一种番茄遗传转化的方法转让专利
申请号 : CN201210112183.7
文献号 : CN103074364B
文献日 : 2014-11-12
发明人 : 徐洪伟 , 周晓馥 , 吕杰
申请人 : 吉林师范大学
摘要 :
本发明涉及一种番茄遗传转化的方法，属于遗传工程技术领域，具体的说公开了一种番茄种子整体侵染的方法，该方法包括测成熟番茄种子的生理吸胀曲线；含有目标基因的发根农杆菌培养；结合番茄种子的生理吸胀曲线，将消毒灭菌的番茄种子转入到OD600值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时；在25℃黑暗条件下共培养3天；抗性植株的筛选；抗性植株的生根及培育；转化植株炼苗及移栽等步骤。本发明由于采用在番茄种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液侵染，大大提高了转化效率，经过压力筛选培养基进行筛选，缩短了实验周期2-3个月，简化了实验过程，减少了转化后的鉴定工作量。对番茄基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。
权利要求 :
1.一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，其特征在于：步骤包括：①测成熟番茄种子的生理吸胀曲线：取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；
②含有目标基因的发根农杆菌培养：将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活-1化2次，挑取该菌株的单菌落接种到5ml含有50μg·ml 卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26℃、振荡转速160-200rpm的条件下，培养5-8小时，然后取1ml转接于50ml含有-1 -1
50μg·ml 卡那霉素和110μmol·L 乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26℃、振荡转速160-200rpm的条件下，培养12-16小时后，取50ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25℃、转速3500rpm条件下离心10分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含-1 -1
6mg·L 6-BA和110μmol·L 乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD600值为0.8-1.3备用；
③番茄种子的消毒灭菌：挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，Cl2灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；
④结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD600值为
0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时：结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤②制备的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于26℃，166rpm条件下振荡培养7-9小时；
⑤在25℃黑暗条件下共培养3天：待步骤④侵染7-9小时后，从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25℃黑暗条件-1 -1下，共培养3天；共培养的培养基是指：在MS培养基中加入6mg·L 6-BA和110μmol·L-1乙酰丁香酮和7g·L 琼脂，pH值5.80-5.82；
⑥抗性植株的筛选：将经步骤⑤共培养的种子，转接到压力筛选培养基上培养1.5-2-1个月，获得抗性植株；压力筛选培养基是由1/2MS培养基中加入0.2mg·L 6-BA和-1 -1 -1
1mg·L IBA和250mg·L Cef和50-100mg·L Kan组成；
⑦抗性植株的生根及培育：将步骤⑥筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000lx，光照时间为12day/8night的人工气候箱中培养-1
20-30天；生根培养基是由1/2MS培养基加入0.4g·L 活性炭组成；
⑧转化植株炼苗及移栽：当步骤⑦获得的植株根长达到8cm左右时，置于温室内开盖
2-3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80％左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，
2周后，栽入花盆中，在温室培养。
2.如权利要求1所述番茄遗传转化的方法，其特征在于：步骤②所述含有目标基因的发根农杆菌是含有Gt基因的发根农杆菌A4菌株。
3.如权利要求1所述的番茄遗传转化的方法，其特征在于：步骤②制备的用于侵染番茄种子的农杆菌菌液浓度OD600值为1.0。
说明书 :
一种番茄遗传转化的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种农杆菌介导转化番茄的方法，属于遗传工程技术领域，具体涉及番茄种子整体侵染转化的方法。
背景技术
[0002] 番茄是一种世界性种植的最重要的鲜食和加工原料。它的基因组较小，是一种理想的模式植物。另外，番茄还具有自花授粉易于纯合、生长周期短、在温室内可周年生长等优点，因而其遗传转化研究备受关注。自从1986年McCormick等首次用农杆菌介导的方法获得转基因番茄植株以来，番茄的遗传转化研究不断发展，但转化效率有很大差异。
[0003] 影响农杆菌介导番茄遗传转化的因素很多，如番茄基因型、侵染时间、分化培养基等，其中基因型对植物生长调节剂的专一性，使得需要对每个番茄基因型的转化过程分别进行研究，以寻求不同基因型植株最适合的转化方法，即由于再生受基因型限制，从而使转化变得较困难；外植体大小对番茄的再生也有重要影响，理想的外植体大小为叶片0.52
cm，外植体的放置方向有近轴面向上和背面向上两种方式，但基本原则是使外植体的伤口与培养基有较好的接触，以利于外植体愈伤组织的诱导和芽的分化；基因型、分化培养基都是基于再生体系而形成的限制，从而使番茄的遗传转化变得更困难。
cm，外植体的放置方向有近轴面向上和背面向上两种方式，但基本原则是使外植体的伤口与培养基有较好的接触，以利于外植体愈伤组织的诱导和芽的分化；基因型、分化培养基都是基于再生体系而形成的限制，从而使番茄的遗传转化变得更困难。
[0004] 番茄是植物基因工程中进行遗传转化的重要模式植物之一。目前在番茄的遗传转化过程中还存在一些问题，如转化率低，转化体、转化植株后代遗传不稳定，操作复杂等。这些问题阻碍了番茄基因工程的研究。因此，建立高效的番茄遗传转化体系，为植物功能基因研究及基因工程改良提供高效的遗传转化平台，从而促进其产业化发展。农杆菌所携带的目标基因能否成功转入到植物基因组中，对后续实验有着重要影响。在常规的农杆菌介导的植物遗传转化方法中，常选用的外植体为具有分生能力的细胞、幼嫩的组织、子叶及下胚轴等，也采取预培养等使细胞处于感受态的技术，这些都有利于转化率的提高。但目前这些方法转化效率还很低、操作过程也较繁琐，实验周期较长。
发明内容
[0005] 针对上述不足，本发明的目的在于克服现有番茄遗传转化效率低、转化周期长及操作过程繁琐的难点，提供一种番茄种子整体侵染的方法，从而提高番茄的转效率。
[0006] 本发明是按以下技术方案实现的：
[0007] 一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，步骤包括：① 测成熟番茄种子的生理吸胀曲线，② 含有目标基因的发根农杆菌培养，③ 番茄种子消毒灭菌，④ 结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD600值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时，⑤ 在25℃黑暗条件下共培养3天，⑥ 抗性植株的筛选，⑦ 抗性植株的生根及培育，⑧ 转化植株炼苗及移栽等步骤；其中：
[0008] 步骤 ① 所述测成熟番茄种子的生理吸胀曲线的方法是：取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；
[0009] 步骤 ② 所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是：将发根农杆菌A4在LB-1固体培养基平板上接种活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有50 ug·mlo
卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26C、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小-1 -1
时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有50 ug·ml 卡那霉素和110 umol·L 乙酰丁香酮的o
LB液体培养基中，在温度26C、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12-16小时后，取50 o
ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25C、转速3500 rpm条件下离心-1 -1
10 分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg·L 6-BA 和 110 umol·L 乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD600值为0.8-1.3备用；
卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26C、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小-1 -1
时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有50 ug·ml 卡那霉素和110 umol·L 乙酰丁香酮的o
LB液体培养基中，在温度26C、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12-16小时后，取50 o
ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25C、转速3500 rpm条件下离心-1 -1
10 分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg·L 6-BA 和 110 umol·L 乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD600值为0.8-1.3备用；
[0010] 步骤③ 所述番茄种子灭菌的方法是：挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，Cl2灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；
[0011] 步骤④ 所述结合番茄种子的生理吸胀曲线，侵染番茄种子7-9小时的方法是：结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤② 制备好的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶o口，置于摇床中，于26C，166 rpm条件下振荡培养7-9小时；
[0012] 步骤⑤ 所述的共培养的方法是：待步骤④ 侵染7-9小时后，从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25℃黑-1暗条件下，共培养3天；共培养培养基是指：在MS培养基中加入 6 mg·L 6-BA 和 110 -1 -1
umol·L 乙酰丁香酮 和 7 g·L 琼脂，pH值5.80-5.82；
umol·L 乙酰丁香酮 和 7 g·L 琼脂，pH值5.80-5.82；
[0013] 步骤⑥ 所述抗性植株的筛选其方法是：将经步骤⑤ 共培养的种子，转接到压力筛选培养基上培养1.5-2个月，获得抗性植株。压力筛选培养基是由1/2MS 培养基中加入 -1 -1 -1 -10.2 mg·L 6-BA 和1 mg·L IBA和 250 mg·L Cef 和50-100 mg·L Kan 组成。
[0014] 步骤⑦ 所述抗性植株的生根及培育的方法是：将步骤⑥ 筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day / 8 -1night 的人工气候箱中培养20-30天，生根培养基是由1/2MS培养基加入 0.4 g·L 活性炭组成。
[0015] 步骤⑧ 所述转化植株炼苗及移栽的方法是：当步骤⑦ 获得的植株根长达到8 cm左右时，置于温室内开盖2-3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室培养。
[0016] 上述方法中使用的LB和MS培养基为常规培养基：
[0017] LB液体培养基组成为10 g·L-1 NaCl， 10 g·L-1 蛋白胨和 5 g·L-1 酵母浸膏，pH值7.0；
[0018] LB固体培养基是指在LB液体培养基中，再添加15 g·L-1 琼脂；
[0019] MS培养基组成为：KNO3 1900 mg·L-1，NH4NO3 1650 mg·L-1，CaCl2·2H2O 440 -1 -1 -1 -1mg·L ，MgSO4·7H2O 370 mg·L ，KH2PO4 170 mg·L ，H3BO3 6.2 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
16.9 mg·L ，ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L ，KCl 0.83 mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg·L ，-1 -1 -1
CuSO4·5H2O 0.025 mg·L ，CoCl2·6H2O 0.025 mg·L ，Na2EDTA 37.3 mg·L ，FeSO4·7H2O -1 -1 -1 -1
27.8 mg·L ，肌醇 20 g·L ，烟酸 100 mg·L ，盐酸吡哆醇 100 mg·L ，盐酸硫胺素 100 -1 -1 -1
mg·L ，甘氨酸 400 mg·L ，蔗糖 30 g·L ，pH值5.80-5.83。
16.9 mg·L ，ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L ，KCl 0.83 mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg·L ，-1 -1 -1
CuSO4·5H2O 0.025 mg·L ，CoCl2·6H2O 0.025 mg·L ，Na2EDTA 37.3 mg·L ，FeSO4·7H2O -1 -1 -1 -1
27.8 mg·L ，肌醇 20 g·L ，烟酸 100 mg·L ，盐酸吡哆醇 100 mg·L ，盐酸硫胺素 100 -1 -1 -1
mg·L ，甘氨酸 400 mg·L ，蔗糖 30 g·L ，pH值5.80-5.83。
[0020] 上述方法中各步骤使用的培养基均用蒸馏水按常规方法配制。
[0021] 上述番茄种子整体侵染的方法中：
[0022] 步骤②所述农杆菌菌株是含有Gt基因的发根农杆菌（Ageobacterium rhizogenes）A4菌株，该菌株已在ZL200710055462.3公开并使用。在番茄种子整体侵染的方法中，该菌株用于侵染的菌液浓度OD600为0.8-1.3，其中优选1.0。
[0023] 步骤④所述的番茄种子吸胀的时间段为0-7/9小时，农杆菌浸泡侵染番茄种子时间优选7小时。
[0024] 本发明具有以下积极的效果：
[0025] 1、本发明由于采用在番茄种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液侵染，大大提高了转化效率，提高了转化植株的获得数量。
[0026] 2、经过采用含卡那霉素的压力筛选培养基对抗性植株进行筛选，缩短了实验周期2-3个月，简化了实验过程，减少了转化后的鉴定工作量。
[0027] 3. 本发明的方法操作简单实用，与显微注射法、电击法和其它农杆菌介导的方法相比，具有明显优势和突破性特点，对番茄基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。
附图说明
[0028] 图1是转化的番茄经压力筛选培养基培养后，全部白化，确定为转化未成功的番茄植株，见白化苗。
[0029] 图2是转化的番茄经压力筛选培养基培养后，有绿色苗存活，初步确定为转化成功的番茄植株，见绿色苗。
[0030] 图3是转基因番茄经压力筛选后，正常生长，证明转入的外源基因不会对转基因番茄的生长发育有不利影响。
[0031] 图4是转基因番茄经压力筛选获得的抗性植株，移栽后正常生长。
[0032] 图5是转基因番茄植株的PCR检测结果图。P-以质粒为阳性对照；CK-以[0033] 未转基因的番茄植株为阴性对照；1-以转基因番茄植株为样品；结果[0034] 表明获得了1892 bp的目标PCR扩增产物。
具体实施方式
[0035] 下面结合实施案例对本发明作进一步说明：
[0036] 一、培养基的配制和灭菌
[0037] 1、 LB液体培养基的配制：分别称量10 g NaCl、10 g 蛋白胨和5 g 酵母浸膏放入到1 L三角瓶中，加入蒸馏水定容到1 L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用o o121C高压湿热灭菌20分钟，冷却后放在4C冰箱中，备用；
[0038] 2、LB固体培养基的配制：分别称量10 g NaCl、10 g 蛋白胨、5 g 酵母浸膏和15 g 琼脂放入到1 L三角瓶中，加入蒸馏水定容到1 L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，o o之后采用121C高压湿热灭菌20分钟，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4 C冰箱中，备用；
[0039] 3、 MS培养基的配制：
[0040] （1）、MS培养基母液的配制
[0041] 1）、大量元素母液的配制：
[0042] ①、KNO3母液的配制：称取190g KNO3放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为100倍。
[0043] ②、NH4NO3母液的配制：称取330g NH4NO3放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
[0044] ③、MgSO4·7H2O母液的配制：称取74g MgSO4·7H2O放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml ，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
[0045] ④、KH2PO4母液的配制：称取34g KH2PO4放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml ，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
[0046] ⑤、CaCl2·2H2O母液的配制：称取88g CaCl2·2H2O放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
[0047] 2）、微量元素母液的配制：分别称取6.2 g H3BO3，16.9 g MnSO4·H2O，8.6 g ZnSO4·7H2O，0.83 g KCl，0.25 g Na2MoO4·2H2O，0.025 g CuSO4·5H2O，0.025 g CoCl2·6H2O放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml ，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为1000倍。
[0048] 3）、铁盐母液的配制：分别称取18.65 g Na2-EDTA和13.9 g FeSO4·7H2O，分别放入2个500 ml 烧杯中，分别加入200 ml 蒸馏水，加热并不断搅拌，使之完全溶解；冷却，将o2种溶液混合，调pH至5.5，加蒸馏水定容至500 ml ，转移至棕色瓶中，在4C冰箱中保存；
较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为500倍。
较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为500倍。
[0049] 4）、B5有机母液的配制：分别称取10 g 肌醇，0.05 g 烟酸，0.05 g 盐酸吡哆醇、0.05 g 盐酸硫胺素和0.2 g 甘氨酸，放入到500 ml 的烧杯中，用300 mL蒸馏水使之完全o
溶解，加蒸馏水定容至500 ml，高压灭菌，转移至无菌棕色瓶中，在4C冰箱中保存；较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为200倍。
溶解，加蒸馏水定容至500 ml，高压灭菌，转移至无菌棕色瓶中，在4C冰箱中保存；较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为200倍。
[0050] （2）、MS培养基的配制：分别吸取上述MS培养基母液：10 ml KNO3、5 ml NH4NO3、5 ml MgSO4·7H2O、5 ml KH2PO4、5 ml CaCl2·2H2O、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5有机，加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中，加入30 g 蔗糖，加入蒸馏水定容到1 L，o充分溶解，调pH值到5.80-5.83，用封口膜封口，然后采用121C高压湿热灭菌20分钟；
[0051] 4、共培养培养基的配制：分别吸取上述MS培养基母液：10 ml KNO3、5 ml NH4NO3、5 ml MgSO4·7H2O、5 ml KH2PO4、5 ml CaCl2·2H2O、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5有机，加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中，加入30 g 蔗糖、7 g 琼脂，加入蒸馏o
水定容到1 L，充分溶解，调pH值到5.80-5.82，用封口膜封口，然后采用121C高压湿热灭-1
菌20分钟。从高压锅取出，冷却10分钟后加入 6 ml 浓度为1mg·mL 的无菌6-BA，11 -1 o
ml 浓度为10 mmol·L 的无菌乙酰丁香酮，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4C冰箱中，备用；
水定容到1 L，充分溶解，调pH值到5.80-5.82，用封口膜封口，然后采用121C高压湿热灭-1
菌20分钟。从高压锅取出，冷却10分钟后加入 6 ml 浓度为1mg·mL 的无菌6-BA，11 -1 o
ml 浓度为10 mmol·L 的无菌乙酰丁香酮，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4C冰箱中，备用；
[0052] 5、压力筛选培养基的配制：分别吸取上述MS培养基母液：5 ml KNO3、2.5 ml NH4NO3、2.5 ml MgSO4·7H2O、2.5 ml KH2PO4、2.5 ml CaCl2·2H2O、0.5 ml微量元素、1 ml 铁盐、2.5 ml B5有机，加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中，加入15 g 蔗糖、7 g 琼脂，加入蒸馏水定容到1 L，充分溶解，调pH值到5.80-5.82，用封口膜封口，然后采o
用121C高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出，冷却10分钟后分别加入 6 ml 浓度为1 -1 -1 -1
mg·mL 的无菌 6-BA，1 ml 浓度为 1 mg·mL 的无菌 IBA，1 ml 浓度为250 mg·mL 的-1
无菌 Cef和 1.5 ml 浓度为50 mg·mL 的无菌 Kan，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却o
后放在4 C冰箱中，备用；
用121C高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出，冷却10分钟后分别加入 6 ml 浓度为1 -1 -1 -1
mg·mL 的无菌 6-BA，1 ml 浓度为 1 mg·mL 的无菌 IBA，1 ml 浓度为250 mg·mL 的-1
无菌 Cef和 1.5 ml 浓度为50 mg·mL 的无菌 Kan，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却o
后放在4 C冰箱中，备用；
[0053] 6、生根培养基的配制：分别吸取上述MS培养基母液：5 ml KNO3、2.5 ml NH4NO3、2.5 ml MgSO4·7H2O、2.5 ml KH2PO4、2.5 ml CaCl2·2H2O、0.5 ml微量元素、1 ml 铁盐、2.5 ml B5有机，加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中，加入15 g 蔗糖、6.5 g 琼脂，0.4 g活性炭，加入蒸馏水定容到1 L，充分溶解，调pH值到5.80-5.83，用封口膜封口，o
然后采用121C高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却o
后放在4C冰箱中，备用；
然后采用121C高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却o
后放在4C冰箱中，备用；
[0054] 二、番茄种子整体侵染转化法
[0055] 1、测成熟番茄种子的生理吸胀曲线
[0056] 植物材料为番茄种子，取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取1份（200粒）浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；
[0057] 2、含有目标基因的发根农杆菌的培养
[0058] 挑选含有Gt基因的发根农杆菌A4菌株，接种于LB固体培养基平板上活化2次，-1 -1之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有 20 ug·ml 利福平、50 ug·ml 卡那霉素-1 o
和10 ug·ml 四环素的LB液体培养基中，在温度26C、振荡转速166 rpm 的条件下，培-1 -1
养5小时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug·ml 利福平、50 ug·ml 卡那霉素、10 -1 -1 o
ug·ml 四环素和110 umol·L 乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26C、振荡转速
160-200 rpm 的条件下，培养12小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离o -1
心机中，在温度25C、转速3500 rpm条件下离心10 min，弃上清液，用含6mg·L 6-BA 和 -1
110 umol·L 乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD600=1.0备用；
和10 ug·ml 四环素的LB液体培养基中，在温度26C、振荡转速166 rpm 的条件下，培-1 -1
养5小时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug·ml 利福平、50 ug·ml 卡那霉素、10 -1 -1 o
ug·ml 四环素和110 umol·L 乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26C、振荡转速
160-200 rpm 的条件下，培养12小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离o -1
心机中，在温度25C、转速3500 rpm条件下离心10 min，弃上清液，用含6mg·L 6-BA 和 -1
110 umol·L 乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD600=1.0备用；
[0059] 3、番茄种子灭菌
[0060] 挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，用Cl2（NaClO：浓HCl=25ml：1ml）灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；
[0061] 4、结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经上述消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD600值为1.0的发根农杆菌菌液中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶口，o置于摇床内控制温度26C，转速166 rpm培养7小时；
[0062] 5、共培养：上述番茄种子浸泡侵染7小时后，从摇床中取出置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25℃黑暗条件下，共培养3天；
[0063] 6、抗性植株的筛选：共培养3天后，取萌发的种子转接到压力筛选培养基上培养2个月，获得无抗性的植株（见附图说明图1）和抗性植株（见附图说明图2）；
[0064] 7、抗性植株的生根及培育： 筛选之后成活的抗性植株长到2-3 cm时，将其移入生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12天day / 8 night 的人工气候箱中培养20天，抗性植株正常生长（见附图说明图3）；
[0065] 8、转化植株炼苗及移栽：当抗性植株的根长达8 cm左右时于温室内开盖3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室培养，移栽后的抗性植株正常生长（见附图说明图4）；
[0066] 9、转基因植株的分子检测： 抗性植株移栽后，取其新鲜幼嫩叶片，用CTAB法从叶片中提取其基因组DNA，并以其为模板，以5’-GAAGATCTATGGTGGGCAGAGGCAAAGGC-3’和5’-TTGGTCACCCTAATTAATAGTAGTTGTGC-3’为引物，扩增转化植株中的Gt基因。PCR反应条件为：o o o o
94C预变性1 min，94C变性30 sec，65C复性10 min，72C 延伸1min，共计35个循环，最o
后再72C延伸10 min。对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测情况如见附图说明图5 所示。其中，M为DNA分子量标准，P-为阳性质粒对照的PCR扩增结果，1为转Gt基因番茄的PCR扩增结果，CK-为阴性对照番茄原种的PCR扩增结果。结果表明获得了1892 bp的PCR扩增产物。
94C预变性1 min，94C变性30 sec，65C复性10 min，72C 延伸1min，共计35个循环，最o
后再72C延伸10 min。对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测情况如见附图说明图5 所示。其中，M为DNA分子量标准，P-为阳性质粒对照的PCR扩增结果，1为转Gt基因番茄的PCR扩增结果，CK-为阴性对照番茄原种的PCR扩增结果。结果表明获得了1892 bp的PCR扩增产物。