[0024] 图1为本发明草菇菌株特异条带扩增图；其中，M为Marker；1为草菇单孢菌株1；2

[0025] 为草菇单孢菌株1和2的杂交菌株；3为草菇单孢菌株2。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0027] 实施例1

[0028] （1）引物合成

[0029] 针对草菇单核菌株A1交配型A位点的基因序列设计特异性引物为A1F：

[0030] AGGGCATTCCAACCTATTCGCTTTC；

[0031] A1R：AATGTGAACAGTTTGAGCGGAGT。

[0032] （2）草菇菌丝培养

[0033] 草菇单孢菌株接种于PDA平板培养基，32℃培养；PDA平板培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

[0034] （3）确定单核菌株的交配型基因类型

[0035] 挑取草菇菌丝，利用Phire Plant Direct PCR Kit（FINNZYMES）试剂盒直接检测菌株交配型基因类型。

[0036] （4）草菇杂交试验

[0037] 把已确定交配型基因类型的草菇单孢菌株分别接种PDA平板培养基上，32℃培养5d，用打孔器在菌丝生长的部位打孔，把不同的单孢菌株两两接种在PDA平板培养基上，两个菌块相距1厘米，32℃培养，两个菌落相交时，分别从两个菌落的外侧挑取菌块转移到PDA试管培养基上，32℃培养，3次继代培养；PDA试管培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

[0038] （5）草菇杂交菌株筛选

[0039] 挑取继代培养的菌丝，利用Phire Plant Direct PCR Kit（FINNZYMES）试剂盒直接检测菌丝交配型基因类型，同时具有母本两种交配型基因的菌株为杂交菌株。

[0040] （6）PCR扩增

[0041] 采用交配型基因的特异性引物对草菇杂交获得的菌株进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：扩增体系(20μL):2×PCR buffer 10μL，Phire Hot Start II DNA Polymerase0.4μL，10μmol/L草菇菌株检测专用引物对各1μL，菌丝体稀释液0.5μL，ddH2O7.1μL；PCR反应条件：98℃2min；98℃5s，67℃5s，72℃20s，40个循环；72℃10min。草菇杂交菌株能扩增出针对两个母本的交配型基因的两条条带，单孢菌株只能扩增出一条条带，如图1所示。

[0042] 实施例2

[0043] （1）引物合成

[0044] 针对草菇单核菌株A2交配型A位点的基因序列设计特异性引物为A2F：CACTATCTCCTTGCGTTTGTTATG；

[0045] A2R：ATAACCAAACGCCAGAAACACTA。

[0046] （2）草菇菌丝培养

[0047] 草菇单孢菌株接种于PDA平板培养基，32℃培养；PDA平板培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

[0048] （3）确定单核菌株的交配型基因类型

[0049] 挑取草菇菌丝，利用Phire Plant Direct PCR Kit（FINNZYMES）试剂盒直接检测菌株交配型基因类型。

[0050] （4）草菇杂交试验

[0051] 把已确定交配型基因类型的草菇单孢菌株分别接种PDA平板培养基上，32℃培养5d，用打孔器在菌丝生长的部位打孔，把不同的单孢菌株两两接种在PDA平板培养基上，两个菌块相距1厘米，32℃培养，两个菌落相交时，分别从两个菌落的外侧挑取菌块转移到PDA试管培养基上，32℃培养，3次继代培养；PDA试管培养基的组成为：马铃薯200g切片煮汁滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，用水补足体积到1000mL。

[0052] （5）草菇杂交菌株筛选

[0053] 挑取继代培养的菌丝，利用Phire Plant Direct PCR Kit（FINNZYMES）试剂盒直接检测菌丝交配型基因类型，同时具有母本两种交配型基因的菌株为杂交菌株。

[0054] （6）PCR扩增

[0055] 采用交配型基因的特异性引物对草菇杂交获得的菌株进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：扩增体系(20μL):2×PCR buffer 10μL，Phire Hot Start II DNA Polymerase0.4μL，10μmol/L草菇菌株检测专用引物对各1μL，菌丝体稀释液0.5μL，ddH2O7.1μL；PCR反应条件：98℃2min；98℃5s，67℃5s，72℃20s，40个循环；72℃10min。草菇杂交菌株能扩增出针对两个母本的交配型基因的两条条带，单孢菌株只能扩增出一条条带。