一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法

摘要

本发明公开了一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，包括如下步骤：（1）取待鉴定的烟草种子表面消毒；（2）烟草黑胫病菌的培养及其分生孢子悬浮液的制备；（3）烟草黑胫病菌毒素液的提取；（4）毒素液浸种后进行种子萌发，统计种子发芽率并进行抗性评价。本发明的方法操作简单、成本低、速度快、准确性高、适宜烟草育种研究中的黑胫病抗性鉴定。

权利要求

1.一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：（1）取待鉴定的烟草种子表面消毒；

（2）烟草黑胫病菌的培养及其分生孢子悬浮液的制备；

5

（3）烟草黑胫病菌毒素液的提取：将步骤（2）制备的分生孢子悬浮液稀释为1×10 ～6

5×10 个孢子含量，滤纸过滤，滤液高速离心，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得无菌的烟草黑胫病菌毒素液；

（4）将步骤（1）表面消毒后的烟草种子用步骤（3）提取的毒素液浸泡4-8h，然后将烟草种子移到琼脂水培养基上，保持在相对湿度90%-95%、光照强度为10001x-20001x、温度在18℃-25℃的条件下，7-10d后开始观察发芽情况，根据发芽率判断供试材料的抗性：发芽抑制率≥50%为感病品种，15%≤发芽抑制率在＜50%为中抗品种，发芽抑制率＜15%为抗病品种。

2.根据权利要求1所述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其特征在于：步骤（1）按如下方法操作：取待鉴定的烟草种子置于无菌培养皿中，用1%（w/v）硫酸铜溶液浸种5min，然后用无菌水冲洗3次。

3.根据权利要求1所述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其特征在于：步骤（2）按如下方法操作：将烟草黑胫病菌接种于燕麦固体培养基中，28℃培养7-14d，待菌丝长满整个培养皿后，取菌块加入到燕麦液体培养基中28℃振荡7-14d，得烟草黑胫病菌分生孢子悬浮液。

4.根据权利要求3所述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其特征在于：所述的燕麦固体培养基的制作方法为：在1000mL无菌水中加入33g燕麦片，煮至燕麦片开花状，加18g琼脂粉，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压120℃灭菌20min。

5.根据权利要求3所述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其特征在于：所述的燕麦液体培养基的制作方法为：在1000mL无菌水中加入33g燕麦片，煮至燕麦片开花状，定容

1000mL，分装入500mL三角瓶中高压120℃灭菌20min。

6.根据权利要求1所述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其特征在于：步骤（3）中所5

述的分生孢子悬浮液被稀释至9×10 孢子含量。

7.根据权利要求1所述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其特征在于：步骤（4）中所述的琼脂水培养基的制作方法为：在1000mL无菌水中加入18g琼脂粉，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压120℃灭菌20min。

说明书

一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，具体而言，涉及一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法。

背景技术

[0002] 烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var.nicotiane）是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，是制约我国各烟区烟叶生产的最重要因素，可以危害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草。1896年，Bred de Haan在爪哇首次发现烟草黑胫病。1924年，Cook在波多黎再吃观察到这个病害。此后，世界各主要产烟区陆续报道了烟草黑胫病发生为害情况，现该病已遍布温带、亚热带和热带各烟区。20世纪40年代，病区扩大到黄河流域、长江流域及珠江流域的各产烟省，在这些地区烟草黑胫病均已造成严重损失。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76373hm2，产量损失2869.26万kg，产值损失超过1.23亿元，仅次于烟草病毒病。生产实践表明，防治黑胫病最经济、有效、环保的措施就是选育抗病品种，抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种、抗性监测等工作中重要的一环。因此，准确有效的抗性鉴定方法对烟草抗性材料的鉴定和抗病品种的选育是至关重要的。

[0003] 在以往黑胫病抗性材料的鉴定中，一般采用苗期接种鉴定和/或病圃抗性鉴定，主要根据黑胫病的发病特征——植株的萎蔫率来确定材料的抗性水平。其中，病圃抗性鉴定主要应用于烟草成株鉴定，其鉴定结果易受地块菌落浓度的均匀性及其气候影响，导致不同年份之间的鉴定结果存在一定的差异，而且病圃鉴定也因面积有限，无法同期对大批量的材料进行抗性鉴定；苗期接种鉴定在一定程度上克服了病圃鉴定的局限性，但在应用过程中由于接种苗龄、接种方法、病菌株系以及培养环境的不同，鉴定结果往往也不一致。上述两种方法的鉴定结果只是反映了烟草苗期或成株期对黑胫病菌的耐受能力，而并非是该品种或材料的真正抗性水平，原因在于：在烟草的种植过程中往往存在潜性感染现象，即黑胫病菌通过植株根部伤口，入侵植株后在茎秆等维管束内不断扩繁延伸，只有当植株体内菌落数达到一定时，植株才表现出萎蔫症状；同时，不同抗性材料对抑制黑胫病菌扩繁延伸的能力也是不同的，故单纯依靠植株病症表现来判断，还无法真实评价出不同材料的抗性水平。

发明内容

[0004] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低、速度快、准确性高、适宜烟草育种研究中的黑胫病抗性鉴定方法，以加速烟草抗黑胫病新品种的选育或突变基因的筛选与推广应用。

[0005] 为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

[0006] 一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，包括如下步骤：

[0007] （1）取待鉴定的烟草种子表面消毒；

[0008] （2）烟草黑胫病菌的培养及其分生孢子悬浮液的制备；这里的烟草黑胫病菌为烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae(vom Breda de Hean)Tuker）（0号小种）。

[0009] （3）烟草黑胫病菌毒素液的提取：将步骤（2）制备的分生孢子悬浮液稀释为5 6
1×10 ～5×10 个孢子含量，滤纸过滤，滤液高速离心，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得无菌的烟草黑胫病菌毒素液；

[0010] （4）将步骤（1）表面消毒后的烟草种子用步骤（3）提取的毒素液浸泡4-8h，然后将烟草种子移到琼脂水培养基上，保持在相对湿度90%-95%、光照强度为10001x-2000lx、温度在18℃-25℃的条件下，7-10d后开始观察发芽情况，根据发芽率判断供试材料的抗性：发芽抑制率≥50%为感病品种，15%≤发芽抑制率在＜50%为中抗品种，发芽抑制率＜15%为抗病品种。

[0011] 上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中步骤（1）按如下方法操作：取待鉴定的烟草种子置于无菌培养皿中，用1%（质量体积百分比）硫酸铜溶液浸种5min，然后用无菌水冲洗3次。

[0012] 上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中步骤（2）按如下方法操作：将烟草黑胫病菌接种于燕麦固体培养基中，28℃培养7-14d，待菌丝长满整个培养皿后，取菌块加入到燕麦液体培养基中28℃振荡7-14d，得烟草黑胫病菌分生孢子悬浮液。

[0013] 上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中所述的燕麦固体培养基的制作方法为：在1000mL无菌水中加入33g燕麦片，煮至燕麦片开花状，加18g琼脂粉，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压120℃灭菌20min。

[0014] 上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中所述的燕麦液体培养基的制作方法为：在1000mL无菌水中加入33g燕麦片，煮至燕麦片开花状，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压120℃灭菌20min。

[0015] 上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中步骤（3）中所述分生孢子悬浮液被5
稀释至9×10 孢子含量。

[0016] 上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中步骤（4）中所述的琼脂水培养基的制作方法为：在1000mL无菌水中加入18g琼脂粉，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压120℃灭菌20min。

[0017] 目前对烟草黑胫病抗性鉴定常用方法为移栽后接种鉴定，这种方法存在的不足为：历时周期长，田间鉴定往往一年只能完成一批次；自然条件下温度湿度不易控制，年代不同时鉴定结果有所差异；占地面积大；试验费用高等。本发明涉及的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法克服了以上不足，鉴定一批次只需10-14天即可完成；且在光照培养箱中进行，对温度、湿度进行控制，即发病条件不存在差异；大大节省了人力物力。该方法完全实现了高通量、快速鉴定烟草黑胫病的目的。

具体实施方式

[0018] 以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

[0019] 烟草突变品种对黑胫病抗性鉴定与评价：以下实施例中供试材料为红大和中烟100经EMS（甲基磺酸乙酯）诱变获得（表1），所用的黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae(vom Breda de Hean)Tuker）（0号小种）由中国农业科学院烟草研究所提供，其余试剂均为市售产品。所用仪器光学显微镜、光照培养箱、人工气候箱均为普通配置。

[0020] 燕麦固体培养基的制作方法：在1000mL无菌水中加入33g燕麦片，煮至燕麦片开花状，加18g琼脂粉，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压灭菌20min（120℃）。

[0021] 燕麦液体培养基的制作方法：在1000mL无菌水中加入33g燕麦片，煮至燕麦片开花状，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压灭菌20min（120℃）。

[0022] 琼脂水培养基的制作方法：在1000mL无菌水中加入18g琼脂粉，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压灭菌20min（120℃）。

[0023] （1）烟草种子表面消毒：取待鉴定的烟草种子置于无菌培养皿中，用1％硫酸铜浸种5min，然后用无菌水冲洗3次。

[0024] （2）烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae(vom Breda de Hean)Tuker）（0号小种）培养及其分生孢子悬浮液的制备：用燕麦固体培养基培养烟草黑胫病菌，将田间采集纯化保存的黑胫病菌于超净工作台接种于固体培养基中，28℃燕麦固体培养基培养7-14d，待菌丝长满整个培养皿后，取1cmⅹ1cm菌块加入到燕麦液体培养基中28℃振荡7-14d。

[0025] （3）将步骤（2）获得的分生孢子贮备液于电子显微镜下观察孢子浓度，将其稀释为5
9×10 个孢子含量，用滤纸过滤，将滤液10000rpm/min离心10min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得无菌的毒素液；

[0026] （4）分别用5mL毒素液、5mL无菌水浸25粒烟草种子4-8h后移到琼脂水培养基上，将该材料保持在相对湿度90%-95%、光照强度为10001x-20001x、温度在18℃-25℃的条件下，7-10d后开始观察发芽情况，根据发芽率和长势判断供试材料的抗性，发芽抑制率≥50%为感病品种，15%≤发芽抑制率在＜50%为中抗品种，发芽抑制率＜15%为抗病品种。

[0027] 通过上述毒素液浸泡后对发芽率的影响程度得出19个不同抗性材料的鉴定结果，结果为MZE2-195在19个材料中抗性水平最低，MZE2-574、MZE2-436和MZE2-512次之，为高感材料。认为MZE2-901在19个材料中抗性水平最高，MZE2-134和MZE2-77次之，为高抗材料。

[0028] 表1供试材料经处理后发芽数及发芽抑制率

[0029]

[0030] 在上述鉴定的结果上，对筛选出的MZE2-901、MZE2-134和MZE2-773个抗性水平高的材料进行假植、移栽，待缓苗后进行病圃抗性鉴定，以验证这3个抗性材料成株对黑胫病的耐受能力。鉴定结果表明MZE2-901、MZE2-134和MZE2-77抗性水平和毒素浸泡鉴定结果一致，为高抗品种。

[0031] 采用病圃抗性鉴定的方法和评价标准如下：

[0032] 将历年烟草黑胫病发病病圃作为黑胫病鉴定病圃；