山梨木糖假丝酵母及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用

摘要

本发明公开了一种山梨木糖假丝酵母及在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC？No：M？2012420，保藏日期2012年10月22日；本发明提供了一种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164新菌株及这种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164菌株在生物转化合成(S)-CHBE中的应用，该合成反应条件温和，环境友好，流程简单，转化率高，产物光学纯度高（e.e.＞99%）。

权利要求

1.一种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M

2012420，保藏日期2012年10月22日。

2.一种权利要求1所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述的应用为：以山梨木糖假丝酵母ZJB-12164发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，于pH4.0~9.0的水或缓冲液构成的转化体系a中，在20~ 45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

3.如权利要求2所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化体系a中底物初始浓度为10~2000mmol/L。

4.如权利要求2所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于转化体系a中含酶湿菌体质量计为10~200g/L，所述含酶湿菌体含水质量为70~90%。

5.如权利要求2所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化体系a中还包括辅助底物，由辅助底物、底物、催化剂与pH4.0~9.0的水或缓冲液构成转化体系b，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油。

6.如权利要求5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述应用为：以山梨木糖假丝酵母ZJB-12164发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，加入辅助底物，于pH4.0~9.0的水或缓冲液构成的转化体系b中，在20~ 45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述转化体系b中底物初始浓度为

10~2000mmol/L，含酶湿菌体添加量以湿菌体质量计为10~200g/L，所述含酶湿菌体含水质量为70~90%，辅助底物初始浓度为10~2000mmol/L，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油。

7.如权利要求2或5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化反应是在20~45℃下反应

0.1~36h。

8.如权利要求2或5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化液后处理的方法为：反应结束后，将转化液离心，去除菌体细胞，取上清液用等体积乙酸乙酯萃取，取有机层用无水Na2SO4脱水、过滤，滤液即为含(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品，将粗品分离纯化，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

9.如权利要求2或5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化体系a或转化体系b均是由蒸馏水、自来水、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液形成的pH4.0~9.0单相体系，或者水与有机介质形成的pH4.0~9.0双相体系；所述有机介质为正己烷、正辛烷、异辛烷、正庚烷、二甲苯、环己烷、乙酸乙酯或乙酸丁酯。

10.如权利要求2或5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述含酶湿菌体按如下方法制备：(1) 斜面培养：将山梨木糖假丝酵母ZJB-12164菌株接种于斜面培养基，于20~37℃下培养12~48小时，获得斜面活化菌种；所述斜面培养基为豆芽汁琼脂培养基，配置方法为：

50~200g新鲜黄豆芽放入烧杯中，加入水，煮沸半个小时，纱布过滤得上清，再加入10~50g葡萄糖，15~20g琼脂，补加水至1L；

(2) 种子培养：将斜面活化菌种接种于种子培养基，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~36小时得到种子液；所述种子培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母膏

5~40g/L，KH2PO4 0.5~5g/L，NaCl 0.5~5g/L，溶剂为水，初始pH为5.0~8.0；

(3)发酵培养：将种子液按照体积比1~5%接入发酵培养基，在25~35℃、摇床转数

100~200r/min条件下培养12~48小时，将培养液离心、洗涤，收集含酶湿菌体，冷藏备用；

所述发酵培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母提取粉5~100g/L，KH2PO4 0.5~5g/L，NaCl

0.5~5g/L，CuCl2 0.01~0.1g/L，溶剂为水，初始pH为5.0~8.0。

说明书

山梨木糖假丝酵母及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

中的应用

（一）技术领域

[0001] 本发明涉及一种新的菌株——山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），及其在生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。（二）背景技术

[0002] (S)-4-氯-3- 羟 基 丁 酸 乙 酯 (Ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S)-CHBE) 是一种无色透明油状液体，分子式为C6H11ClO3，分子量166.6，相对密度1.19g/mL，沸点93-95℃/5mmHg，(S)-CHBE结构如式（Ⅰ）所示。(S)-CHBE作为重要的手性药物中间体，可用于合成他汀类药物—羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂，其制剂立普妥（阿托伐他汀钙）是美国第一个年销量超过一百亿美元的药物，目前也是全球最高销量的药物。另外，(S)-CHBE还可以转化生成1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂。因此，制备光学活性(S)-CHBE备受研究者的关注。

[0003]

[0004] (S)-CHBE的制备方法可以分为外消旋体拆分法和不对称催化合成法。由于外消旋体拆分的方法制备效率不高，理论收率仅为50％，且产物的分离纯化困难，因此，对于外消旋体的手性拆分制备(S)- CHBE意义不大。与拆分法相比较而言，采用不对称合成(S)-CHBE受到了更多的关注。以潜手性底物4-氯乙酰乙酸乙酯（Ethyl4-chloroacetoacetate, COBE）为原料，在一定条件下使其反应生成(S)-CHBE过量，甚至全部为单一的对映体，从而避免和减少拆分过程。由于底物COBE价格便宜，很容易合成，因此不对称合成法是最经济有效的合成(S)-CHBE方法。

[0005] 以COBE为原料不对称合成制备(S)-CHBE，可分为化学催化法和生物催化法两类。化学催化法是采用手性的钌化合物（例如RuX2[(S)-BINAP]）作为催化剂不对称加氢还原，产物的e.e.值可达97%以上，但这种方法需要高压加氢，对反应器要求较高，而且所用催化剂价格昂贵，因此生产成本较高；而采用的生物催化剂既可以是提纯的酶，也可以是微生物细胞。由于生物还原需要价格昂贵的辅酶参与，因此，通常采用具备辅酶再生系统的微生物全细胞作为催化剂。微生物法羰基不对称还原制备(S)-CHBE具有反应条件温和，产物单一，立体选择性高等优点，代表着绿色化学的发展方向。
（三）发明内容

[0006] 本发明目的是提供一种新菌株—山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），及其在羰基不对称还原制备(S)-CHBE中的应用，该菌株稳定性好，立体选择性严格，产物光学纯度高。

[0007] 本发明采用的技术方案是：

[0008] 本发明涉及一种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M 2012420，保藏日期2012年10月22日。

[0009] 本发明所述的山梨木糖假丝酵母ZJB-12164是通过以下程序筛选得到的：

[0010] (1)将来自于浙江、四川、云南和江苏等地200余份土壤样品加入到生理盐水中，制成土壤悬液并接种于富集培养基中，在30℃，150r/min的摇床上培养直至培养液变浑浊后，按2%（v/v）接种量转接到新的富集培养基中继续培养，培养条件同上。富集培养基配方为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，COBE 12g/L，溶剂为水，自然pH。

[0011] (2)第二次富集培养液经稀释后涂布到平板培养基上，30℃培养箱恒温培养48小时，挑取单菌落转接至斜面培养后保藏，斜面培养条件为30℃培养箱恒温培养48小时。平板培养基及斜面培养基配方为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，自然pH。

[0012] (3)从斜面转接至摇瓶菌体培养基中，30℃培养24小时，收集菌体，用0.85%生理盐水洗涤2次，离心收集菌体，所得菌体与底物COBE 100μL分散于10mL磷酸钾缓冲液中（0.1mol/L，pH 7.0），加入0.2g的葡萄糖作为共底物，在30℃，150r/min水浴下反应24小时，反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液通过乙酸乙酯萃取、无水Na2SO4脱水、过滤，采用气相色谱检测分析，能将底物COBE转化生成 (S)-CHBE的菌株为目的菌株，最终从中选择出一株立体选择性最高的菌株（编号为ZJB-12164，即CCTCC No：M2012420）做后续的菌种鉴定及转化。所述菌体培养基配方为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，溶剂为水， pH 7.0。

[0013] 本发明所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164菌株的鉴定：

[0014] (1) 菌株形态特征和生理生化特征：

[0015] 形态特征：于30℃在豆芽汁琼脂培养基平板培养24小时，菌落呈卵圆形，光滑湿润，边缘整齐，有酒香味，乳白色，大小约为2~5×4~10μm。

[0016] 生理生化特性：利用Biolog（GEN III）自动微生物鉴定系统测定菌株ZJB-12164对65种碳源的代谢情况，经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株ZJB-12164可较强利用4种碳源，对其他61种碳源利用能力较弱或不能利用，详见表1所示。

[0017] (2) 菌株18S rDNA序列测定和分析：

[0018] 以提取到的菌株细胞总DNA为模板，利用设计的引物扩增菌株的18S rDNA并测序，该片段实际长度为1470bp，与GenBank相关数据进行相似性分析发现，该菌与Candida sorboxylosa（AB054672.1）同源性最高（homology, 99%/1470bps, based on 18S rDNA），因此根据分子生物学鉴定结合生理生化鉴定，可确定该菌株为Candida sorboxylosa，命名为山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164）。序列如SEQ ID NO.1所示：

[0019] 1 cctgcatgtc caagttagaa actgcgaatg gctcattaga tcagttatca tctccttgac[0020] 61 tcattacatg gataaccgtg gaaaatccag agctaataca cgccgtgcac atattaggtt[0021] 121 ccgactctga gtatttagcg aaccgtacgc tgggtcattc gagcatctgc cctatcaact[0022] 181 agacggtagg atctttgcct acggtggtgg tgacgggtaa cggggaataa gggttcggtt[0023] 241 ccggagaggg agcctgagag acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt[0024] 301 gcacactggg aacgccccga tgcactagca ggcgtaccga tgcgtttacg caatcggata[0025] 361 aacacgcgta caggcccgaa tgtagcagtg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt[0026] 421 aactccagct ccactagcgt atgttaaagt tgtagcagtt aaaacgctcg tagcgggggg[0027] 481 agcgcttata gctattactt tgagaaaatt agagtgttca aagcaggcct tgtgctcgga[0028] 541 tacgttagca tggaataatg gaacacgacg gcgtccatgg acgttgtaat gaccaagagg[0029] 601 ggcggaagag gcggtgcgta ttgggcggct aggggtgaaa tccgacgacc cgcccacgac[0030] 661 gagcgagtgc gaaggcacgc tgcagagacg tgcccgttcg tcaagaacga aagctaggga[0031] 721 atcgaaaatg atcagatacc attgtagtct tagccgtaaa cgatgtggag acacggggtg[0032] 781 cgattgtgct tcgtgggggg aaacttagtt cgttctgggg ggagtatgct cacaagggtg[0033] 841 aaacttaaag aaattggcgg aagactacct taagcaatgg gactgcggct taatttgact[0034] 901 caacacgggg aaactcacca ggtccagacg taataaggat tgaccagctg gagacttttc[0035] 961 ttgatcttac gggtggtggt gcatggccgt ttttcagtcc ttggagtgat ttgtctgctt[0036] 1021 aattgcgata acggacgaga ccttggcctc taactaggag agcgtatttg tacgcggact[0037] 1081 gcttagaggg acgacagacg ctaagtttgt ggaggcgcga ggcaacaaca ggtctgtgat[0038] 1141 gcccttagac gttctgggcc gcacgcgcgc tacactgacg gggggagcga gggccgggct[0039] 1201 gagaagccag ggcaatcagg aaaccgcgtc gtgctgggaa tagcggattg gaattgtttc[0040] 1261 ccttgaacgt ggaattgctt gtaagcgcag gtcatcagcc tgcgttgaat acgacccttg[0041] 1321 tctttgtaca caccgcccgt tgctactacc gattgaatgg cttagtgaga ggtcgggagg[0042] 1381 ccggcggagg gaactccgcg gggcgaactt gttctaactt ggctatttag agctcgtaaa[0043] 1441 agtcgtaaca aggtttccgt aggtgaacct

[0044] 本发明还涉及所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述的应用为：以山梨木糖假丝酵母ZJB-12164发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，于pH4.0~9.0水或缓冲溶液构成的转化体系a中，在20~ 45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

[0045] 所述山梨木糖假丝酵母 ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用的化学反应式为：

[0046]

[0047] 进一步，所述转化体系a中底物初始浓度为10~2000mmol/L，优选50~1500 mmol/L。

[0048] 进一步，转化体系a中含酶湿菌体添加量以湿菌体质量计为10~200g/L，优选50~100 g/L，所述含酶湿菌体含水质量为70~90%。

[0049] 进一步，实现辅酶的再生循环，所述转化体系a中还包括辅助底物，由辅助底物、底物、催化剂与pH4.0~9.0的水或缓冲液构成转化体系b，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油，优选葡萄糖或果糖。

[0050] 更进一步，所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用为：以山梨木糖假丝酵母ZJB-12164发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，加入辅助底物，于pH4.0~9.0水或缓冲溶液构成的转化体系b中，在20~ 45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述转化体系b中底物初始浓度为10~2000mmol/L（优选50~1500 mmol/L），含酶湿菌体添加量以湿菌体质量计为10~200g/L（优选50~100 g/L），所述含酶湿菌含水量为70~90%，辅助底物初始浓度为10~2000mmol/L，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油，优选为葡萄糖或果糖。

[0051] 进一步，所述转化反应是在20~45℃下反应0.1~36h，优选30~35℃反应1~12h。

[0052] 进一步，所述转化液后处理的方法为：反应结束后，将转化液离心，去除菌体细胞，取上清液用等体积乙酸乙酯萃取，取有机层用无水Na2SO4脱水、过滤，滤液即为含(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品，将粗品分离纯化，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。所述粗品分离纯化采用本领域公知的技术进行，通常为旋转蒸发和减压蒸馏等。

[0053] 进一步，所述转化体系a或转化体系b均是由蒸馏水、自来水、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液形成的pH4.0~9.0单相体系，或者水与有机介质形成的pH4.0~9.0双相体系；所述有机介质为正己烷、正辛烷、异辛烷、正庚烷、二甲苯、环己烷、乙酸乙酯或乙酸丁酯，优选为乙酸丁酯。

[0054] 进一步，所述含酶湿菌体按如下方法制备：

[0055] (1) 斜面培养：将山梨木糖假丝酵母 ZJB-12164菌株接种于斜面培养基，于20~37℃下培养12~48小时，获得斜面活化菌种；所述斜面培养基为豆芽汁琼脂培养基，配置方法为：50~200g新鲜黄豆芽放入烧杯中，加入适量水，煮沸半个小时，纱布过滤得上清，再加入10~50g葡萄糖，15~20g琼脂，补加水至1L；

[0056] (2) 种子培养：将斜面活化菌种接种于种子培养基，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~36小时得到种子液；所述种子培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母膏5~40g/L，KH2PO4 0.5~5g/L，NaCl 0.5~5g/L，溶剂为水，初始pH为5.0~8.0；

[0057] (3) 发酵培养：将种子液按照体积比1~5%接入发酵培养基，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~48小时，将培养液离心、洗涤，收集含酶湿菌体，冷藏备用；所述发酵培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母提取粉5~100g/L，KH2PO4 0.5~5g/L，NaCl0.5~5g/L，CuCl2 0.01~0.1g/L，溶剂为水，初始pH为5.0~8.0。

[0058] 本发明中产物(S)-CHBE摩尔转化率和光学纯度（对映体过量值（e.e.%））采用气相色谱测定，方法如下：

[0059] 反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后用岛津GC-14气相色谱仪分析。非手性 GC分析条件：HP-5弱极性色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)，柱温120℃，保留2.5min，以50℃/min程序升温至165℃，保持1.2min。载气为氮气，流量1.0mL/min，进样量1μL，分流比50：1，检测器温度为250℃，进样口温度为230℃；非手性色谱柱可以检测底物COBE和产物CHBE的含量，进一步计算反应的摩尔转化率。手性 GC分析条件： BGB-174手性毛细管气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，柱温110℃，以0.5℃/min程序升温至125℃，载气为氦气，流量为1.0mL/min，进样量1μL，分流比40：1，检测及进样口温度均为220℃；手性色谱柱可以检测(S)-CHBE和(R)-CHBE的含量，进一步计算产物的光学纯度（对映体过量值，e.e.%）。

[0060] 本发明所述转化体系a和转化体系b均为转化体系，为便于区分不同步骤中转化体系构成元素不同而命名，字母本身没有含义。

[0061] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种Candida sorboxylosa ZJB-12164新菌株及这种Candida sorboxylosa ZJB-12164菌株在生物转化合成(S)-CHBE中的应用，该合成反应条件温和，环境友好，流程简单，转化率高，产物光学纯度高（e.e.＞99%）。
（四）具体实施方式

[0062] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0063] 实施例1：微生物的筛选、鉴定

[0064] (1) 微生物的筛选

[0065] 菌种富集培养基配方：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，COBE 12g/L，溶剂为水，自然pH。

[0066] 平板培养基和斜面培养基配方均为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，自然pH。

[0067] 发酵产酶培养基配方：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，溶剂为水，pH 7.0。

[0068] 从来自浙江、四川、云南和江苏等地的菜园、果园植物丛采集土样，共200余份用以菌种筛选。具体过程如下：

[0069] 取少许土样加入到生理盐水中，制成土壤悬液，于菌种富集培养基中150r/min，30℃的摇床上经过两次富集培养，经过稀释涂布，选取单菌落转接至试管斜面并编号于
30℃生化培养箱中培养培养48小时。再从斜面转接至摇瓶发酵产酶培养基中，30℃培养24小时，收集菌体，用0.85%生理盐水洗涤2次，离心收集菌体，所得菌体与底物COBE
100μL分散于10mL磷酸钾缓冲液中（0.1mol/L，pH 7.0），加入0.2g的葡萄糖作为共底物，在30℃，150r/min水浴下反应24小时，反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液通过乙酸乙酯萃取、无水Na2SO4脱水、过滤，采用气相色谱检测分析，能将底物COBE转化生成 (S)-CHBE的菌株为目的菌株，最终从中选择出一株立体选择性最高的菌株（编号为ZJB-12164，即CCTCC No：M 2012420）做后续的菌种鉴定及转化。

[0070] (2) 微生物菌株编号为“ZJB-12164”菌株的生理生化鉴定

[0071] 菌株形态特征：于30℃在豆芽汁琼脂培养基平板培养24小时，菌落呈卵圆形，光滑湿润，边缘整齐，有酒香味，乳白色，大小约为2~5×4~10μm。

[0072] 生理生化特性：利用Biolog自动微生物鉴定系统考察菌株ZJB-12164对65种不同碳源的代谢情况：将菌株接种于平板培养基，28℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液（无菌水）混合，制成菌悬液，用浊度计调整至47%T。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog YT微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在28℃培养箱中，分别在培养24h、48h和72h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株可较强利用4种碳源，对其他61种碳源不能利用或利用能力较弱，详见表1所示。

[0073] 表1 菌株ZJB-12164对Biolog GEN III板上65种碳源的利用能力

[0074]

[0075] 注: +，阳性； −，阴性； B，边界线

[0076] (3) 18S rDNA全序列测定与分析

[0077] 以提取到的菌株细胞总DNA为模板，利用设计的引物扩增该菌株的18S rDNA并测序，实际长度为1470bp，与GenBank相关数据进行相似性分析发现，该菌与Candida sorboxylosa（AB054672.1）同源性最高（homology, 99%/1470bps, based on 18S rDNA），因此根据分子生物学鉴定结合生理生化鉴定，可确定该菌株为Candida sorboxylosa。

[0078] 经过上述鉴定，将本发明“ZJB-12164”菌株命名为山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（ Candida sorboxylosa ZJB-12164）。

[0079] 实施例2 Candida sorboxylosa ZJB-12164的发酵培养

[0080] (1) 斜面培养：将Candida sorboxylosa ZJB-12164接种于斜面培养基，于30℃下培养24小时，获得斜面菌体。斜面培养基为豆芽汁琼脂培养基（新鲜黄豆芽100g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L），自然pH。

[0081] (2) 种子培养：用接种环从斜面菌体挑取一环菌体接种于种子培养基，30℃，150r/min条件下培养24小时，获得种子液。种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏
20g/L，KH2PO4 2.5g/L，NaCl 1g/L，溶剂为水，初始pH为6.0。

[0082] (3) 发酵培养：将培养好的种子液按照2%的体积比接种到发酵培养基中，在28℃、摇床转数150r/min条件下培养24小时，获得含菌细胞发酵液。将获得的含菌细胞发酵液离心，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤两次后，离心收集沉淀，获得湿菌体，湿菌体的产量为58g/L，含水量80%。发酵培养基的配方为：葡萄糖10g/L，酵母提取粉20g/L，K2HPO4
1.0g/L，NaCl 1g/L，CuCl2 0.05g/L，溶剂为水，初始pH为6.0。

[0083] 实施例3 Candida sorboxylosa ZJB-12164的发酵培养

[0084] (1) 斜面培养：同实施例2。

[0085] (2) 种子培养：同实施例2。

[0086] (3) 发酵培养：将培养好的种子液按照2%的体积比接种到菌体培养基中，在30℃、摇床转数150r/min条件下培养24小时，获得含菌细胞发酵液。将获得的含菌细胞发酵液离心，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤两次后，离心收集沉淀，获得湿菌体，湿菌体的产量为75g/L，含水量80%。菌体培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母提取粉50g/L，K2HPO4
2.5g/L，NaCl 1g/L，CuCl2 0.02g/L，溶剂为水，初始pH为5.0。

[0087] 实施例4 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

[0088] 湿菌体的制备同实施例2。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体5g，底物COBE 5mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应4小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为65%。

[0089] 实施例5 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

[0090] 湿菌体的制备同实施例2。在转化瓶中加入100mL柠檬酸钠缓冲液（pH6.0，0.1M），其中含有湿菌体5g，底物COBE 5mmol，辅助底物葡萄糖为5mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应1小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为
93%。

[0091] 实施例6 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

[0092] 湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物COBE 10mmol，辅助底物葡萄糖为10mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应2小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为94%。

[0093] 实施例7 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

[0094] 湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物COBE 100mmol，辅助底物葡萄糖为100mmol，在30℃恒温水浴搅拌反应12小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为89%。

[0095] 实施例8 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

[0096] 湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物COBE 100mmol，辅助底物果糖为200mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应12小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为93%。

[0097] 实施例9 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

[0098] 湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入50mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M）和50mL乙酸丁酯，其中含有湿菌体20g，底物COBE 200mmol，辅助底物葡萄糖为300mmol，在
35℃恒温水浴搅拌反应8小时。反应结束后，转化液在8000rpm离心5分钟，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为85%。

[0099] 实施例10 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE[0100] 湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入60mL磷酸钠缓冲液（pH8.0，0.1M）和40mL乙酸丁酯，其中含有湿菌体20g，底物COBE 300mmol，辅助底物葡萄糖为300mmol，在
35℃恒温水浴搅拌反应4小时后，补加湿菌体20g，继续反应4小时。反应结束后，转化液在
8000rpm离心5分钟，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度 99%，转化率为92%。