一种提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，涉及利用接种乳酸菌进行餐厨垃圾抑菌而产生的乳酸转化为丙酮酸，进而提高乙醇产量的方法。通过如下方式实现：1）将餐厨垃圾进行前处理后，获得垃圾浆液，接入乳酸菌液，将餐厨垃圾在30~40℃厌氧条件下保存1-2天；2）获得的含有乳酸菌的垃圾浆液接入糖化酶，在50-60℃糖化3-6小时，获得餐厨垃圾浆液。经过固液分离后，向餐厨垃圾糖化液中加入预先获得的固定化乳酸氧化酶；在50-60℃，震荡速度为150-200r/min，调节糖化液pH，反应4-6小时；经过转化的糖化液冷却接入酿酒酵母，进行乙醇发酵。与未加入乳酸氧化酶相比，固定化乳酸氧化酶可以有效地将残存的乳酸转化为丙酮酸，进而生成乙醇，其提高的百分比为10-20%以上。
1.一种提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将餐厨垃圾进行前处理后，获得垃圾浆液，接入乳酸菌液，将餐厨垃圾在30~40℃厌氧条件下保存1-2天；
（2）获得的含有乳酸菌的垃圾浆液按照每克垃圾浆液50-100 酶活力单位接入糖化酶，在50-60℃糖化3-6小时，获得餐厨垃圾浆液；经过固液分离后，留下餐厨垃圾糖化液待用；
（3） 向餐厨垃圾糖化液中按照每100ml加入15-25克预先获得的固定化乳酸氧化酶，固定化乳酸氧化酶在50-60℃，震荡速度为150-200 r/min，调节糖化液pH为5-7.2，反应
3-6小时；其中所述固定化乳酸氧化酶的酶活力为60-70 U/g；
（4）在经过转化的糖化液冷却至35-40℃，接入酿酒酵母，进行乙醇发酵。
2.根据权利要求1所述的提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，其特征在于：所述步骤（2）中糖化酶的酶活力定义为：1g固体酶在40℃、pH4.6条件下，1h内水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需要的酶量，即为1个酶活力单位。
3.根据权利要求1所述的提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶活的情况为，所述固定化乳酸氧化酶的酶活力为60-70 U/g, 酶活的单位定义为；1 min催化乳酸生成1 nmol丙酮酸的酶量为1个酶活力单位。
4.根据权利要求1或3所述的提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，乳酸氧化酶的固定方法如下：（1）菌种的活化及培养
耻垢分枝杆菌(Mycobacterim Smegmatis) AS 1.0562进行培养,培养基组分为甘油
3%，蛋白胨0.4%，DL-乳酸1%，维生素B1 0.005%，KH2PO4·H2O 0.05%，MgS04· 7H2O 0.05%，硫酸亚铁胺0.01%; 250mL三角瓶中装液量50mL，起始pH7.2，培养温度37℃，静置培养4d超声波细胞破壁、冷冻高速离心获得乳酸氧化酶粗酶液；
首先将20ml乳酸氧化酶酶液与20ml 4%海藻酸钠溶液混合，用注射器缓慢滴入到
400mL 0.2mol/L的CaCl2溶液中 ，随后于25℃静置固化2h，过滤洗涤；然后将其加入到
400ml 0.2% 戊二醛溶液中，25℃交联2 h，最后经过滤、洗涤和干燥后得到颗粒状固定化乳酸氧化酶。
5.根据权利要求1或3中所述的提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，其特征在于：所使用的固定化乳酸氧化酶可多次使用。
6.根据权利要求1所述的提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，其特征在于：经过上述的方法处理后，可利用接种乳酸菌对餐厨垃圾实现抑菌保存，同时可将抑菌过程中的乳酸转化为丙酮酸，进而提高乙醇的产量，可以提高乙醇的产量10%-20 %；节约成本。
7.根据权利要求1所述的提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述接种乳酸菌抑菌保存的垃圾浆液需要先加入50-100酶活力单位的糖化酶进行糖化，糖化时间为4-6小时；所述步骤（3）中的固定化的乳酸氧化酶，接种量为每100ml垃圾糖化液加入15-20g固定化乳酸氧化酶，所述固定化氧化酶的转化pH为
5-7，反应温度为50-60℃，反应时间为3-5小时。
一种提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种提高餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，尤其涉及一种提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法。
背景技术
[0002] 近年来，随着石油能源的日益枯竭和价格的大幅度上涨，生物燃料作为一种环保和可以再生的绿色能源越来越受到各国的重视，生产量不断的增加。燃料乙醇由于其工艺相对简单、且与汽油可以混合而备受关注。利用餐厨垃圾含有大量糖类物质或者可以转化为糖的物质，可通过发酵使其转化为燃料乙醇。专利200610114006.7为一种餐厨垃圾发酵生产燃料乙醇的方法，该方法利用餐厨垃圾在中温条件下（35ºC左右）进行乙醇的生料发酵，可以获得较为理想的乙醇产率。但是餐厨垃圾在储运过程中存在易腐败变臭的缺点，探寻餐厨垃圾的保存和抑菌方式对其资源化利用意义重大。
[0003] 乳酸菌的代谢过程中会产生许多抗菌物质，它们大多是肽或蛋白质，被称为细菌素，可以广泛地抑制革兰氏阳性菌，因此利用乳酸菌加工和保存食品很早就为人所熟知。而已经有学者开展了利用乳酸菌对餐厨垃圾抑菌的研究，专利200910093048.0为一种适用于餐厨垃圾乙醇发酵的乳酸抑菌方法，其方法为将餐厨垃圾进行粉碎处理打浆后，按照0.5%~2%体积质量比向垃圾浆中加入预先培养的乳酸菌液，加入乳酸菌的垃圾浆在30~40℃的厌氧条件下保存1~2天，上述经过乳酸抑菌的垃圾浆液再进行乙醇发酵。虽然该发明可以解决餐厨垃圾的保存问题，同时与其他高温灭菌或者加酸处理具有一定的操作和成本的优势，但是由于乳酸菌也会利用垃圾中的碳源产生乳酸，从而减少了碳源转化为乙醇的量，因此降低了乙醇的产率。如何能同时实现餐厨垃圾抑菌和乙醇产量提高对于餐厨垃圾乙醇发酵意义重大。
[0004] 由于乳酸发酵和乙醇发酵均是从丙酮酸代谢开始，因此从代谢分析的角度，如果将乳酸转化为丙酮酸，进而可以从丙酮酸转化为乙醇，则此举可以实现餐厨垃圾抑菌和提高乙醇产率的双重目的。
发明内容
[0005] 本发明的目的是为了解决利用乳酸菌进行餐厨垃圾抑菌保存过程中乳酸消耗碳源而减少乙醇产量的问题，提出了一种利用抑菌产生的乳酸经丙酮酸再转化为乙醇，从而实现抑菌保存后餐厨垃圾乙醇产率提高的方法。
[0006] 一种提高抑菌保存后餐厨垃圾乙醇发酵产率的方法，包括如下步骤：
[0007] （1）将餐厨垃圾进行分拣，去除不适宜发酵的物质，打浆粉碎后，获得垃圾浆液，接入乳酸菌液，将餐厨垃圾在30~40℃厌氧条件下保存1-2天；
[0008] （2）获得的含有乳酸菌的垃圾浆液按照每克垃圾浆液50-100 酶活力单位接入糖化酶，在50-60℃糖化3-6小时，获得餐厨垃圾浆液；经过固液分离后，留下餐厨垃圾糖化液待用；
[0009] （3） 向餐厨垃圾糖化液中按照每100ml加入15-25克预先获得的固定化乳酸氧化酶，固定化乳酸氧化酶在50-60℃，震荡速度为（150-200 r/min），调节糖化液pH为5-7.2，反应3-6小时；
[0010] （4）将经过转化的糖化液冷却至35-40℃，接入酿酒酵母，进行乙醇发酵。
[0011] 进一步的，所述步骤（2）中糖化酶的酶活力定义为：1g固体酶在40℃、pH4.6条件下，1h内水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需要的酶量，即为1个酶活力单位。
[0012] 进一步的，所述步骤（3）中酶活的情况为，所述固定化乳酸氧化酶的酶活力为60-70 U/g, 酶活的单位定义为；1 min催化乳酸生成1 nmol丙酮酸的酶量为1个酶活力单位(U)。
[0013] 其中，所述步骤（3）中，乳酸氧化酶的固定方法如下：
[0014] （1）菌种的活化及培养
[0015] 耻垢分枝杆菌(Mycobacterim Smegmatis AS 1.0562,购自中科院微生物研究所)进行培养后,培养基组分为甘油3%，蛋白胨0.4%，DL-乳酸1%，维生素B1 0.005%，KH2PO4·H2O0.05%，MgS04 7H2O 0.05%，硫酸亚铁胺0.01%; 250mL三角瓶中装液量50mL，起始pH7.2，培养温度37℃，静置培养4d超声波细胞破壁、冷冻高速离心获得乳酸氧化酶粗酶液；
[0016] （2）乳酸氧化酶的固定化方法
[0017] 首先将20ml乳酸氧化酶酶液与20ml 4%海藻酸钠溶液混合，用注射器缓慢滴入到400mL 0.2mol/L的CaCl2溶液中 ，随后于25℃静置固化2h，过滤洗涤。然后将其加入到
400ml 0.2% 戊二醛溶液中，25℃交联2 h，最后经过滤、洗涤和干燥后得到颗粒状固定化乳酸氧化酶。
[0018] 进一步的，所述步骤（2）中接种乳酸菌抑菌保存的垃圾浆液需要先加入50-100单位的糖化酶进行糖化，糖化时间为4-6小时，然后经过固液分离，取垃圾糖化液作为后续试验。
[0019] 优选的，所述步骤（3）中所使用的乳酸氧化酶为固定化的乳酸氧化酶，接种量为每100ml垃圾糖化液15-20g固定化乳酸氧化酶，其中所述固定化乳酸氧化酶的酶活力为60-70 U/g。
[0020] 优选的所述步骤（3）中固定化氧化酶的转化pH为5-7，其中转速为120-200r/min, 反应温度为50-60℃，反应时间为3-5小时。
[0021] 优选的，所使用的固定化乳酸氧化酶可多次使用。
[0022] 经过上述的方法处理后，可利用接种乳酸菌对餐厨垃圾实现抑菌保存，同时可将抑菌过程中的乳酸转化为丙酮酸，进而提高乙醇的产量，通过该方法利用乳酸氧化酶转化抑菌过程中的乳酸，可以提高乙醇的产量10%-20 %。节约成本。
[0023] 具体实施方式：
[0024] 首先，固定化乳酸氧化酶：
[0025] （1）菌种的活化及培养
[0026] 耻垢分枝杆菌(Mycobacterim Smegmatis AS 1.0562,购自中科院微生物研究所)进行培养后,培养基组分为甘油3%，蛋白胨0.4%，DL-乳酸1%，维生素B1 0.005%，KH2PO4·H2O0.05%，MgS04· 7H2O 0.05%，硫酸亚铁胺0.01%; 250mL三角瓶中装液量50mL，起始pH7.2，培养温度37℃，静置培养4d超声波细胞破壁、冷冻高速离心获得乳酸氧化酶粗酶液。
[0027] （2）乳酸氧化酶的固定化方法
[0028] 首先将20ml乳酸氧化酶酶液与20ml 4%海藻酸钠溶液混合，用注射器缓慢滴入到400mL 0.2mol/L的CaCl2溶液中 ，随后于25℃静置固化2h，过滤洗涤。然后将其加入到
400ml 0.2% 戊二醛溶液中，25℃交联2 h，最后经过滤、洗涤和干燥后得到颗粒状固定化乳酸氧化酶。
[0029] 实施例1
[0030] 1、将餐厨垃圾进行分选、打浆等前处理后，获得垃圾浆液，接入乳酸菌液，将餐厨垃圾在30~40℃厌氧条件下保存1-2天；
[0031] 2 获得的含有乳酸菌的垃圾浆液按照每克垃圾浆液100 酶活力单位接入糖化酶，在55℃糖化4小时，获得餐厨垃糖化浆。经过固液分离后，留下餐厨垃圾糖化液待用；
[0032] 3 向餐厨垃圾糖化液中按照每100ml加入15克预先获得的固定化乳酸氧化酶，其中酶活力为60 U/g，
[0033] 4 固定化乳酸氧化酶在55℃，震荡速度为150 r/min，调节糖化液pH为5，反应4小时；
[0034] 5 将反应后的经过转化的糖化液降温冷却至35℃，接入酿酒酵母，进行乙醇发酵，获得乙醇的浓度为32g/L。
[0035] 对比试验按照实施例1获得了餐厨垃圾糖化液，然后将经过转化的糖化液冷却至35°C，接入酿酒酵母，进行乙醇发酵, 经过测定乙醇的浓度为28.1 g/L；结果表明经过乳酸氧化酶转化的垃圾乙醇产量比未加入乳酸氧化酶的餐厨垃圾乙醇发酵含量高13%。
[0036] 实施例2
[0037] 1、将餐厨垃圾进行前处理后，获得垃圾浆液，接入乳酸菌液，将餐厨垃圾在30~40℃厌氧条件下保存2天；
[0038] 2 获得的含有乳酸菌的垃圾浆液按照每克垃圾浆液100 酶活力单位接入糖化酶，在55℃糖化5小时，获得餐厨垃糖化浆。经过固液分离后，留下餐厨垃圾糖化液待用；
[0039] 3 向餐厨垃圾糖化液中按照每100ml加入20克预先获得的固定化乳酸氧化酶，其中酶活力为60U/g，
[0040] 4固定化乳酸氧化酶在55℃，震荡速度为200 r/min调节糖化液pH为6，反应4小时；
[0041] 5 经过转化的糖化液冷却至35℃，接入酿酒酵母，进行乙醇发酵, 经过测定乙醇的浓度为35.1 g/L。
[0042] 对比试验：
[0043] 1、将餐厨垃圾进行前处理后，获得垃圾浆液，接入乳酸菌液，将餐厨垃圾在30~40℃厌氧条件下保存2天；
[0044] 2 获得的含有乳酸菌的垃圾浆液按照每克垃圾浆液100 酶活力单位接入糖化酶，在50-60℃糖化5小时，获得餐厨垃糖化浆。经过固液分离后，留下餐厨垃圾糖化液待用；
[0045] 3 糖化液冷却至35℃，接入酿酒酵母，进行乙醇发酵。
[0046] 按照对比试验按照实施例2 获得了餐厨垃圾糖化液，然后将经过转化的糖化液冷却至35℃，接入酿酒酵母，进行乙醇发酵, 经过测定乙醇的浓度为28.1 g/L；结果表明经过乳酸氧化酶转化的垃圾乙醇产量为35.1g/L,相差17%。
