慢病毒载体的半稳定生产转让专利
申请号 : CN201180042482.1
文献号 : CN103080322B
文献日 : 2015-01-14
发明人 : C.博沃伦塔 , A.斯托尔纳约洛 , P.里扎尔迪 , F.马维利奥
申请人 : 莫尔梅德股份有限公司
摘要 :
本发明提供新的半稳定包装细胞系以及使用所述半稳定包装细胞系而产生慢病毒载体(LV)的方法。用baculo-AAV杂合系统产生本发明的新方法和包装细胞系，用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定表达，所述系统包含含有侧翼为AAVITR的整合盒的杆状病毒骨架，以及编码rep蛋白的质粒。该系统允许得到HIV-1的结构蛋白和调控蛋白gag/pol和rev的稳定整合。所述系统允许得到包含HIV的结构蛋白和调控蛋白gag/pol和rev的细胞系，用于半稳定LV生产。
权利要求 :
1.一种用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定表达的系统，其由以下组成：i.杂合载体，其包含含有侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架，其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因，第二个编码慢病毒rev和抗生素选择标记，和ii.含有处于启动子控制之下的AAV rep可读框(ORF)的表达质粒。
2.权利要求1的系统，其中所述杂合载体的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子驱动并携带多聚A。
3.权利要求1或2的系统，其中所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV。
4.权利要求1的系统，其中所述启动子是CMV IE启动子。
5.权利要求1的系统，其中所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因。
6.权利要求5的系统，其中所述选择标记是潮霉素抗性基因。
7.权利要求1的系统，其中所述选择标记是克隆在内部核糖体进入位点(IRES)下游。
8.权利要求1的系统，其中所述rep蛋白是rep78。
9.一种由稳定表达慢病毒gag、pol和rev的细胞组成的半稳定慢病毒包装细胞系，其特征在于这类细胞含有稳定整合到其基因组中的侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒，其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因，第二个编码慢病毒rev和抗生素选择标记。
10.权利要求9的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述细胞是选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080或HeLa的人细胞系。
11.权利要求9的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子驱动并携带多聚A。
12.权利要求9的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV。
13.权利要求12的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述启动子是CMV IE启动子。
14.权利要求9的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因。
15.权利要求14的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述选择标记是潮霉素抗性基因。
16.权利要求9-15中任一项的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述选择标记是克隆在内部核 糖体进入位点(IRES)下游。
17.一种用于产生慢病毒载体的方法，其包括：
i.培养权利要求9-16中任一项的半稳定慢病毒包装细胞系，ii.在所述半稳定慢病毒包装细胞系中插入env基因，iii.在所述半稳定慢病毒包装细胞系中插入转移载体。
18.权利要求17的方法，其中所述env基因选自VSV-G env、MLV4070 env、RD114 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、杆状病毒GP64 env或GALV env。
19.权利要求17或18的方法，其中所述env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。
说明书 :
慢病毒载体的半稳定生产
发明领域
[0001] 本发明涉及用于基因治疗的慢病毒载体(LV)的生产。更具体地讲，本发明涉及半稳定慢病毒包装细胞系以及使用杂合杆状-腺伴随病毒(baculo-Adeno associated virus (AAV))载体而制备包装细胞系的方法，用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定整合。
[0002] 背景
[0003] 自从2001年针对AIDS的首次LV I期临床试验之后，研究基于HIV的LV作为基因递送载体的38个I-II期和2个II-III期试验已经经过当局的审查；它们中的3个仍然处于审查中。最大数量的试验包括单基因病，其中的一些具有高发病率，例如库利氏贫血(Cooley’s anemia) β-重型地中海贫血(4个试验)。其次是癌症和感染性疾病，主要是HIV-1感染。通常，I/II期试验中招募的患者数量是有限的，但在III期中则不是。因此迫切需要第2代(基于LTR)和第3代(基于SIN) LV的稳定包装细胞系，以应付LV大规模生产的需要，大量用于未来有希望的III期试验。基于瞬时方案的LV生产在全局应用的安全性、成本和再现性的观点来看确实是不现实的。
[0004] 越来越多的证据显示，新近开发的用于基因治疗的病毒整合载体LV具有广泛应用性，可转导终末分化的或处于周期中的细胞，对维持长期转基因表达是理想的并且比先前畏惧的更安全。在过去20年里对莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV) γ-逆转录病毒载体(γRV)积累的经验指导了LV递送系统的快速发展，其开发起源于克服逆转录病毒不能转导非分裂细胞(non diving cell)的需要。具体地讲，自失活(SIN)转移载体的产生使得在1
人类临床试验中大量使用LV的前景更可行 ，只要发展和优化同样有效的制备方法。然而，与通过若干人类和鼠的市售包装细胞系就可制备的γRV相反，不仅用于研究级、而且用于GMP级的目前的LV生产几乎都通过瞬时转染。该技术昂贵，难以标准化和规模化并且需要大量下游验证试验。此外，与稳定生产相比，在瞬时生产期间可能通过包装和转移载体构建体中病毒序列间的重组而产生的复制型慢病毒(RCL)的风险，是虽罕见但可能性较高的事件。
人类临床试验中大量使用LV的前景更可行 ，只要发展和优化同样有效的制备方法。然而，与通过若干人类和鼠的市售包装细胞系就可制备的γRV相反，不仅用于研究级、而且用于GMP级的目前的LV生产几乎都通过瞬时转染。该技术昂贵，难以标准化和规模化并且需要大量下游验证试验。此外，与稳定生产相比，在瞬时生产期间可能通过包装和转移载体构建体中病毒序列间的重组而产生的复制型慢病毒(RCL)的风险，是虽罕见但可能性较高的事件。
[0005] 用于LV的与逆转录病毒等效的稳定包装细胞系的开发变得更缓慢和更困难，因为，与γ逆转录病毒相反，慢病毒蛋白例如env、蛋白酶和某些辅助蛋白的表达对于人体细胞而言是有毒的。为了克服该问题，在包装细胞的很早期形式中存在的辅助基因，之后在最新一代中被去掉。第一代基于SIV和HIV的LV包装细胞系得自猴Vero，或人COS、HeLa和2-5
293的贴壁细胞 ，其经工程化具有携带极少关键性修饰的慢病毒基因组，例如除去了包装
2-5
信号。事实上gp120 env和大部分辅助基因都保留下来。所得LV滴度非常低 ，而且更重+
要的是这些载体的可能应用必定限制在CD4 T细胞，对于抗AIDS基因治疗方法而言。随后，gp120 env被来源于疱疹性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)取代并且去掉了所有辅助基因，因为已经证明对于有效LV制备而言是可有可无的。为了避免对VSV-G也描述过的毒性，通过各种不同系统，例如Tet、蜕皮素、Rev以及Tet和cumate的组合，有条件地诱导其表达
6
。同样，为了在克隆选择期间降低病毒蛋白酶的毒性效应，已经描述了经Tet以及强力霉
6
素和cumate药物组合诱导的gag-pol基因的有条件的表达 。在所有这些系统中，通过质粒DNA瞬时转染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因，然后药物选择和细胞克隆。
293的贴壁细胞 ，其经工程化具有携带极少关键性修饰的慢病毒基因组，例如除去了包装
2-5
信号。事实上gp120 env和大部分辅助基因都保留下来。所得LV滴度非常低 ，而且更重+
要的是这些载体的可能应用必定限制在CD4 T细胞，对于抗AIDS基因治疗方法而言。随后，gp120 env被来源于疱疹性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)取代并且去掉了所有辅助基因，因为已经证明对于有效LV制备而言是可有可无的。为了避免对VSV-G也描述过的毒性，通过各种不同系统，例如Tet、蜕皮素、Rev以及Tet和cumate的组合，有条件地诱导其表达
6
。同样，为了在克隆选择期间降低病毒蛋白酶的毒性效应，已经描述了经Tet以及强力霉
6
素和cumate药物组合诱导的gag-pol基因的有条件的表达 。在所有这些系统中，通过质粒DNA瞬时转染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因，然后药物选择和细胞克隆。
[0006] 为了实现真实的稳定包装细胞系的一个关键性问题就是选择最好的病毒基因递送载体。大部分研究人员通过质粒DNA瞬时转染而整合gag-pol基因、rev基因和env基2-9 10
因，然后药物选择和细胞克隆 。已知该技术随时间推移而遭受基因沉默和基因损失 ，这二者均可危害包装克隆的长期稳定性。
因，然后药物选择和细胞克隆 。已知该技术随时间推移而遭受基因沉默和基因损失 ，这二者均可危害包装克隆的长期稳定性。
[0007] 已经公开了替代的基因递送载体，尤其是在STAR11和在新近开发的GPRG-TL-2012包装细胞系中，其中通过MLV-穿梭载体将gag基因、pol基因和rev基因整合到HEK293T细胞中。2拷贝重新编码的gag-pol基因稳定地整合在STAR中，而对于GPRG-TL-20则没12
有这类信息 。与转染env基因的STAR相反，在GPRG-TL-20中所有残留病毒基因都通过SIN-MLV而引入。
有这类信息 。与转染env基因的STAR相反，在GPRG-TL-20中所有残留病毒基因都通过SIN-MLV而引入。
[0008] 存在若干系统，允许外源基因组稳定整合到宿主细胞中。Palombo等, 199813公开了杂合杆状病毒-AAV载体，用于专门整合到宿主细胞中。这样的载体看来非常有效，如果它在同一杂合杆状病毒-AVV载体中包含rep 基因的话。该文献中未提到本发明的构建体，更别说提出使用这类系统用于LV生产了。
[0009] 在过去的大约20年里，进行了若干尝试以产生稳定的LV包装细胞系。尽管公开了不同技术，但目前在临床试验中都未使用这些包装细胞系，也没有上市。因此需要用于大规模生产LV的新系统，其是产能有效的并且是安全、成本效果划算和可重复的。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明涉及LV生产领域。若干基因治疗的临床试验正在进行中，使用LV作为基因递送载体。在所有这些试验中，LV的生产仍然基于瞬时方案。
[0012] 本发明提供了产生基于HIV-1的包装细胞系的新策略。这样的策略是基于使用：杂合载体，其包含含有侧翼为AAV反向末端重复序列(ITR)的整合盒的杆状病毒骨架，即所谓的baculo-AAV杂合系统；以及编码rep蛋白的质粒。该系统允许获得HIV-1结构蛋白和调控蛋白gag/pol和rev的稳定整合。本发明的系统包括a) baculo-AAV杂合载体，其特征在于它含有2个表达盒，一个编码慢病毒gag基因和pol基因，另一个编码慢病毒rev基因和选择标记，和b) 编码rep蛋白的质粒。所提出的系统代表递送HIV结构蛋白和调控蛋白的一种新的有利方式，以便用慢病毒结构蛋白稳定而有效地改造宿主细胞。使用该系统，获得仅包含HIV结构蛋白和调控蛋白gag/pol和rev的第一中间体，用于半稳定LV生产，或作为起点，以得到任选包含调控蛋白(Tat)和目标包膜蛋白的第2代和第3代包装细胞系，以及也包含转移载体的生产用细胞系。
[0013] 第一中间体携带以三-顺反子构型表达HIV-1 gag-pol基因和rev基因的2拷贝重组baculo-AAV包装构建体。这样的中间体被称为PK-7并在实施例中称为PK-7。已知是ITR-介导的AAV载体整合所必需的AAV Rep78蛋白的瞬时表达促进了baculo-AAV包装14
载体的基因组整合 。这样的第一中间体对于1年培养物而言显示出具有令人吃惊的遗传稳定性，证明在残留遗传元件的瞬时转染之后的功能性LV的连续生产。另外，在这类细胞中未观察到沉默现象。此外，通过对非编码的基因间转录活性区中的2个串联整合的包装AAV载体的整合位点的精确作图，我们提供了针对可能的危险基因激活的安全性理由，所述危险基因的mRNA可结合到LV中并最终结合到宿主靶细胞中。
载体的基因组整合 。这样的第一中间体对于1年培养物而言显示出具有令人吃惊的遗传稳定性，证明在残留遗传元件的瞬时转染之后的功能性LV的连续生产。另外，在这类细胞中未观察到沉默现象。此外，通过对非编码的基因间转录活性区中的2个串联整合的包装AAV载体的整合位点的精确作图，我们提供了针对可能的危险基因激活的安全性理由，所述危险基因的mRNA可结合到LV中并最终结合到宿主靶细胞中。
[0014] 已开发的基于使用杂合baculo-AAV载体而用于慢病毒gag-pol和rev稳定表达的包装系统被称为“MolPack”。本发明所用的表达系统有利地允许仅在一轮转染和克隆中稳定而安全地引入HIV的结构蛋白(gag/pol)和调控蛋白(rev)。目前用于临床试验的LV生产仍然是基于所有所需蛋白的瞬时转染。相比之下，用本发明表达系统得到的中间体是稳定的，不表现出沉默现象，允许开发LV的半稳定生产并具有经济上的强大优势。事实上，半稳定生产需要减少数量的所转染的构建体，就可获得终产物。另外，也引人注目地发现，使用本发明的半稳定生产，仅用瞬时转染生产中所用DNA量的三分之一就足以得到具有与瞬时产生LV的滴度类似的滴度的LV。此外，减少数量的所转染的构建体，减少了RCL形成的重组事件的可能性，因此使慢病毒颗粒生产更安全。因此，本发明的表达系统、半稳定包装细胞系和生产方法对于目前用于临床试验的工具和方法而言非常有利。
[0015] 发明叙述
[0016] 依照本发明的第一方面，提供用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定表达的系统，其由以下组成：
[0017] i. 杂合载体，其包含含有侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架，其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因，第二个编码慢病毒rev和选择标记，和
[0018] ii. 含有处于启动子控制之下的AAV rep可读框(ORF)的表达质粒。
[0019] 优选所述杂合载体的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动，优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV，更优选所述启动子是CMV IE启动子。
[0020] 优选所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因，更优选所述选择标记是潮霉素抗性基因。
[0021] 更优选所述选择标记是克隆在内部核糖体进入位点(IRES)下游。
[0022] 依照本发明另一方面，提供由稳定表达慢病毒gag、pol和rev的细胞组成的半稳定慢病毒包装细胞系，其特征在于这类细胞含有稳定整合到其基因组中的侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒，其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因，第二个编码慢病毒rev和选择标记。
[0023] 优选所述细胞是优选选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080或HeLa的人细胞系，更优选所述细胞系是HEK293-T。
[0024] 优选所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动；优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV，更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。
[0025] 优选所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；更优选所述选择标记是潮霉素抗性基因。更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。
[0026] 优选所述AAV rep蛋白选自rep78或rep68。更优选rep蛋白是rep78。
[0027] 依照另一方面，提供产生慢病毒载体的方法，其包括：
[0028] i. 培养由稳定表达慢病毒gag、pol和rev的细胞组成的半稳定慢病毒包装细胞系，其特征在于这类细胞含有稳定整合到其基因组中的侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒，其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因，第二个编码慢病毒rev和选择标记，
[0029] ii. 在所述半稳定包装细胞系中插入env基因，
[0030] iii. 在所述半稳定包装细胞系中插入转移载体。
[0031] 优选所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动；优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV，更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。
[0032] 优选所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；更优选所述选择标记是潮霉素抗性基因。更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。
[0033] 可使用AAV载体、逆转录病毒载体、稳定质粒整合或同源重组，将包膜蛋白插入到宿主细胞中。优选使用质粒，通过瞬时转染而插入env基因。
[0034] 优选所述env基因选自VSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物，更优选所述env基因是编码RD114-TR的基因。
[0035] 优选用SIN慢病毒载体插入所述转移载体。
[0036] 发明详述
[0037] 将以非限制性实施例的方式描述本发明优选特征和实施方案的详细描述。
[0038] 除非另有说明，否则本领域技术人员可使用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术将本发明付诸实施。所有这些技术都是已发表的文献中公开的和解释过的。参见例如J. Sambrook, E. F. Fritsch和T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, 第1-3部, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F.M.等(1995和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology, 第9,
13和16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；Current Protocols in Immunology, 第12章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree和A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J. M. Polak和James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice；
Oxford University Press；M. J. Gait (编著), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press；以及，D. M. J. Lilley和J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press。所有这些出版物都通过引用而结合。
13和16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；Current Protocols in Immunology, 第12章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree和A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J. M. Polak和James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice；
Oxford University Press；M. J. Gait (编著), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press；以及，D. M. J. Lilley和J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press。所有这些出版物都通过引用而结合。
[0039] Baculo-AAV杂合系统
[0040] 本发明提供用于产生基于HIV-1的包装细胞系的新策略。LV生产系统的优化是基于LV技术的基因治疗药物开发所需要解决的一个关键性问题。尽管越来越多的临床试验使用该技术，但是在这些试验中LV仍然是使用瞬时转染方案而产生的。按此方式，LV的生产仍然非常昂贵，不能令更大量患者满意。为此，进行了大量努力以开发用于LV的稳定包装细胞系。在稳定慢病毒包装细胞系开发中的一个关键性问题就是选择正确的载体，用于改造宿主细胞。在很多情况下，用质粒来改造宿主细胞，但在这种情况下，还观察到基因组不稳定和基因沉默现象。在另外两种情况下，逆转录病毒载体用于稳定整合gag/pol基因和rev基因。迄今为止所开发的稳定包装细胞系都未用于临床。
[0041] 本发明的策略是基于使用稳定表达慢病毒的HIV结构蛋白和调控蛋白的系统，所述系统由以下组成：杂合载体，其包含含有侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架，其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因，第二个编码慢病毒rev和选择标记；以及含有处于启动子控制之下的AAV rep ORF的表达质粒。杆状病毒骨架的存在允许携带大而复杂的整合盒，所述整合盒包含编码若干不同蛋白的2个表达盒。所得baculo-AAV包装载体允许仅通过一次感染事件就用稳定而有效产生LV所需的病毒蛋白来改造宿主细胞。
[0042] 通过AAV rep蛋白的瞬时表达而获得baculo-AAV包装载体的基因组整合。该系统允许获得在非编码的基因间转录活性区中的AAV载体的整合，因此排除了危险基因的激活，所述危险基因的mRNA可结合到LV中并最终结合到宿主靶细胞中。
[0043] 所提出的系统代表用慢病毒结构蛋白和调控蛋白稳定而有效地改造宿主细胞的一种新的有利方式。
[0044] 在一个优选的实施方案中，baculo-AAV包装构建体中包含的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动，优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV，更优选所述启动子是CMV IE启动子。依照本发明的优选方面，AAV包装载体中包含的选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；优选所述标记是潮霉素抗性基因；更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。
[0045] 通过AAV Rep蛋白的瞬时表达而获得baculo-AAV包装载体的基因组整合，用于ITR-介导的AAV载体整合。在一个优选的实施方案中，rep蛋白选自rep78和rep68，更优选所述蛋白是rep78。
[0046] 使用该系统，可获得经改造而稳定表达HIV-1蛋白gag/pol和rev的细胞，这类细胞称为半稳定包装细胞系。具体地讲，本发明公开并要求保护这样的经改造的细胞以及它们在半稳定LV生产中的用途。
[0047] 半稳定包装细胞系
[0048] 本发明的半稳定包装细胞系由携带表达HIV-1 gag-pol基因和rev基因的至少一个拷贝的重组baculo-AAV包装构建体的宿主细胞组成。通过AAV rep蛋白的瞬时表达而得到baculo-AAV包装载体的基因组整合，以获得ITR-介导的AAV载体整合。优选所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动，优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV。更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。
[0049] 依照本发明的优选方面，所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；优选所述选择标记是潮霉素抗性基因。更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。
[0050] 优选所述AAV rep蛋白选自rep78和rep68。更优选rep蛋白是rep78。可经改造而得到半稳定包装细胞系的宿主细胞系是选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080或HeLa的人细胞系，更优选所述细胞系是HEK293-T。
[0051] 这样的半稳定包装细胞系适合于利用半稳定生产系统中的不同env和不同转移载体输出可能的多种LV。因此，它代表了更有效的LV生产的极大优势，因为它允许降低成本，它无需使用编码gag-pol和rev的GMP级的质粒DNA，并且降低了瞬时转染期间质粒间重组事件所致的RCL形成的风险。半稳定包装细胞系是一种通用工具，并且与目前用于临床试验的其它工具相比，用于LV生产更安全而经济。
[0052] 本发明的半稳定包装细胞系对于1年培养物而言显示出具有令人吃惊的遗传稳定性，证明在残留遗传元件的瞬时转染之后的功能性LV的连续生产。另外，事实上未观察到沉默现象，用该中间体而得到的LV的滴度和感染性在1年之后仍然未受影响。在选择压力存在或不存在的情况下都证实了这样的数据。值得注意的是，对于AAV-ITR介导的盒的整合稳定性而言，文献中没有可用的类似数据。唯一相关的信息是感染了野生型AAV血清型2 (AVV-2)的人骨髓衍生的成纤维细胞样细胞系(Ruddle’s Detroit 6细胞)以潜伏状态保持病毒序列达至少47和118代。正如实施例所示，本发明的半稳定包装细胞系存活至少102代。
[0053] 因此，本发明提供LV的生产方法，其包括：
[0054] i. 如上所述地培养半稳定包装细胞系，
[0055] ii. 在所述半稳定包装细胞系中插入env基因，
[0056] iii. 在所述半稳定包装细胞系中插入转移载体。
[0057] 可使用AAV载体、逆转录病毒载体、稳定质粒整合或同源重组，将包膜蛋白插入到宿主细胞中。优选使用质粒，通过瞬时转染而插入env基因。
[0058] 优选所述env基因选自VSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。更优选本发明使用嵌合包膜蛋白RD114-TR env，其中RD114的胞质尾已被MLV包膜的胞质尾替代。
[0059] 优选用SIN-LV插入所述转移载体。
[0060] 本发明的半稳定包装细胞系能够生产LV，按照感染性来说其在“质量上”等同于通过瞬时转染而产生的那些。在LV半稳定生产应用中要考虑的一个非常重要的问题是半稳定包装细胞系不丢失容易转染的能力。事实上，以亲代细胞系HEK293T的同样水平，转染PK-7细胞。该特征在用包装构建体对HEK293细胞进行遗传修饰和克隆之后经常丢失。相比之下，在本发明中用于gag/pol和rev稳定整合的表达系统对于半稳定包装细胞系转染性而言不导致任何问题。
[0061] 此外，半稳定包装细胞系及其在LV生产方法中的用途对于生产成本而言具有重要优势。具体地讲，对于第2代LV生产而言，仅需要3个额外构建体，例如质粒(各自编码tat、env和转移载体)，或者对于第3代LV生产而言，仅需要2个构建体(各自编码env和转移载体)。相比之下，目前用于临床试验的GMP方法除了用于本发明半稳定包装细胞系的那些之外，还需要使用2个额外构建体，分别编码gag/pol和rev。
[0062] 此外，减少数量的用本发明方法和工具转染的构建体，也代表了额外优势，对于LV的安全性而言，如上所述。
[0063] 此外，还显而易见地发现，使用本发明的半稳定生产，仅用瞬时转染生产中所用DNA总量的三分之一就足以得到具有与瞬时产生慢病毒滴度类似的滴度的慢病毒。因此，本发明的表达系统、半稳定包装细胞系和生产方法对于目前用于临床的工具和方法而言非常有利。
[0064] 附图描述
[0065] 图1. RD-MolPack的开发流程。(a) 用于该研究的DNA质粒示意图。pPolh, 多角体蛋白启动子；attB1, 连接B1；ITR, 反向末端重复序列；CMV, 巨细胞病毒启动子；In, 内含子；RRE, rev应答元件；A, 多聚A序列；IRES, 内部核糖体进入位点；SD, 剪接供体；SA, 剪接受体；ψ,包装信号；WPRE, 土拨鼠肝炎转录后调节元件；cPPT, 中央聚嘌呤序列(central polypurine tract)；hPGK, 人磷酸甘油激酶启动子。(b) AAV-GPR载体的Rep78-介导的基因组整合的图。AAV Rep78促进了侧翼为ITR的AAV-GPR盒的切除并有利于其整合到人染色体中。(c) 半稳定包装细胞系的生产流程图。GOI,目标基因。
[0066] 图2. PK克隆的表征。(a) AAV-GPR载体整合的DNA印迹分析。为了确定盒的拷贝数和完整性，将来自PK克隆的基因组DNA (10 μg)分别用2种不同限制酶BamHI和SnaBI消化。(b) 从GPR盒产生的病毒蛋白的蛋白印迹分析。左图，将得自PK克隆的细胞提取物(50 μg/道)与识别HIV-1蛋白的抗HIV人血清杂交。然后将膜与抗rev特异性Ab杂交。右图，与细胞提取物相同地，对产自PK克隆的病毒样颗粒(VLP)的30 ng p24gag-等同物(equivalent)进行处理。(c) 通过LM-PCR技术对GPR-盒整合进行示意性作图，该技术鉴定2号染色体长臂在2q32.1位置上的DNA断裂点。(d) AAV-GPR盒和人Hox4基因共定位到2号染色体中。进行PK-7中期染色体原位杂交，分别使用gag-特异性(红色)探针和Hox4-特异性(绿色)探针。(e) 在PK-7克隆中的2个GPR整合盒的重排和它们的尾-头方向的示意图。
[0067] 图3.关于baculo-AAV-GPR和Rep78的可能整合的对照实验。(a)重组杆状病毒-AAV DNA的DNA印迹分析。从杆状病毒颗粒中提取DNA，用MluI限制酶消化过夜，印迹之后，用11-kb GPR盒特异性探针来探测。将Entry-GPR质粒(1 pg)和杆状病毒空DNA (100 ng)上样，分别作为阳性和阴性对照。(b) 检测整合到PK-7细胞中的推定的残余rep78质粒DNA。进行Rep78特异性PCR，使用PK-7基因组DNA作为样品模板，使用CMV-rep78 (1 pg)质粒作为阳性对照。实施例
[0068] 实施例I: 通用方法
[0069] 质粒
[0070] 通过MluI/NarI和MluI/NotI消化，分别从pCG719-pKLgagpol质粒(以下简称CMV-GPR) (图1a, 图例9)和pCG720-pKrev质粒(CMV-Rev) (图1a, 图例5)切下野生型25
HIV-1 gag基因、pol基因和rev基因 。在2个不同的表达盒中以尾-尾的方向将病毒基因插入到Gateway® pENTR™4穿梭载体(Invitrogen, Co., Carlsbad, CA)中，每个盒都由CMV IE启动子驱动并携带多聚A序列。第一盒表达gag基因和pol基因，而第二盒表达rev基因和选择标记潮霉素抗性(hygro)基因；hygro是克隆在IRES下游，以允许双-顺反子翻译。将2个表达单元引入携带有感染性AAV基因组的重组pSUB201质粒的XbaI位点
17
中 。再切下所得5’ITR-CMV-gagpol-polyA-polyA-hygro-IRES-rev-CMV-ITR3’盒并插入到Gateway®pENTR™4穿梭载体(Invitrogen, Co., Carlsbad, CA)中。通过含有2个盒的pENTR™4穿梭进入载体和BaculoDirect Linear DNA (BaculoDirect™杆状病毒表达系统，Invitrogen, Co.)之间的噬菌体λ位点-特异性重组系统，获得重组杂合baculo-AAV包装载体(baculo-AAV-GPR) (图1a, 图例1)。在同源重组期间，杆状病毒DNA的多角体蛋
18
白基因因此被GPR双盒取代。如Recchia等, 2004 所述，通过克隆处于表达载体pABS.43的CMV IE启动子之下的AAV-rep78 ORF，得到pABCMV-rep78表达质粒(CMV-AAV-rep78)
19
(图1a, 图例4)。pMD.G质粒(CMV-VSV-G) 编码疱疹性口炎包膜糖蛋白(VSV-G) (图
20
1a, 图例6)。第3代转移载体pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp (SIN-eGFP) 表达处在组成型启动子hPGK之下的eGFP基因(图1a, 图例2)。表达抗HIV-1 Chim3转基因的
21,22
第2代PΔN-Chim3转移载体描述于Porcellini等, 2009 & 2010 (图1a, 图例3)。
pCMV-RD114-TR (CMV-RD114-TR) (图1a, 图例7)质粒编码嵌合RD114-TR包膜，其由猫科内源逆转录病毒RD114包膜的胞外和跨膜结构域以及A-MLVenv 4070A的胞质尾(TR)构成
23
。第2代包装pCMV-ΔR8.74 (CMV-GPRT)构建体(图1a, 图例8)编码HIV-1 gag基因、
19
pol基因、rev基因和tat基因 。
HIV-1 gag基因、pol基因和rev基因 。在2个不同的表达盒中以尾-尾的方向将病毒基因插入到Gateway® pENTR™4穿梭载体(Invitrogen, Co., Carlsbad, CA)中，每个盒都由CMV IE启动子驱动并携带多聚A序列。第一盒表达gag基因和pol基因，而第二盒表达rev基因和选择标记潮霉素抗性(hygro)基因；hygro是克隆在IRES下游，以允许双-顺反子翻译。将2个表达单元引入携带有感染性AAV基因组的重组pSUB201质粒的XbaI位点
17
中 。再切下所得5’ITR-CMV-gagpol-polyA-polyA-hygro-IRES-rev-CMV-ITR3’盒并插入到Gateway®pENTR™4穿梭载体(Invitrogen, Co., Carlsbad, CA)中。通过含有2个盒的pENTR™4穿梭进入载体和BaculoDirect Linear DNA (BaculoDirect™杆状病毒表达系统，Invitrogen, Co.)之间的噬菌体λ位点-特异性重组系统，获得重组杂合baculo-AAV包装载体(baculo-AAV-GPR) (图1a, 图例1)。在同源重组期间，杆状病毒DNA的多角体蛋
18
白基因因此被GPR双盒取代。如Recchia等, 2004 所述，通过克隆处于表达载体pABS.43的CMV IE启动子之下的AAV-rep78 ORF，得到pABCMV-rep78表达质粒(CMV-AAV-rep78)
19
(图1a, 图例4)。pMD.G质粒(CMV-VSV-G) 编码疱疹性口炎包膜糖蛋白(VSV-G) (图
20
1a, 图例6)。第3代转移载体pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp (SIN-eGFP) 表达处在组成型启动子hPGK之下的eGFP基因(图1a, 图例2)。表达抗HIV-1 Chim3转基因的
21,22
第2代PΔN-Chim3转移载体描述于Porcellini等, 2009 & 2010 (图1a, 图例3)。
pCMV-RD114-TR (CMV-RD114-TR) (图1a, 图例7)质粒编码嵌合RD114-TR包膜，其由猫科内源逆转录病毒RD114包膜的胞外和跨膜结构域以及A-MLVenv 4070A的胞质尾(TR)构成
23
。第2代包装pCMV-ΔR8.74 (CMV-GPRT)构建体(图1a, 图例8)编码HIV-1 gag基因、
19
pol基因、rev基因和tat基因 。
[0071] 细胞
[0072] 在27℃，在不存在CO2的条件下，将草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda, Sf9)昆虫细胞(Invitrogen, Co.)悬浮培养在补充有10% FCS (EuroClone Ltd, UK)和青霉素-链霉素和谷氨酰胺组合(PSG)的TC-100培养基(Invitrogen, Co.)中。将人胚肾293T (HEK293T)细胞及其衍生克隆(PK-7)在补充有10% FCS和PSG的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中繁殖。将CEM A3.01和SupT1 T类淋巴母细胞在补充有10% FCS和PSG的RPMI 1640中培养。从在Ficoll-Hypaque梯度(Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, +
Oslo, Norway)上离心的脐带血(UCB)中纯化CD34 造血干细胞(HSC)和新生儿白细胞。经梯度分离之后，从收集的UCB单核细胞环中通过阳性选择，使用CD34 MicroBeads试剂盒和+
MiniMACS Separator 柱(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA)，分离CD34 HSC。通过FACS分析(FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA)和FlowJo软件(Tree Star, Inc., TM +
Ashland, OR)，使用抗CD34-PE Ab (BD Pharmingen , San Diego, CA)，测定CD34 细胞纯度(>92%)。在含有人干细胞因子(h-SCF) 100 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN)、h-Flt3L 100 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ)、h-IL-6 20ng/ml (R&D Systems)和人血小板生成素(h-Tpo) 20 ng/ml (Peprotech)的20%血清Iscove氏改良Dulbecco氏培养+
基(IMDM)中，对CD34 细胞预刺激24小时，并在转导期间维持在同一培养基中。用可溶性抗人CD3 (30 ng/ml) (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK)和重组人IL-2 (rhIL-2)
50 U/ml (Chiron, Emeryville, CA)的RPMI对新生儿白细胞刺激48小时，然后将其保持在补充有10% FCS、PSG和rhIL-2的RPMI中。
Oslo, Norway)上离心的脐带血(UCB)中纯化CD34 造血干细胞(HSC)和新生儿白细胞。经梯度分离之后，从收集的UCB单核细胞环中通过阳性选择，使用CD34 MicroBeads试剂盒和+
MiniMACS Separator 柱(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA)，分离CD34 HSC。通过FACS分析(FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA)和FlowJo软件(Tree Star, Inc., TM +
Ashland, OR)，使用抗CD34-PE Ab (BD Pharmingen , San Diego, CA)，测定CD34 细胞纯度(>92%)。在含有人干细胞因子(h-SCF) 100 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN)、h-Flt3L 100 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ)、h-IL-6 20ng/ml (R&D Systems)和人血小板生成素(h-Tpo) 20 ng/ml (Peprotech)的20%血清Iscove氏改良Dulbecco氏培养+
基(IMDM)中，对CD34 细胞预刺激24小时，并在转导期间维持在同一培养基中。用可溶性抗人CD3 (30 ng/ml) (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK)和重组人IL-2 (rhIL-2)
50 U/ml (Chiron, Emeryville, CA)的RPMI对新生儿白细胞刺激48小时，然后将其保持在补充有10% FCS、PSG和rhIL-2的RPMI中。
[0073] HEK293T细胞的杆状病毒生产和杆状-GPR感染
[0074] 按照BaculoDirect方法，使用Gateway® adapted杆状病毒DNA系统(Invitrogen, Co.)，产生携带重组杂合baculo-AAV-GPR DNA基因组的杆状病毒。通过噬斑测定评价11
重组杆状病毒滴度，病毒在Sf9细胞中扩增3代之后相当于1 × 10 pfu/ml。通过
6
用4 μg AAV-rep78表达质粒转染1.5 × 10 HEK293T细胞并在24小时之后用重组baculo-AAV-GPR以1,000的MOI感染而得到PK-7克隆。在没有潮霉素时将细胞维持4天，
5
然后在潮霉素(100 μg/ml)存在下，以系列稀释浓度，将5 × 10 细胞接种在22个10-cm
4
皿中。通过ELISA对22个皿筛选p24gag的产生。仅有以3.7 × 10 细胞/皿接种细胞的一个皿在上清液中释放出足够的p24gag。该皿含有40个集落，将其全部挑取出来并筛选。
它们中的3个记为p24gag产生阳性，对其进行进一步表征。
重组杆状病毒滴度，病毒在Sf9细胞中扩增3代之后相当于1 × 10 pfu/ml。通过
6
用4 μg AAV-rep78表达质粒转染1.5 × 10 HEK293T细胞并在24小时之后用重组baculo-AAV-GPR以1,000的MOI感染而得到PK-7克隆。在没有潮霉素时将细胞维持4天，
5
然后在潮霉素(100 μg/ml)存在下，以系列稀释浓度，将5 × 10 细胞接种在22个10-cm
4
皿中。通过ELISA对22个皿筛选p24gag的产生。仅有以3.7 × 10 细胞/皿接种细胞的一个皿在上清液中释放出足够的p24gag。该皿含有40个集落，将其全部挑取出来并筛选。
它们中的3个记为p24gag产生阳性，对其进行进一步表征。
[0075] 慢病毒载体(LV)的产生和测定
[0076] 通过以下质粒的瞬时共转染，获得从HEK293T细胞产生的假型LV：包装构建体CMV-GPR (第3代) [或CMV-GPRT (第2代)]、VSV-G或RD114-TR包膜构建体和第3代24 21
SIN-eGFP 或第2代PΔN-Chim3转移载体 。包装:包膜:转移载体比例为6.5:3.5:10 μg DNA，除非另有说明。通过表达env的质粒和转移载体的共转染，从PK-7克隆产生LV。用标准++ TM
Ca -磷酸盐方法或Fugene 6系统，按照制造商的说明(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)进行瞬时转染，得到类似结果。转染后48小时收获上清液并通过
0.45-μm滤器过滤。根据实验类型，对SupT1、CEM A3.01、原代活化外周血单核细胞(PBMC)+
和脐带血衍生的CD34 HSC计算滴度。简而言之，通过由过夜静止阶段分开的2次循环的离心接种(1,240 × g , 1小时)，在polybrene (8 μg/ml) (Sigma-Aldrich, St Louis, +
MO)存在下，转导SupT1和活化的原代单核细胞；将CD34 HSC在不含polybrene的包被retronectin的板(Takara Bio, Otsu, Japan)上转导24小时。通过eGFP表达(SIN-eGFP)或ΔLNFGR表达(PΔN-Chim3)的流式细胞术分析(FACS Calibur BD Bioscience, San
21,22
Jose, CA)监测转导效率，如Porcellini等, 2009 & 2010 所述，使用FlowJo软件(Tree Star, Inc., Ashland, OR)。仅范围5-20%阳性细胞的转导值用于计算每种LV制备物的滴度，按照以下公式：TU = [细胞数× (% GFP/100)]/上清液体积(以ml计)。
SIN-eGFP 或第2代PΔN-Chim3转移载体 。包装:包膜:转移载体比例为6.5:3.5:10 μg DNA，除非另有说明。通过表达env的质粒和转移载体的共转染，从PK-7克隆产生LV。用标准++ TM
Ca -磷酸盐方法或Fugene 6系统，按照制造商的说明(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)进行瞬时转染，得到类似结果。转染后48小时收获上清液并通过
0.45-μm滤器过滤。根据实验类型，对SupT1、CEM A3.01、原代活化外周血单核细胞(PBMC)+
和脐带血衍生的CD34 HSC计算滴度。简而言之，通过由过夜静止阶段分开的2次循环的离心接种(1,240 × g , 1小时)，在polybrene (8 μg/ml) (Sigma-Aldrich, St Louis, +
MO)存在下，转导SupT1和活化的原代单核细胞；将CD34 HSC在不含polybrene的包被retronectin的板(Takara Bio, Otsu, Japan)上转导24小时。通过eGFP表达(SIN-eGFP)或ΔLNFGR表达(PΔN-Chim3)的流式细胞术分析(FACS Calibur BD Bioscience, San
21,22
Jose, CA)监测转导效率，如Porcellini等, 2009 & 2010 所述，使用FlowJo软件(Tree Star, Inc., Ashland, OR)。仅范围5-20%阳性细胞的转导值用于计算每种LV制备物的滴度，按照以下公式：TU = [细胞数× (% GFP/100)]/上清液体积(以ml计)。
[0077] DNA印迹测定
[0078] 通过QIAamp Mini试剂盒(QIAGEN GmbH, Germany)，按照制造商的说明，分离基因组DNA (gDNA)。通过QIAamp DNA micro试剂盒(QIAGEN)从病毒颗粒中提取杆状病毒DNA。用指定限制酶消化过夜之后，将10 μg gDNA在0.8%琼脂糖凝胶上运行，通过DNA印6
迹毛细管转移到尼龙膜(Duralon, Stratagene, TX, USA)上，然后杂交到1 × 10 dpm/
32
ml P-随机引物标记的600-bp CMV或11-kb GPR盒。
迹毛细管转移到尼龙膜(Duralon, Stratagene, TX, USA)上，然后杂交到1 × 10 dpm/
32
ml P-随机引物标记的600-bp CMV或11-kb GPR盒。
[0079] 分析性PCR分析
[0080] 对300 ng基因组gDNA进行PCR分析，用于筛选残余整合到PK-7细胞中的AAV-Rep78质粒，使用一组引物：AAV-Rep78正向: 5’-CGG GCT GCT GGC CCA CCA GG-3’；AAV-Rep78 反向: 5’-ATG CCG GGG TTT TAC GAG ATT GTG-3’和以下PCR条件：98℃ 7分钟，30个循环的94℃ 30秒，66℃ 30秒，和72℃ 1.5分钟。
[0081] 为了确定2个GPR盒的方向，对300 ng gDNA进行PCR扩增，使用一组引物：rev 正向: 5’- CTT GAG GAG GTC TTC GTC GC-3’；β-球蛋白反向: 5’- CCC TGT TAC TTC TCC CCT TCC -3’；rev 正向巢式: 5’- TGT CTC CGC TTC TTC CTG CC-3’；β-球蛋白巢式反向: 5’- TTA ACC ATA GAA AAG AAG GGG-3’和以下条件：94℃ 2分钟，35个循环的94℃ 30秒，52℃ 30秒，和72℃ 1.5分钟。
[0082] p24gag ELISA
[0083] 使 用 Alliance HIV-1 p24 抗 原 ELISA试 剂 盒 (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc. Waltham, MA)，按照制造商的说明，在培养上清液中测量实际4
的LV生产，假定1 pg p24gag相当于1 × 10 实际的颗粒。
的LV生产，假定1 pg p24gag相当于1 × 10 实际的颗粒。
[0084] 蛋白印迹分析
[0085] 如前所述21,22，制备来自PK-7细胞的全细胞提取物和核提取物以及来自分离的无细胞VLP或LV的病毒蛋白。通过SDS-PAGE将蛋白按大小分级，并且电印迹到Hybond ECL硝基纤维素膜(GE Healthcare, Life Sciences, UK Ltd, UK)。将膜在5%低脂奶粉中封闭，然后与合适的第一Ab一起温育。使用得自AIDS患者的1: 2,000稀释度的抗HIV血清；1:200稀释度的HIV-1 rev MoAb (Rev-6, sc-69730 S. Cruz Biotechnology, Inc., S. Cruz, CA)。通过增强化学发光系统ECL (ECL, Amersham)，按照制造商的说明，显示Ab结合。
[0086] 通过实时TaqMan PCR对LV DNA拷贝数进行定量测定
[0087] 通过定量TaqMan PCR，使用ABI Prism 7,900 FAST仪器(Applied Biosystems, Foster City, CA)确定整合GPR载体的拷贝数，并通过SDS 2.3软件(Applied Biosystems)进行分析。扩增基因组DNA (gDNA)，使用以下引物和来源于gag基因的探针：正向: 5’-ACA TCA AGC AGC CAT GCA AAT-3’；反向: 5’-ATC TGG CCT GGT GCA ATA GG-3’；探针: FAM 5’-CAT CAA TGA GGA AGC TGC AGA ATG GGA TAG A-3’ TAMRA。PCR条件如下： 50℃ 2分钟， 95℃ 5分钟，接着是40个循环的95℃ 15秒和60 ℃ 15秒，增量为0.1℃/循环。
[0088] 连接-介导的(LM)-PCR
[0089] 通过QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)，按照制造商的说明，从PK-7细胞中提取基因组DNA并用BglII和BamHI在37℃消化过夜。在标准条件下，对与5’-GATC-3’粘性末端相容的人工接头76-bp寡核苷酸接头进行连接。进行LM-PCR，使用以下一对巢式引物: ITR正向: 16s: 5’-GTA GCA TGG CGG GTT AAT CA-3’,和17s/长巢式: 5’-TTA ACT ACA AGG AAC CCC TAG TGA TGG-3’；接头反向引物: 接头-1: 5’-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3’和接头-2 巢式: 5’-AGG GCT CCG CTT AAG GGA C-3’。接头序列对应于5’-GAT CGT CCC TTA AGC GGA GCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA CCA GGG AAT TCG CCT CGG GAT ATC ACT CAG CAT AAT G-3’。进行2轮LM-PCR，使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)，每轮包括30个循环(95℃ 30秒, 52℃ 30秒, 72℃ 2分钟)。克隆PCR扩增子，使用TOPO®克隆试剂盒(Invitrogen, Co.)并选择携带大约100-200-bp插入序列的质粒集落，用于测序。通过BLAST搜索(NCBI)鉴定序列同源性。
[0090] 荧光原位杂交(FISH)
[0091] 用秋水仙素(10 μg/ml) (Sigma # C9754)在37℃处理PK-7细胞2小时，得到中期染色体。经磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤之后，将细胞在低渗溶液(75 mM KCl)中在室温下(RT)保持6分钟，用甲醇/乙酸(3:1)洗涤4次而固定，然后铺在干净载玻片上。将细胞遗传学样品在70%甲酰胺溶液中在72℃变性2分钟，经冷的70%、85%和95%乙醇连续洗涤而脱水，然后风干。特异性探针制备如下：将含有13-kb质粒DNA的GPR盒做上标记，使用随机引物DNA标记试剂盒(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)，TM
用SpectrumOrange -dUTP (Vysis, Inc., Downers Grove, IL)，同时将含有人hox4TM
基因的对照30-kb粘粒DNA做上标记，使用FISHBright 核酸标记试剂盒(Kreatech Biotechnology, Amsterdam, The Netherlands)。通过将5 ng/μl的各种探针在250 μl 50%甲酰胺, 2 × SSC和10%硫酸葡聚糖和50 ng/μl的人C0T-1 DNA杂交缓冲液(Invitrogen)中温育而进行杂交。将样品在75℃用变性探针包被10分钟，覆盖Parafilm®M，并在37℃在湿室内温育过夜。将样品在0.4 × SSC (pH=7)中在72℃洗涤一次，达2分钟，在含有0.0025%吐温-20的4 × SSC (pH=7)中在室温下洗涤一次，达30秒，然后在PBS 1 ×中在室温下洗涤2次，每次达1分钟。将玻片用0.02 μg/μl 49,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (Sigma)进行复染色。用Nikon 80i正置显微镜(Nikon Instruments S.p.A., Italy)观察并拍摄图像，使用绿色(FITC)和光谱橙色(spectrum orange)滤光片照明。图像用Genikon软件(Nikon)处理。
用SpectrumOrange -dUTP (Vysis, Inc., Downers Grove, IL)，同时将含有人hox4TM
基因的对照30-kb粘粒DNA做上标记，使用FISHBright 核酸标记试剂盒(Kreatech Biotechnology, Amsterdam, The Netherlands)。通过将5 ng/μl的各种探针在250 μl 50%甲酰胺, 2 × SSC和10%硫酸葡聚糖和50 ng/μl的人C0T-1 DNA杂交缓冲液(Invitrogen)中温育而进行杂交。将样品在75℃用变性探针包被10分钟，覆盖Parafilm®M，并在37℃在湿室内温育过夜。将样品在0.4 × SSC (pH=7)中在72℃洗涤一次，达2分钟，在含有0.0025%吐温-20的4 × SSC (pH=7)中在室温下洗涤一次，达30秒，然后在PBS 1 ×中在室温下洗涤2次，每次达1分钟。将玻片用0.02 μg/μl 49,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (Sigma)进行复染色。用Nikon 80i正置显微镜(Nikon Instruments S.p.A., Italy)观察并拍摄图像，使用绿色(FITC)和光谱橙色(spectrum orange)滤光片照明。图像用Genikon软件(Nikon)处理。
[0092] 实施例II: 第一中间体PK-7克隆的产生
[0093] 为了得到RD-MolPack包装细胞系用于第2代或第3代LV的连续生产，获得若干HEK293T-衍生的中间体克隆。第一个称为PK-7，是通过重组杂合baculo-AAV载体(rhBaculo-AAV-GPR)的方式，通过HIV-1 gag基因、pol基因和rev基因的稳定整合而获得(图1a, 图例1)。该递送系统利用瞬时提供的AAV-rep78蛋白整合酶活性，切取侧翼为AAV ITR的整合盒并将其整合到人染色体中(图1b)。通过BaculoDirect Linear DNA和含有TM侧翼为ITR的GPR盒的Gateway® pENTR 4进入质粒之间的同源重组而产生rh-baculo-AAV载体(图1a, 图例1)。重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中扩增3轮(p3)之后，分别通过噬斑测定和病毒基因组DNA的DNA印迹检查杂合baculo-AAV DNA的滴度和潜在重组事件。在
10
p3的滴度相当于6 × 10 pfu/ml，DNA印迹分析显示一条清晰条带，表明在病毒扩增过程中没有重组事件(图3)。
10
p3的滴度相当于6 × 10 pfu/ml，DNA印迹分析显示一条清晰条带，表明在病毒扩增过程中没有重组事件(图3)。
[0094] 然后，仔细限定AAV-Rep78质粒转染和rh-baculo-AAV感染的剂量和时间，以及感染的HEK293T细胞的克隆条件(图1c)。事实上，对这些实验设定的选择证明是至关重要的。因此，在测试宽范围的条件之后，最终确定在rh-baculo-AAV以1,000的MOI感染之前24小时，单剂量AAV-rep78质粒DNA转染相当于最佳实验设计。此外，观察到在22个90-mm-培
5
养皿中接种总共5 × 10 细胞，每皿接种不同浓度并且在接种后4天添加潮霉素100 μg/ml，是收集最大数量细胞克隆的最佳条件。在360个已计数的克隆中仅有3个，PK-7、PK-17和PK-18，表达p24gag超过100 pg/ml的设定阈值。克隆的DNA印迹分析显示出每个克隆含有2拷贝的大小正确的载体(图2a)。为了排除残留AAV-rep78质粒DNA的可能整合，对PK-7 gDNA进行rep78特异性PCR，检测无阳性信号(图3b)。通过释放在培养基中的3个PK克隆及其匹配病毒样颗粒(VLP)的蛋白印迹，监测源自GPR盒的HIV-1蛋白表达模式。所有病毒蛋白都经过适当处理，大小正确并按正确的相对比例(图2b)。选择未来工作用PK克隆，即通过计算从这3个克隆中产生的LV对SupT1细胞的效力，在用VSV-G质粒和第3代转移载体SIN-eGFP共转染之后(表1)。值得注意的是，尽管经瞬时转染而产生的对照HEK293T LV的滴度是PK-7和PK-18的LV滴度的5倍，但其感染性却与PK LV的几乎相同，表明就“质量”观点来看，PK克隆产生的LV相当于经常规方法产生的那些(表1)。尽管PK-7和PK-18的LV的效力相似，但选择PK-7克隆用于进一步遗传操作，因为它的形态学、生长、存活率和p24gag生产值评分优于PK-18克隆(表1)。
5
养皿中接种总共5 × 10 细胞，每皿接种不同浓度并且在接种后4天添加潮霉素100 μg/ml，是收集最大数量细胞克隆的最佳条件。在360个已计数的克隆中仅有3个，PK-7、PK-17和PK-18，表达p24gag超过100 pg/ml的设定阈值。克隆的DNA印迹分析显示出每个克隆含有2拷贝的大小正确的载体(图2a)。为了排除残留AAV-rep78质粒DNA的可能整合，对PK-7 gDNA进行rep78特异性PCR，检测无阳性信号(图3b)。通过释放在培养基中的3个PK克隆及其匹配病毒样颗粒(VLP)的蛋白印迹，监测源自GPR盒的HIV-1蛋白表达模式。所有病毒蛋白都经过适当处理，大小正确并按正确的相对比例(图2b)。选择未来工作用PK克隆，即通过计算从这3个克隆中产生的LV对SupT1细胞的效力，在用VSV-G质粒和第3代转移载体SIN-eGFP共转染之后(表1)。值得注意的是，尽管经瞬时转染而产生的对照HEK293T LV的滴度是PK-7和PK-18的LV滴度的5倍，但其感染性却与PK LV的几乎相同，表明就“质量”观点来看，PK克隆产生的LV相当于经常规方法产生的那些(表1)。尽管PK-7和PK-18的LV的效力相似，但选择PK-7克隆用于进一步遗传操作，因为它的形态学、生长、存活率和p24gag生产值评分优于PK-18克隆(表1)。
[0095] 表1. 从PK克隆中产生的VSV-G假型LV的效力
[0096]
[0097] a对转导后3天的SupT1细胞计算滴度。细胞用VSV-G和SIN-eGFP质粒转染；
[0098] b粗体表示所选克隆。
[0099] 然后，通过定量LM-PCR、TaqMan PCR (图2c)和FISH技术(图2d)，深入地表征侧翼为ITR的GPR盒在PK-7克隆中的整合。为了对整合位点精确作图，进行LM-PCR研究，其集中在2号染色体2q32.1上的断裂点(图2c)。通过用特异性GPR探针的原位杂交而证实了该结果，根据臂长和着丝粒位置而显示出2号染色体中的单个点(图2d)。为了证实该定位工作，使用HOX4探针，该探针已知作图到染色体2q31.2中。因为HEK293T细胞是三倍体，所以在所有3条2号染色体中确实都检测到HOX4 (图2d)。最终，通过定量TaqMan PCR证实整合了2拷贝，并通过合适引物设计的巢式PCR (图2e)证实这2拷贝呈尾-头的串联方向。尾-头的方向是天然构型，在整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV和大多数rAAV载体多连体的整合中也都观察到16。包含尾-头连接的扩增子的序列分析显示，包含第一盒的303-bp 3’ CMV启动子以及第一盒和第二盒的ITR和第二盒的完整5’ CMV启动子的910-bp片段都丢失(图2e, 红框)。大部分载体-细胞重组事件其实都发生在载体的ITR 序列内。这样的重排在PK-7细胞中导致第二盒的gag-pol基因未转录并可能导致第一盒的rev基因和hygro基因未转录。然而，值得一提的是，缺失的CMV启动子(图2e, 图例中间的灰色三角形)左侧的285-bp区仍含有TATA盒，这可能足以驱动rev基因和hygro基因的转录。总之，PK-7含有2个整合盒，其共同转录一个gag-pol基因以及rev基因和hygro基因中的一个或两个。
[0100] 为了证实PK-7克隆随时间的稳定性，在潮霉素存在或不存在时，将细胞培养350天，相当于约420次细胞倍增，并在每个细胞基础上测量p24gag产量(表2)。在潮霉素存在时，平均产量相当于15.34±8.47SD ng p24gag/1 × 106细胞，而在该抗生素不存在时则为6.70±3.51SD ng p24gag/1 × 106细胞(表2)。
[0101] 这种差异可能来自以下事实：潮霉素药物压力保持在“打开”hygro抗性基因转录的状态并因此也“打开”染色质。这可有利于gag-pol基因的更高转录。为了评价由PK-7克隆所产生的VLP是否有功能，甚至在数百次倍增之后，将PK-7细胞在p60和p102时用VSV-G包膜和SIN-eGFP转移载体共转染并对SupT1细胞计算LV效力。引人注意的是，在选择药物存在和不存在时所产生的LV的滴度和感染性在这样长时间之后仍然保持在正常水平(表2)。这些数据表明GPR盒没有遗传不稳定性，而无论药物压力存在与否，并允许我们在未来的表征中避免使用潮霉素。对于AAV-ITR介导的盒的整合稳定性而言，文献中没有可用的类似数据。唯一相关的信息是感染了野生型AAV血清型2 (AVV-2)的人骨髓衍生的成纤维细胞样细胞系(Ruddle’s Detroit 6细胞)以潜伏状态保持病毒序列长达至少4722,23
和118代 。值得注意的是，PK-7细胞存活至少102代。
和118代 。值得注意的是，PK-7细胞存活至少102代。
[0102] 表2. PK-7克隆随时间的稳定性
[0103]
[0104] a所表达的p24Gag水平，以ng/1 × 106细胞计；
[0105] bPK-7细胞用SIN-eGFP和VSV-G质粒转染之后产生的VSV-G假型LV的效力值，在转导后3天对SupT1细胞测试。
[0106] 实施例III: PK-7克隆在半稳定LV生产中的用途
[0107] 为了更好地确定来自PK-7克隆的半稳定LV生产是否在总体上相当于来自HEK293T细胞的瞬时LV生产，将这两种细胞类型用相同量的必需质粒转染并测量它们相应的LV对不同靶细胞的转染百分率和效力(表3)。在该条件下，用HEK293T细胞的11个实验的转染百分比的平均值为90.54±3.6 SEM，而用PK-7细胞的12个实验的平均值为91±5.3SEM，表明PK-7细胞维持它们的高水平转染能力。然后，在SupT1细胞中计算LV滴度，正如我们的标准参考细胞类型，脐带血衍生的CD34+ HSC和抗CD3/IL-2活化的脐带血单核细胞(在表3中记为T lymph.) (表3)。
[0108] 表3. 从PK-7克隆产生的VSV-G假型第三代和第二代LV对不同靶细胞类型的效力
[0109]a
[0110] 用SIN-eGFP或PΔN-Chim3和VSV-G包膜质粒转染PK-7细胞之后产生VSV-G假型LV；b
[0111] 用CMV-GPR、SIN-eGFP(或PΔN-Chim3)和VSV-G包膜质粒转染HEK-293T细胞之后产生VSV-G假型LV；
[0112] 转导后3-5天对靶细胞测试LV。
[0113] 引人注意的是，产自PK-7细胞的第3代 LV即SIN-eGFP的感染性比对照LV低大+约1-log和与之几乎相等，当分别对SupT1细胞和CD34 细胞计算滴度时，而对活化的T淋巴细胞则高半个log。产自PK-7细胞的第2代LV即PΔN-Chim3的感染性几乎等于对照+
LV的感染性，当对SupT1细胞或CD34 细胞或CEM A3.01细胞计算滴度时。总之，这些发现表明，PK-7克隆产生的LV在“质量上”等同于通过瞬时共转染的HEK293T细胞而产生的那些。PK-7在LV半稳定生产中的应用要考虑的一个非常重要的问题是PK-7克隆不丢失容易转染的能力。该特征在用包装构建体对293细胞进行遗传修饰和克隆之后经常丢失。
LV的感染性，当对SupT1细胞或CD34 细胞或CEM A3.01细胞计算滴度时。总之，这些发现表明，PK-7克隆产生的LV在“质量上”等同于通过瞬时共转染的HEK293T细胞而产生的那些。PK-7在LV半稳定生产中的应用要考虑的一个非常重要的问题是PK-7克隆不丢失容易转染的能力。该特征在用包装构建体对293细胞进行遗传修饰和克隆之后经常丢失。
[0114] 进行滴定实验以确定用于从PK-7细胞最佳生产LV的包膜质粒和转移载体的总DNA量。引人注意地发现，对SupT1细胞和CEM A3.01细胞系，甚至用DNA总量的不到三分之一(0.3 mg)就足以产生与用标准量的DNA (1 mg)所产生的LV的滴度类似的滴度。因此，在LV半稳定生产中用PK-7细胞代替HEK293T细胞，将会极大地降低GMP级质粒DNA的高成本。
[0115] 表4. 质粒DNA总量减少(小规模)
[0116]a
[0117] 用PΔN-eGFP载体和VSV-G包膜转染PK-7细胞之后产生的LV滴度。
[0118] 参考文献
[0119]
[0120]
[0121]