用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记

摘要

本发明提供了用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记Y68，该显性分子标记由序列表中SEQ ID NO.1所示的486个核苷酸组成，该序列位于果瘤基因Tu的启动子序列中，该显性分子标记具有高稳定性，有瘤黄瓜品种均含有该显性分子标记，无瘤品种均缺失SEQ ID NO.1所示的486个核苷酸，故此不含有该显性分子标记。故本发明中的显性分子标记Y68可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜果实有瘤/无瘤类型的筛选。本发明还提供了控制果瘤性状的基因蛋白编码序列，由序列表中SEQ ID NO.4所示的213个氨基酸组成，是含有单锌指结构的C2H2型锌指蛋白的一个转录因子，研究该转录因子可以为黄瓜无毛基因(gl)的鉴定及进一步阐明黄瓜毛和瘤的形态建成机理打下坚实的基础。

权利要求

1.用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记，命名为Y68，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，有瘤黄瓜品种含有该标记，无瘤黄瓜品种不含有该标记。

2.根据权利要求1所述的用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记，其特征在于：由SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物扩增得到，其扩增程序为：94℃5min；35cycles，94℃25s；54℃25s；72℃30s；72℃5min。

说明书

用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记。

背景技术

[0002] 黄瓜(Cucumis sativus L.；2n＝2x＝14)属于葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)一年蔓生的草本植物，是世界上极其重要蔬菜作物之一，黄瓜果实属于瓠果，由子房和花托共同发育而成。果实是黄瓜经济性状最重要的部分，可以生吃，烹饪或加工。

[0003] 黄瓜果瘤性状属于区别于其他葫芦科果实的特异性状，果实是黄瓜经济性状最重要的部分，通常情况下，黄瓜果实分为有瘤类型和无瘤类型，与有瘤类型相比无瘤类型黄瓜外观光滑黄瓜残留农药低，清洗方便，口感好，食用卫生，容易运输、包装和储存等优点，但世界上不同地区，不同人们对有瘤黄瓜和无瘤黄瓜有着不同的喜好。因此，果瘤性状已经成为影响黄瓜(包含刺色、果皮颜色、果耙长短和有无光泽等等)市场价值的重要因素。随着人们生活水平的提高，黄瓜果实品质性状已提到重要位置，特别是外部品质性状是引起消费者购买的直接因素。因此研究果瘤性状会提高黄瓜品质育种进程，产生一定的经济价值，这些因素使得研究黄瓜果瘤性状尤为重要，但目前对于黄瓜果瘤性状的研究报道很少。

[0004] 果瘤基因的研究始于1913年，有果瘤是黄瓜的野生性状，果瘤性状是由Tu(Tuberculate fruit)基因调控，有果瘤(Tu)为显性，无果瘤(tu)为隐性。曹辰兴通过分离群体的遗传分析结果表明控制茎、叶、果实表皮毛性状的无毛基因对控制果瘤性状的果瘤基因存在隐性上位作用(曹辰兴等.黄瓜茎叶无毛性状与果实瘤刺性状的遗传关系.园艺学报，2001，28(6)：565-566)。因此，果瘤基因Tu的研究将有助于揭示黄瓜果刺基因形成的分子机制，为黄瓜遗传和育种工作奠定基础。但目前对于黄瓜果瘤性状的研究报道很少。

[0005] 2010年张微微等研究黄瓜果瘤性状时通过细胞学连续观察，发现果瘤的形态建成实际上是源于果刺下靠近刺座细胞的几层瘤细胞大量分裂导致细胞数量显著增加而形成的，并且指出果瘤性状的属于单基因控制的显性性状，同时利用F2群体的247个体将果瘤基因Tu初步定位于第五染色体的SSR标记16203和SCAR标记C_SC933之间，遗传距离分别为1.4cM和5.9cM，详细结果可以参看：ZhangWW等在《Theoretical and Applied Genetics》(理论应用遗传学)2009年第120卷第3期645-654页发表的题为《Identification and mapping of molecular markerslinked to the tuberculate fruit gene in the cucumber(Cucumis sativus L.)》(黄瓜果瘤基因紧密连锁分子标记初步定位)一文，上述标记还存在分析群体相对较小，连锁距离相对较远等问题，候选区间存在100多个候选基因，也没有对候选基因分析。

[0006] 随着人们生活水平的提高，品质育种已提到重要位置。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中是十分有效的方法，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快育种的进程。

发明内容

[0007] 本发明的目的，在于克服现有技术的不足，提供一个用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记以及用于控制果瘤性状的果瘤基因。

[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0009] 本发明用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记，命名为Y68，由序列表中SEQ ID NO.1所示的486个核苷酸组成，无果瘤品种不含有这486个核苷酸。世界各地有瘤黄瓜品种均含有该显性分子标记，无瘤黄瓜品种(除了突变体无毛无瘤品种gl)不含有该显性分子标记，该显性分子标记可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型(除了突变体无毛无瘤品种gl)的筛选。

[0010] 上述用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记Y68，由SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物扩增得到。引物由上海生工合成。

[0011] 本发明涉及的用于控制控制黄瓜果瘤性状的果瘤基因，其蛋白编码序列由序列表中SEQ ID NO.4所示的213个氨基酸组成，是含有单锌指结构的C2H2型锌指蛋白的一个转录因子，研究该转录因子可以为黄瓜无毛基因(gl)的鉴定及进一步阐明黄瓜毛和瘤的形态建成机理打下坚实的基础。

[0012] 所述用于控制黄瓜果瘤性状的果瘤基因的cDNA区域来自于已经公布的黄瓜品种9930基因组序列Scaffold000083和Gy14黄瓜基因组序列Scaffold02633。控制黄瓜果瘤性状的蛋白编码序列来自于已经公布的黄瓜基因组基因功能预测网站http://cucumber.genomics.org.cn/page/eucumber/genedetail.jsp？id＝16817&dbKey＝Cucumber。

[0013] 本发明利用多种有瘤亲本和无瘤亲本杂交获得F1，F1再自交获得多种F2分离群体，确定黄瓜果瘤性状属于单基因显性性状。利用果瘤基因存在于SSR标记分子标记SSR42和分子标记SNP18之间的41.6kb的序列，进行基因预测。这41.6kb的序列同时存在于已经公布的黄瓜品种9930Scaffold000083和Gy14黄瓜基因组序列Scaffold02633中(http://cucumber.vcru.wisc.edu/wenglab/gy14-9930/index.html)。对其中含有基因的cDNA区设计引物，查找多态性位点。进而确定控制黄瓜果瘤性状的基因。根据有瘤亲本和无瘤亲本之间果瘤基因的序列差异，开发出与果瘤基因共分离的显性分子标记。再通过搜集多种世界黄瓜果实有瘤/无瘤品种对该显性分子标记进行验证。

[0014] 本发明具有如下的有益效果：本发明的一种显性分子标记Y68与黄瓜果瘤性状完全共分离，所有世界各地的黄瓜有瘤/无瘤品种(除无毛无瘤黄瓜品种gl)品种均可以用这一个显性分子标记筛选。根据本发明中提供的控制黄瓜果瘤性状的蛋白编码序列，是含有单锌指结构的C2H2型锌指蛋白的一个转录因子，研究该转录因子可以为黄瓜无毛基因(gl)的鉴定及进一步阐明黄瓜毛和瘤的形态建成机理打下坚实的基础。

[0015] 本发明中涉及的很多分子标记数据处于未公开状态。附图说明：

[0016] 图1为果瘤基因Tu的图位克隆：a：Zhang WW等在2010年将果瘤基因Tu定位于第5染色体的标记C_SC933和SSR16203之间，遗传距离分别为5.9cM和1.4cM。b：左边矩形方框代表已经公布的黄瓜基因组Scaffold序列，括号内为黄瓜品种，右边是本发明中新开发的SSR标记，括号内代表核苷酸顺序，最右边代表在F2群体2808株中剩余的交换株数目c：基因被定位于标记SSR42和SNP18之间，交换株分别剩余3株和2株。果瘤基因Tu与标记S_CR68共分离。d：41.6kb区间候选基因有两个，编号分别为Cas016992和Cas016861。

[0017] 图2为果瘤基因Tu在S52和S06之间的差别：a：特异引物PCR结果，marker为DL10000。b：果瘤基因Tu在S52和S06之间差异，×代表缺失4888bp。

[0018] 图3为显性分子标记Y68对世界不同黄瓜品种的筛选效果：M代表Marker DL2000；S52为有瘤亲本；S06为无瘤亲本；15种有瘤品种均出现显性分子标记条带；11种无瘤品种均未出现该显性分子标记条带。

具体实施方式

[0019] 一、遗传分离群体的构建与黄瓜果瘤基因的鉴定

[0020] 1.多种F2群体的构建

[0021] 构建F2群体所用到的无瘤自交系品种有：欧洲温室类型自交系S06(母本)、H34(母本)，S42。有瘤品种有：中国自交系S110、S94、G1、华南类型自交系S52。无毛无瘤突变体gl。本实施例利用这8个亲本配制了多种杂交组合，得到F1代，F1代自交或回交产生F2代群体。对多种F2群体鉴定有/无果瘤表型，最后分析F1表型和F2分离比，卡方分析法进行验证，最后得出黄瓜果瘤性状属于单基因控制的显性性状。同时通过统计分析F2(S06×gl)和F2(gl×S06)群体性状分离比得出，经过卡方分析法进行验证，有毛有瘤、有毛无瘤、无毛无瘤表型分离比符合9∶3∶4，说明无毛基因对果瘤基因起到隐性上位的作用。本发明利用2808株F2(S06×S52)作为果瘤基因Tu的精细定位群体。

[0022] 2.黄瓜果瘤基因的鉴定

[0023] 2.1黄瓜基因组DNA的提取

[0024] 用CTAB法提取亲本及F2分离群体的叶片总DNA。

[0025] 2.2确定果瘤基因序列

[0026] 利用已经公布的黄瓜品种9930和Gy14黄瓜基因组序列(http://cucumber.vcru.wisc.edu/wenglab/gy14-9930/index.html)，能够将SCAR标记C_SC933和SSR标记16203之间的序列兼并拼接。拼接所用的Gy14黄瓜基因组序列有：Scaffold02633、Scaffold00154，拼接所用的9930黄瓜基因组序列有：Scaffold000083、Scaffold000234，拼接后的序列总长度为1300kb。首先用已经公布的SCAR标记C_SC933和SSR标记16203筛选该2808株精细定位的群体，找出交换株。然后再用SSR分析软件找出SSR位点，设计引物软件，对1300kb序列分析设计了大量引物，找出亲本间有多态性的引物，位于基因两侧的多态性再次扫描剩余的交换单株，多态性标记向交换株逐渐减少的方向步移，最后确定最近的两侧标记SSR42和SNP18距Tu/tu基因位点间分别还剩余3和2个交换单株。上述黄瓜果瘤基因Tu染色体步移的详细情况如图1所示。所有SSR标记PCR反应体系均为：黄瓜DNA 20ng，双向引物各0.2μmol/L，200μmol/LdNTPs，2mmol/LMgCl2，1×Taq缓冲液，
0.5U TaqDNA聚合酶，总反应体系为10μL，其中TaqDNA聚合酶购于Promega公司。扩增程序为：94℃3min；35cycles，94℃20s，55℃30s，72℃30s；72℃5min。

[0027] SSR42和SNP18之间的41.6kb序列经过黄瓜基因组第五染色体基因预测网站 (http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/mapview.jsp ？ dbKey ＝Cucumber&refId＝5)，仅含有两个候选基因，编号分别为Cas016992的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和Cas016861的C2H2锌指蛋白(图1)。经过测序后发现在S52和S06之间的编号为Cas016992基因序列没差别，编号为Cas016861中在S52中存在但在S06却完全缺失，包含启动子序列和cDNA序列，共缺失4888bp序列(图2)。我们确定为编号为Cas016861即为控制果瘤性状的果瘤基因，果瘤基因的蛋白编码序列来自于已经公布的黄瓜基因组基因预测网站(http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/genedetail.jsp？id＝16817&dbKey＝Cucumber)，由序列表中SEQ ID NO.4所示的213个氨基酸组成。经过氨基酸序列分析和建模网站发现该蛋白序列仅含有单锌指结构。果瘤基因的蛋白编码序列特征是含有6个C2H2锌指蛋白特异氨基酸序列QALGGH，是一个转录因子，由于果瘤性状的形成是由于果刺下靠近刺座细胞的几层瘤细胞大量分裂导致细胞数量显著增加而造成的，故此本发明推测该蛋白的功能可能促进黄瓜果实表皮紧靠表皮毛基部部位的细胞的分裂。

[0028] 本发明中涉及的分子标记SSR标记16203和SCAR标记C_SC933已公开。详细参看Zhang WW等在《Theoretical and Applied Genetics》(理论应用遗传学)2010年第120卷第3期645-654页发表的题为《Identification and mapping of molecularmarkers linked to the tuberculate fruit gene in the cucumber(Cucumis sativus L.)》(黄瓜果瘤基因紧密连锁分子标记定位)一文。

[0029] 根据果瘤基因Tu在S52和S06之间的差别，我们在启动子部位设计显性分子标记Y68，由序列表中SEQ ID NO.1所示的486个核苷酸组成。该显性分子标记Y68由SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物扩增得到，其扩增程序：94℃5min；35cycles，94℃25s；54℃25s；72C 30s；72℃5min。

[0030] 2.3多态性片段的回收、克隆和测序

[0031] 在PCR产物中加入goldview荧光染料3μL，4℃下放置10min让染料同DNA结合，然后加入上样缓冲液2μL，混匀后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目标片段放入1.5mL的离心管中，用DNA回收试剂盒回收，其中DNA回收试剂盒为上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，产品号为Cat.No.SK1132。将回收产物与载体连接采用上海申能博彩公司的pUCm-T vector系统。用电击法将连有目标片段的T-vector转化进入E.coli DH5α感受态细胞，将菌液均匀涂布于LB固体培养基的平板上，涂好的平板倒置于37℃培养箱培养过夜，挑菌、摇菌及PCR菌液检测，进行相关序列的测定。

[0032] 二、多种黄瓜品种验证显性分子标记Y68

[0033] 1、选取多种黄瓜有瘤/无瘤品种

[0034] 由于推测C2H2锌指蛋白基因是控制果瘤性状的目的基因，随机选取自世界各地的22个黄瓜自交系品种对，显性分子标记Y68进行验证，其中无瘤品种有：以色列亲本的S06、荷兰的S46-2、S49-1、S49-2和S51-2，以色列的S03、S04和S05，西班牙的S42、S75和S76，欧洲的H34，共12个无瘤黄瓜品种；有瘤品种有：中国的S52、S94、S110、G1、M3、M12、419、
493和S124-5，韩国的S53和S112-7，美国的83G和S106，日本的S66、S67和S74，共16个有瘤黄瓜品种。

[0035] 2、用显性分子标记Y68验证28种黄瓜有瘤/无瘤品种

[0036] 结果表明，16种有果瘤品种均出现显性标记Y68的清晰特异性条带，12种无果瘤品种均没出现Y68标记(参见图3)。

[0037] 以上新开发的显性分子标记Y68存在于果瘤基因Tu的启动子序列中，经过分离群体验证和品种验证，是特异性PCR扩增，故该显性分子标记具有高稳定性。所以本发明的显性分子标记Y68可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型(除了突变体无毛无瘤品种gl)的筛选。本发明还提供了控制果瘤性状的基因蛋白编码序列，由序列表中SEQ ID NO.4所示的213个氨基酸组成，是含有单锌指结构的C2H2型锌指蛋白的一个转录因子，研究该转录因子可以为黄瓜无毛基因(gl)的鉴定及进一步阐明黄瓜毛和瘤的形态建成机理打下坚实的基础。

[0038] 本发明中PCR产物克隆测序中所使用的E.coli DH5α菌株已在文献《李欣等，电转化法制备高转化效率的E.coli感受态细胞研究。食品与生物技术学报，2007，26(6)48～51》中公开；本发明中涉及的E.coli DH5α菌株可通过公开市售的商业渠道取得，购于宝生物工程(大连)有限公司，公司地址：大连经济技术开发区东北二街19号。

[0039] 序列表

[0040] <110>上海交通大学

[0041] <120>用于筛选有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记

[0042] <160>4

[0043] <210>1

[0044] <211>486

[0045] <212>DNA

[0046] <213>黄瓜(Cucumis sativus L.)

[0047] <400>1

[0048] ttgacttctc ctactatgat tgacatatca ttacaagact tatattaata tatttcgagt 60[0049] tgcatctatc ttttagtttt agttttgagt tagcaacata tcaatataag aaatttataa 120[0050] tagatctaat aaaataagga tcgatttctt aattgatatc gacaatttaa atttggatcg 180[0051] attatgacac atcctaatac taaattactt aacctattct ttagttcatt tcaaactatt 240[0052] gtttaaaaaa tatatttttg ttaagaaagt gaaacccact tttattatta aaaaaaaaaa 300[0053] gaagaactag atttaaaaac aagaaataaa atcataaaaa tgaaaaaaga aaggatatat 360[0054] atgaagagat ggatagtatt aaagaagtgc aatcctttgt gtcccaaaaa tgtttgttga 420[0055] gttgtgttcc catattactt gactttcttc tcattttatt tggtttgttg ttccctcctc 480[0056] tatctc 486

[0057] <210>2

[0058] <211>24

[0059] <212>DNA

[0060] <213>人工序列

[0061] <400>2

[0062] ttgacttctc ctactatgat tgac 24

[0063] <210>3

[0064] <211>21

[0065] <212>DNA

[0066] <213>人工序列

[0067] <400>3

[0068] gagatagagg agggaacaac a 21

[0069] <210>4

[0070] <211>213

[0071] <212>PRT

[0072] <213>Tu蛋白

[0073] <400>4

[0074] maalenhyqt kqnnnnpatt rlklfgfdvq edldqddstp tssdsgaavp ssgdrkyecq 60[0075] ycyrefansq algghqnahk kerqqlkraq lqasrnaavf rnpivaafap pphllpsaav 120[0076] tassswpvyi prappqfqvs hgcvftpsss yggggdappp psppdfftmg srsshgmvda 180[0077] pmslsrfskv dggtafddgp gldlhlslap aap 213