一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法和应用。瘦肉精是一类β－兴奋剂的药物，而不是某一种特定的药物，此类药物具有实现促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的功能，但副作用极大，当摄入量较大时，会造成心血管系统的损坏，并可能出现严重的神经症状。本发明使用综合了纳米金和纳米硫化银优良特性的金-硫化银核壳结构纳米复合材料修饰电极，很好的固载了瘦肉精抗体，从而制备了一种成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测肉类样品中瘦肉精的无标记免疫传感器。

权利要求

1.一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤为：以玻碳电极为工作电极，在电极表面修饰Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液，再以瘦肉精抗体溶液进行修饰，最后滴涂牛血清白蛋白溶液，封闭电极表面非特异性活性位点，所述Au-Ag2S核壳纳米复合材料，Au和Ag2S的质量比为3.4 ~ 8.0 : 1，其制备步骤为：将Au-Ag-1纳米粒子离心后，重新分散在0.1 mol·L 的CTAB中，加入100 mL硫前驱体溶液，震荡1 ~ 3 min后，静置1 ~ 2 h，离心分离后，去除上清液，在50 ℃下真空干燥，制得Au-Ag2S核壳纳米复合材料。

2.如权利要求1所述的一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述Au-Ag2S核壳纳米复合材料-壳聚糖溶液，是将Au-Ag2S核壳纳米复合材料分散到壳聚糖溶液中制成，所述的壳聚糖溶液是将壳聚糖纯品加入到体积分数为1%的醋酸中制备而成，所述壳聚糖溶液中壳聚糖纯品的质量分数为0.3 ~ 0.7 %，所述Au-Ag2S核壳纳米复合材料与壳聚糖纯品的质量比为1 : 4 ~ 9。

3.如权利要求1所述的一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述的免疫传感器应用于瘦肉精的检测，其检测步骤为：（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的瘦肉精标准溶液，底液为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；

（2）工作电极修饰：将本发明所述的快速检测瘦肉精的无标记免疫传感器作为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的瘦肉精标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃ 冰箱中保存；

（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在K3[Fe(CN)6]溶液中，用方波伏安法（SWV）在–0.6 ~ 0.2 V电压范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I0，含有不同浓度的瘦肉精标准溶液的响应电流记作Ii，响应电流降低的差值为ΔI = I0-Ii，ΔI与瘦肉精标准溶液的质量浓度C 之间成线性关系，绘制ΔI －C 工作曲线；

（4）瘦肉精的检测：用待测样品代替步骤（1）中的瘦肉精标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值ΔI 和工作曲线，得到待测样品中瘦肉精的含量。

4.如权利要求1所述的一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，其特征在于所述瘦肉精选自下列之一：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布特罗、西布特罗、溴布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗。

说明书

一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种快速检测瘦肉精的无标记免疫传感器的制备方法和应用。具体是基于金－硫化银（Au-Ag2S）核壳纳米复合材料构建的快速检测瘦肉精的无标记电化学免疫传感器，属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。

背景技术

[0002] 电化学免疫传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用于临床诊断、环境分析、药物分析、食品安全检测等领域。制备性能优越的电化学免疫传感器，其最关键技术就是免疫分子的有效固定和灵敏度、重现性及持久性等性能的提高。

[0003] 金（Au）纳米粒子由于具有比表面积大、易于多种生物分子（核酸、蛋白质和生物分子等）结合、对人体无害等特点，已被大量应用于免疫传感器的研究。硫化银（Ag2S）纳米粒子是一种半导体纳米材料，由于其表面富含巯基，而易于与生物分子相结合，但Ag2S纳米粒子单独制备成核不均匀。本发明利用层层自组装技术，制备的金－硫化银（Au-Ag2S）核壳纳米粒子分布均匀，比表面积显著增加，而且更易于与生物分子相结合，因此非常有利于制备电化学生物传感器。

[0004] 瘦肉精是一类叫做β－兴奋剂（β-agonist）的药物，而不是某一种特定的药物。这类药物具有实现促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的功能，所以统称为“瘦肉精”。在我国，通常所说的瘦肉精是指克伦特罗（Clenbuterol），而普通消费者则把此类药物统称为瘦肉精。当它们以超过治疗剂量5－10倍的用量用于畜禽饲养时，即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积和脂肪分解，抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此曾被用作牛、羊、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。

[0005] 根据国务院食品安全委员会办公室《“瘦肉精”专项整治方案》（食安办〔2011〕14号）规定的“瘦肉精”品种目录为16种，包括：莱克多巴胺（Ractopamine）；克伦特罗（Clenbuterol）；沙丁胺醇（Salbutamol）；硫酸沙丁胺醇（Salbutamol Sulfate）；盐酸多巴胺（Dopamine Hydrochloride）；西马特罗（Cimaterol）；硫酸特布他林（Terbutaline Sulfate）；苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A）；班布特罗（Bambuterol）；盐酸齐帕特罗（Zilpaterol Hydrochloride）；盐酸氯丙那林（Clorprenaline Hydrochloride）；马布特罗（Mabuterol）；西布特罗（Cimbuterol）；溴布特罗（Brombuterol）；酒石酸阿福特罗（Arformoterol Tartrate）；富马酸福莫特罗（Formoterol Fumatrate）。

[0006] 瘦肉精可以提高猪的瘦肉率，带来更多经济价值，但它有很危险的副作用，当摄入量较大时，会造成心血管系统的损坏，并可能出现严重的神经症状。针对瘦肉精中毒事件频发这一严重现象，2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止食品动物禁止使用β－兴奋剂类药物作为饲料添加剂（农业部176号、193号公告、1519号条例）。

[0007] 检测瘦肉精的方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱－质谱法（GC-MS）和酶联免疫法（ELISA）。这些方法，虽具有一定的灵敏度，但存在如下问题，限制了这些方法在实际应用中的推广：

[0008] 1. 高效液相色谱法（HPLC）：优点是适合检测热不稳定和强极性的β－兴奋剂及其代谢产物，专属性好、选择性强、检测精确度较高，可与质谱（MS）等系统联用，实现分析过程的自动化，我国已将HPLC法作为检测克伦特罗残留的半确证性方法，最低检测限范围为-11 ~ 15 ng·g ；缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作，而且仪器贵重，在实际应用中受到一定的限制。

[0009] 2. 气相色谱－质谱法（GC-MS）：优点是通过把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，与HPLC法相比，该法检测灵敏度更高，假阳性率更低，我国将GC-MS法定为检测克伦特罗的确证性方法；缺点是仪器设备复杂、操作过程繁琐，对检验人员的操作技能要求很高，且不适于现场和快速检测。

[0010] 3. 酶联免疫法（ELISA）：优点是通过利用免疫学抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用，用目测法或比色法检测样品中的瘦肉精含量，因此该法选择性强、特异性好；缺点是步骤繁多，检测误差较大。

[0011] 为了解决上述问题，本发明采用以纳米复合材料构建的电化学免疫传感器检测瘦肉精。电化学免疫传感器的制备过程中，关键因素就是电极修饰材料，贵金属纳米材料和贵金属半导体纳米材料由于其具有大的比表面积、性能稳定及优良的生物相容性、导电性等特点，成为组装电化学免疫传感器的优选材料。本发明通过在纳米Au核上生成纳米Ag2S半导体壳层，制备了兼具二者特性、体现出优异的协同增敏效果的核壳结构的Au-Ag2S纳米复合材料，将其用于制备电化学免疫传感器，进一步提高了其电极表面的电子传递效率和抗体的吸附量，显著提高了检测的灵敏度。本发明设计了一种简单、快速、特异性好和灵敏度高的电化学免疫传感器和相应的电化学免疫分析方法。

发明内容

[0012] 本发明的目之一在于避免现有检测方法中存在的仪器设备复杂、操作过程繁琐及对检验人员的技能要求高等缺点，提供了一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，所制备的传感器具有灵敏度高、特异性强的特点，且制备简单、操作方便，可用于瘦肉精的快速灵敏检测；

[0013] 本发明的目的之二在于提供一种简单、特异、灵敏、快速、高效地检测猪肉、牛肉和羊肉中瘦肉精的检测方法。

[0014] 本发明采用的技术方案如下：

[0015] 1. 本发明所述的一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，其制备步骤为：以玻碳电极为工作电极，在电极表面修饰Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液，再以瘦肉精抗体溶液进行修饰，最后滴涂牛血清白蛋白溶液，封闭电极表面非特异性活性位点；

[0016] 所述Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液，Au-Ag2S核壳纳米复合材料与壳聚糖的质量比为1 : 4 ~ 9；

[0017] 所述Au-Ag2S核壳纳米复合材料，Au和Ag2S的质量比为3.4 ~ 8.0 : 1，其制备步-1骤为：将Au-Ag纳米粒子离心后，重新分散在0.1 mol·L 的CTAB中，加入100 mL硫前驱体溶液，震荡1 ~ 3 min后，静置1 ~ 2 h，离心分离后，去除上清液，在50 ℃下真空干燥，制得Au-Ag2S核壳纳米复合材料。

[0018] 所述的一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，更具体和优选的制备方法为：

[0019] （1）Au-Ag2S核壳纳米复合材料的制备：

[0020] 1）在250 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液中加入60 mL 10 mmol·L-1冰点－硼氢酸钠溶液，搅拌1h后，稀释10倍，制得纳米Au种子；

[0021] 2）在150 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液中滴加0.1 mol·L-1 抗坏血酸至无色，再加入步骤1）中的Au种子5滴，静置2 h，制得Au纳米粒子；

[0022] 3）将步骤2）中制得的Au纳米粒子离心后，重新分散在300 mL 0.1 mol·L-1的-1 -1CTAB中，依次加入30 mL 0.1 mol·L 抗坏血酸，3 ~ 7 mL 0.01 mol·L AgNO3，30 mL -1
0.1 mol·L NaOH水溶液，振荡1 min，静置1 h，制得核壳结构的Au-Ag纳米粒子；

[0023] 4）将步骤3）中制得的Au-Ag纳米粒子离心后，重新分散在300 mL 0.1 mol·L-1的CTAB中，加入100 mL硫前驱体溶液，震荡1 ~ 3 min后，静置1 ~ 2 h，离心分离后，去除上清液，50 ℃下真空干燥，制得Au-Ag2S核壳纳米复合材料，Au和Ag2S的质量比为3.4 ~8.0 : 1；

[0024] 所述氯金酸、硼氢酸钠、抗坏血酸、AgNO3和NaOH的水溶液，均使用超纯水配制；

[0025] 所述冰点－硼氢酸钠溶液，制备方法是将预装硼氢酸钠溶液的试管置于冰块中冷却3 - 4 min，取出试管制备硼氢酸钠溶液后，再将试管放入冰块中冷却一段时间；

[0026] 所述硫前驱体溶液，制备方法是将硫化钠溶液中加入硫粉，置于反应釜中80℃加热2h至硫粉全部溶解。

[0027] （2）Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液的制备：将壳聚糖加入到体积分数为1 %的醋酸中搅拌6 h，制得质量分数0.3 ~ 0.7 %的壳聚糖溶液；取3 mg Au-Ag2S核壳纳米复合材料，重新分散在4 mL壳聚糖溶液中，Au-Ag2S核壳纳米复合材料与壳聚糖的质量比为1 : 4 ~ 9。

[0028] （3）玻碳电极的处理：将直径4 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 µm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，使玻碳电极表面呈镜面。

[0029] （4）电极表面修饰：在玻碳电极表面滴涂6 μL Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液，放于4 ℃ 冰箱中，晾干成膜；超纯水清洗，再滴涂6 μL瘦肉精抗体溶液，放于4 ℃ 冰箱中，晾干成膜；超纯水清洗后，放于4 ℃ 冰箱中保存使用；

[0030] 所述瘦肉精抗体溶液，制备方法为：将瘦肉精抗体原液加入pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液定容，放于4 ℃ 冰箱中保存使用。

[0031] （5）封闭电极表面非特异性活性位点：取6 μL牛血清白蛋白溶液滴涂在（4）所制备电极表面，4 ℃ 冰箱中，晾干成膜，超纯水清洗，制得所述的快速检测瘦肉精无标记免疫传感器，放于4 ℃ 冰箱中保存使用；

[0032] 所述牛血清白蛋白溶液，制备方法为：将牛血清白蛋白原液加入pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液定容，放于4 ℃ 冰箱中保存使用。

[0033] 2. 本发明所述的一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，所述的免疫传感器应用于瘦肉精检测，其检测步骤为：

[0034] （1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的瘦肉精标准溶液，底液为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液。

[0035] （2）工作电极修饰：将本发明所述的快速检测瘦肉精无标记免疫传感器作为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的瘦肉精标准溶液分别滴涂到工作电极表面，放于4 ℃ 冰箱中保存使用。

[0036] （3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在K3[Fe(CN)6]溶液中，用方波伏安法（SWV）在 – 0.6 ~ 0.2 V电压范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I0，含有不同浓度的瘦肉精标准溶液的响应电流记作Ii，响应电流降低的差值为ΔI = I0-Ii，ΔI 与瘦肉精标准溶液的质量浓度C 之间成线性关系，绘制ΔI – C 工作曲线。

[0037] （4）瘦肉精的检测：用待测样品代替步骤（1）中的瘦肉精标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值ΔI 和工作曲线，得到待测样品中瘦肉精的含量。

[0038] 所述K3[Fe(CN)6]溶液的浓度为5 mmol·L-1。

[0039] 所述pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液的浓度为67 mmol·L-1。

[0040] 所述瘦肉精选自下列之一：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布特罗、西布特罗、溴布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗。

[0041] 本发明的有益成果

[0042] （1）本发明所述免疫传感器制备简单，操作方便，并通过纳米材料的增效和增敏作用，可实现对实际样品的快速、灵敏、高选择性检测，具有市场发展前景。

[0043] （2）本发明首次将Au-Ag2S核壳纳米复合材料应用于电化学免疫传感器的制备，所述的Au-Ag2S核壳纳米复合材料导电性强于纳米Au或纳米Ag，电信号得到更强发大；外层Ag2S增强了对生物分子的吸附和固载，显著提高了电化学免疫传感器的灵敏度、稳定性和准确性；并且该材料带有明显蓝色，可进一步应用到检测试纸中，具有更大的发展潜力。

附图说明

[0044] 图1为一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法示意图。

具体实施方式

[0045] 实施例1 一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法：

[0046] （1）玻碳电极的处理：将直径4 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 µm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，使玻碳电极表面呈镜面。

[0047] （2）Au-Ag2S核壳纳米复合材料的制备：

[0048] 1）在250 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液中加入60 mL 10 mmol·L-1冰点－硼氢酸钠溶液，搅拌1h后，稀释10倍，制得纳米Au种子；

[0049] 2）在150 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液中滴加0.1 mol·L-1 抗坏血酸至无色，再加入步骤1）中的Au种子5滴，静置2 h，制得Au纳米粒子；

[0050] 3）将步骤2）中制得的Au纳米粒子离心后，重新分散在300 mL 0.1 mol·L-1的-1 -1CTAB中，依次加入30 mL 0.1 mol·L 抗坏血酸，3 mL 0.01 mol·L AgNO3，30 mL 0.1 -1
mol·L NaOH水溶液，振荡1 min，静置1 h，制得核壳结构的Au-Ag纳米粒子；

[0051] 4）将步骤3）中制得的Au-Ag纳米粒子离心后，重新分散在300 mL 0.1 mol·L-1的CTAB中，加入100 mL硫前驱体溶液，震荡1 ~ 3 min后，静置1 ~ 2 h，离心分离后，去除上清液，50 ℃下真空干燥，制得Au-Ag2S核壳纳米复合材料，Au和Ag2S的质量比为3.4 :1；

[0052] 所述氯金酸、硼氢酸钠、抗坏血酸、AgNO3和NaOH的水溶液，均使用超纯水配制；

[0053] 所述冰点－硼氢酸钠溶液，制备方法是将预装硼氢酸钠溶液的试管置于冰块中冷却3 - 4 min，取出试管制备硼氢酸钠溶液后，再将试管放入冰块中冷却一段时间；

[0054] 所述硫前驱体溶液，制备方法是将硫化钠溶液中加入硫粉，置于反应釜中80℃加热2h至硫粉全部溶解。

[0055] （3）Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液的制备：将壳聚糖加入到体积分数为1 %的醋酸中搅拌6 h，制得质量分数0.3 %的壳聚糖溶液；取3 mg Au-Ag2S核壳纳米复合材料，重新分散在4 mL壳聚糖溶液中，Au-Ag2S核壳纳米复合材料与壳聚糖的质量比为1 :
4。

[0056] （4）瘦肉精抗体溶液的制备：将瘦肉精抗体原液加入pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液定容，放于4 ℃ 冰箱中保存使用。

[0057] （5）牛血清白蛋白溶液的制备：将牛血清白蛋白原液加入pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液定容，放于4 ℃ 冰箱中保存使用。

[0058] （6）电极表面修饰：按照图1所示步骤，在玻碳电极表面滴涂6 μL Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液，放于4 ℃ 冰箱中，晾干成膜；超纯水清洗，再滴涂6 μL瘦肉精抗体溶液，放于4 ℃ 冰箱中，晾干成膜；超纯水清洗后，放于4 ℃ 冰箱中保存使用。

[0059] （7）封闭电极表面非特异性活性位点：按照图1所示步骤，取6 μL牛血清白蛋白溶液滴涂在（6）所制备电极表面，4 ℃ 冰箱中，晾干成膜，超纯水清洗，制得所述的快速检测瘦肉精无标记免疫传感器，放于4 ℃ 冰箱中保存使用。

[0060] 实施例2 一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法：

[0061] （1）玻碳电极的处理：同实施例1。

[0062] （2）Au-Ag2S核壳纳米复合材料的制备：

[0063] 1）在250 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液中加入60 mL 10 mmol·L-1冰点－硼氢酸钠溶液，搅拌1h后，稀释10倍，制得纳米Au种子；

[0064] 2）在150 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液中滴加0.1 mol·L-1 抗坏血酸至无色，再加入步骤1）中的Au种子5滴，静置2 h，制得Au纳米粒子；

[0065] 3）将步骤2）中制得的Au纳米粒子离心后，重新分散在300 mL 0.1 mol·L-1的-1 -1CTAB中，依次加入30 mL 0.1 mol·L 抗坏血酸，5 mL 0.01 mol·L AgNO3，30 mL 0.1 -1
mol·L NaOH水溶液，振荡1 min，静置1 h，制得核壳结构的Au-Ag纳米粒子；

[0066] 4）将步骤3）中制得的Au-Ag纳米粒子离心后，重新分散在300 mL 0.1 mol·L-1的CTAB中，加入100 mL硫前驱体溶液，震荡1 ~ 3 min后，静置1 ~ 2 h，离心分离后，去除上清液，50 ℃下真空干燥，制得Au-Ag2S核壳纳米复合材料，Au和Ag2S的质量比为4.8 :1；

[0067] （3）Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液的制备：将壳聚糖加入到体积分数为1 %的醋酸中搅拌6 h，制得质量分数0.5 %的壳聚糖溶液；取3 mg Au-Ag2S核壳纳米复合材料，重新分散在4 mL壳聚糖溶液中，Au-Ag2S核壳纳米复合材料与壳聚糖的质量比为1 :
6。

[0068] （4）瘦肉精抗体溶液的制备：同实施例1。

[0069] （5）牛血清白蛋白溶液的制备：同实施例1。

[0070] （6）电极表面修饰：同实施例1。

[0071] （7）封闭电极表面非特异性活性位点：同实施例1。

[0072] 实施例3 一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法，如图1所示[0073] （1）玻碳电极的处理：同实施例1。

[0074] （2）Au-Ag2S核壳纳米复合材料的制备：

[0075] 1）在250 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液中加入60 mL 10 mmol·L-1冰点－硼氢酸钠溶液，搅拌1h后，稀释10倍，制得纳米Au种子；

[0076] 2）在150 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液中滴加0.1 mol·L-1 抗坏血酸至无色，再加入步骤1）中的Au种子5滴，静置2 h，制得Au纳米粒子；

[0077] 3）将步骤2）中制得的Au纳米粒子离心后，重新分散在300 mL 0.1 mol·L-1的-1 -1CTAB中，依次加入30 mL 0.1 mol·L 抗坏血酸，7 mL 0.01 mol·L AgNO3，30 mL 0.1 -1
mol·L NaOH水溶液，振荡1 min，静置1 h，制得核壳结构的Au-Ag纳米粒子；

[0078] 4）将步骤3）中制得的Au-Ag纳米粒子离心后，重新分散在300 mL 0.1 mol·L-1的CTAB中，加入100 mL硫前驱体溶液，震荡1 ~ 3 min后，静置1 ~ 2 h，离心分离后，去除上清液，50 ℃下真空干燥，制得Au-Ag2S核壳纳米复合材料，Au和Ag2S的质量比为8.0 :1；

[0079] （3）Au-Ag2S核壳纳米复合材料－壳聚糖溶液的制备：将壳聚糖加入到体积分数为1 %的醋酸中搅拌6 h，制得质量分数0.7 %的壳聚糖溶液；取3 mg Au-Ag2S核壳纳米复合材料，重新分散在4 mL壳聚糖溶液中，Au-Ag2S核壳纳米复合材料与壳聚糖的质量比为1 :
9。

[0080] （4）瘦肉精抗体溶液的制备：同实施例1。

[0081] （5）牛血清白蛋白溶液的制备：同实施例1。

[0082] （6）电极表面修饰：同实施例1。

[0083] （7）封闭电极表面非特异性活性位点：同实施例1。

[0084] 实施例4 上述实施例1－3所制备的免疫传感器，用于瘦肉精的检测，步骤如下：

[0085] （1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的瘦肉精标准溶液，底液为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液。

[0086] （2）工作电极修饰：将本发明所述的快速检测瘦肉精无标记免疫传感器作为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的瘦肉精标准溶液分别滴涂到工作电极表面，放于4 ℃ 冰箱中保存使用。

[0087] （3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在K3[Fe(CN)6]溶液中，用方波伏安法（SWV）在 – 0.6 ~ 0.2 V电压范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I0，含有不同浓度的瘦肉精标准溶液的响应电流记作Ii，响应电流降低的差值为ΔI = I0-Ii，ΔI 与瘦肉精标准溶液的质量浓度C 之间成线性关系，绘制ΔI – C 工作曲线。

[0088] （4）瘦肉精的检测：用待测样品代替步骤（1）中的瘦肉精标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值ΔI 和工作曲线，得到待测样品中瘦肉精的含量。

[0089] 所述K3[Fe(CN)6]溶液的浓度为5 mmol·L-1。

[0090] 所述pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液的浓度为67 mmol·L-1。

[0091] 所述瘦肉精选自下列之一：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布特罗、西布特罗、溴布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗。

[0092] 本发明所制备的免疫传感器检测16种瘦肉精的技术指标见表1。

[0093]

[0094] 表1检测16种瘦肉精的技术指标均优于同类技术手段检测技术指标。

[0095] 实施例5 猪肉样品中瘦肉精的检测

[0096] 准确称取猪肉样品，采用常规方法进行样品处理，按照实施例4所述的步骤进行检测，检测结果见表2。

[0097]

[0098] 表2检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）小于3.5%，平均回收率为95.0 ~105%，表明本发明可用于猪肉和猪尿样品中瘦肉精的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。

[0099] 实施例6 牛肉样品中瘦肉精的检测

[0100] 准确称取牛肉样品，采用常规方法进行样品处理，按照实施例4所述的步骤进行检测，检测结果见表3。

[0101]

[0102] 表3检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）小于3.3 %，平均回收率为90.0 ~106%，表明本发明可用于牛肉样品中瘦肉精的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。

[0103] 实施例7 羊肉样品中瘦肉精的检测

[0104] 准确称取羊肉样品，采用常规方法进行样品处理，按照实施例4所述的步骤进行检测，检测结果见表4。

[0105]

[0106] 表4检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）小于3.5 %，平均回收率为93.0 ~105%，表明本发明可用于羊肉样品中瘦肉精的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。