紫草素类化合物在制备抗补体药物中的用途

摘要

本发明属制药领域，涉及紫草素类化合物在制备抗补体药物中的新用途。本发明从紫草科紫草属植物新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.)乙酸乙酯部位提取紫草素类化合物并通过体外抗补体活性评价试验证实其对补体系统的经典途径和旁路途径具有较强的抑制作用。所述化合物对补体系统的经典途径抑制作用的CH50为0.16±0.02～0.63±0.09mM，对旁路途径抑制作用的AP50为0.24±0.04mM～0.41±0.04mM。所述化合物可用于制备抗补体药物。

权利要求

1.具有下述结构通式的紫草素类化合物在制备抗补体药物中的用途，当R＝CH2CCH3＝C(CH3)2时，化合物为2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)；

当R＝CH3时，化合物为乙酰紫草素(3)。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)对补体系统的经典途径有抑制作用，50％溶血所需2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)浓度(CH50)为0.16±0.02mM。

说明书

紫草素类化合物在制备抗补体药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明属中药制药领域，涉及紫草素类化合物在制备抗补体药物中的新用途，所述的紫草素类化合物包括化合物紫草素(1)、2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)和乙酰紫草素(3)。

背景技术

[0002] 补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。目前对此类疾病尚无理想的治疗药物。有关抗补体药物的研究多年来一直是世界药学研究的热点和重点。研究显示，直接从天然产物中研究开发补体抑制剂的成本低，并且大多数活性成分作为天然产物的一部分可以直接被机体消化吸收，因此近年来从天然来源中寻找新的具有抗补体活性的药物受到人们越来越多的关注。国内外的学者从包括海洋生物在内的天然产物中分离得到大量的具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。

[0003] 新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst)为紫草科(Boraginaceae)紫草属(Arnebia)植物，多年生草本。新疆紫草的干燥根味苦，性寒。有凉血活血、清热解毒、滑肠通便的功能，可用于预防麻疹、热病斑疹、黄疸、紫癜、吐衄尿血、血淋、血痢、痈肿疮毒、丹毒、湿疹、烧伤、热结便秘。近年来的研究发现其具有抗癌、抗炎、抗菌等作用。临床可用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化(腹水)；扁平疣、银屑病等皮肤病；局部应用治疗烧伤和促进伤口愈合；滴眼剂用于治疗单疱病毒性角膜炎，对上皮型树枝状和浅实质层树枝状角膜炎有一定疗效；油剂用于治疗婴儿皮炎、湿疹、阴道炎、子宫颈炎等。近年来对紫草的化学成分的研究主要集中于分离及结构鉴定上，从中分离得到了一些苯醌类、单萜紫草酚类等化合物，迄今为止尚未见对补体系统具有抑制作用的化合物的报道。临床实践中急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂问世。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供新的具有抗补体活性的物质，具体涉及紫草素类化合物，特别涉及其中的化合物紫草素(1)、2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)和乙酰紫草素(3)。

[0005] 本发明的进一步目的是提供上述的紫草素类化合物在制备抗补体药物中的用途。

[0006] 本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中的抗补体活性物质进行研究，从紫草科(Boraginaceae)紫草属(Arnebiae)植物新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst)干燥根中的醇提取物的乙酸乙酯部位分离得到紫草素类化合物，包括化合物紫草素(1)、2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)和乙酰紫草素(3)，并证实其对补体系统的经典途径和旁路途径均有抑制作用。

[0007] 本发明的活性紫草素类化合物具有下述结构通式的化学结构：

[0008]

[0009] 其中，当R＝CH＝C(CH3)2时，化合物为紫草素(1)；当R＝CH2CCH3＝C(CH3)2时，化合物为2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)；当R＝CH3时，化合物为乙酰紫草素(3)。

[0010] 本发明所述的紫草素类化合物通过下述方法制备：

[0011] 新疆紫草根粗粉20kg，室温下以95％乙醇反复冷浸、渗漉提取数次后，减压回收溶剂，得到浸膏820g，浸膏悬浮于蒸馏水中，以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物420g。乙酸乙酯萃取物180g经硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚(60～90℃)-丙酮、丙酮梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱，SephadexLH-20纯化和制备色谱，分离得到化合物紫草素(1)，2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)和乙酰紫草素(3)。

[0012] 本发明中，紫草素(1)：暗红色粉末，1H NMR(400MHz，CDCl3，ppm)：δ12.51(1H，d，J＝6.2Hz)，12.35(1H，d，J＝6.2Hz)，8.19(2H，s)，8.11(1H，s)，5.36(IH，t，J＝7.2Hz)，5.19(1H，s)，2.55(2H，m)，2.08(3H，t，J＝0.9Hz)，1.86(3H，t，J＝0.9Hz)，1.61(3H，s)，
1.51(3H，s)。

[0013] 本发明中，2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)：红色油状物，1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)：δ12.40(1H，s，8-OH)，12.24(1H，s，5-OH)，7.18(2H，s，H-6，7)，7.01(1H，s，H-3)，6.01(1H，t，J＝7.3，H-11)，5.12(1H，t，J＝6.5，H-13)，2.96，3.00(2H，dd，H-12)，2.00(3H，s，H-23)，1.68，1.53，1.30，1.25(Me×4，each s，H-15，16，21，22)。

[0014] 本发明 中，乙酰 紫草素(3)：红 色油状 物，1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)：δ12.59(1H，s，8-OH)，12.43(1H，s，5-OH)，7.19(2H，s，H-6，7)，6.99(1H，s，H-3)，6.03(1H，t，J＝7.3Hz，H-11)，5.15(1H，t，J＝6.5，H-13)，2.62，2.49(2H，m，H-12)，2.14(3H，s，H-18)。

[0015] 上述紫草素类化合物经体外经典途径和旁路途径抗补体活性评价试验，结果证实，所述化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有显著抑制作用(如表1所示)。其中，2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)对补体系统的经典途径有最强的抑制作用，50％溶血所需2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)浓度(CH50)为0.16±0.02mM，与阳性对照肝素作用强度相当；紫草素(1)对补体系统的旁路途径有最强的抑制作用，50％溶血所需紫草素(1)浓度(AP50)为0.24±0.04mM，较阳性对照肝素作用稍弱。

[0016] 本发明的紫草素类化合物可作为药物活性成分，进一步制备抗补体药物。

[0017] 表1是化合物1～3对补体系统经典途径(CH50)和旁路途径抑制作用(AP50)的数据。

[0018] 表1

[0019]

[0020] aμg/ml，NA无活性。附图说明：

[0021] 图1是新疆紫草乙酸乙酯部位所得紫草素类化合物1-3提取分离流程图。

具体实施方式

[0022] 实施例1制备紫草素类化合物

[0023] 新疆紫草干燥根20kg，粗粉于室温下以95％乙醇反复冷浸、渗漉提取数次后，减压回收溶剂，得到浸膏820g，浸膏悬浮于蒸馏水中，以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物420g。取乙酸乙酯萃取物180g，经硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚(60～90℃)-丙酮、丙酮梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱层析，SephadexLH-20纯化，分离得到化合物紫草素(1)，2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)和乙酰紫草素(3)，具体步骤如下：

[0024] 1、石油醚-丙酮(10∶1)洗脱所得流份，经反复柱色谱，流份经SephadexLH-20纯化，氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，得到化合物(1)(7mg)。采用波谱学方法分析，其结构确定为紫草素。

[0025] 2.石油醚-丙酮(10∶1)洗脱所得流份，以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)为展开剂，制备色谱，得到(2)(4mg)。采用波谱学方法分析，其结构确定为2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素。

[0026] 3.石油醚-丙酮(10∶1)洗脱所得流份，硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(3∶1)为洗脱剂，所得流份经制备色谱，以石油醚-丙酮(5∶1)为展开剂，化合物(3)(21mg)。采用波谱学方法分析，其结构确定为乙酰紫草素。

[0027] 实施例2体外抗补体经典途径试验

[0028] 取补体(豚鼠血清)0.1ml，加入BBS配制成1∶5溶液，用BBS对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取1∶1000溶血素、各浓度补体及2％SRBC各0.1ml溶于0.3ml BBS中，混匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1ml 2％SRBC溶于0.5ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。分别取临界浓度的补体与化合物紫草素(1)，2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)和乙酰紫草素(3)混匀，于37℃预水浴10min后，加入适量BBS、溶血素和2％SRBC。
将每管37℃水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置化合物对照组、补体组和全溶血组。将本发明化合物吸光度值扣除相应化合物对照组吸光度值后计算溶血率。以本发明化合物浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。计算CH50值。结果显示，所述化合物对补体系统的经典途径有显著抑制作用(如表1所示)。其中，2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)对补体系统的经典途径有最强的抑制作用，50％溶血所需2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)浓度(CH50)为0.16±0.02mM，与阳性对照肝素作用强度相当。

[0029] 实施例3体外抗补体旁路途径试验

[0030] 取补体(人血清)0.2ml，加入AP稀释液配制成1∶5稀释溶液，并对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5％RE 0.20ml，混匀，37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，在
5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。
实验同时设置全溶血组(0.20ml 0.5％RE溶于0.3ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。分别取确定的临界浓度的补体与化合物紫草素(1)，2，3-二甲基-2-戊烯酰紫草素(2)和乙酰紫草素(3)混匀，于37℃预水浴10min后，加入0.2ml 0.5％RE。将每管37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，5000rpm、4℃，离心10min后分别取每管上清
0.2ml于96孔板，405nm下测定其吸光度。实验同时设置化合物对照组、补体组和全溶血组。
将本发明化合物吸光度值扣除相应化合物对照组吸光度值后计算溶血率。以本发明化合物浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算AP50值。结果显示，所述化合物对补体系统的旁路途径均有显著抑制作用(如表1所示)。其中，紫草素(1)对补体系统的旁路途径有最强的抑制作用，50％溶血所需紫草素(1)浓度(AP50)为0.24±0.04mM，较阳性对照肝素作用稍弱。