来源于硅藻的与植物氮利用和生长相关的蛋白质及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一个来源于硅藻的与植物生长相关的蛋白质及其编码基因与应用。该蛋白质的名称为AMT，是如下a）或b）的蛋白质：a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；b）将SEQ ID No.2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植株氮素利用相关的由a）衍生的蛋白质。实验证明，在缺氮的条件下，转AMT基因水稻的株高、分蘖数和单株籽粒重显著高于受体水稻。说明AMT基因能够显著提高转基因水稻对氮的利用效率，该基因将在植物氮肥吸收领域及抗低氮植物品种的繁育工作中发挥重要作用，应用前景广阔。

权利要求

1.一种蛋白，是氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.1的第7-1548位核苷酸的DNA分子。

4.下述1）-4）中的任一种生物材料：

1）含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；

2）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体；

3）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物；

4）含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。

5.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4所述的生物材料在调控植物对氮的利用和/或调控植物生长中的应用；所述植物为水稻。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控植物生长为A至C中的至少一种：A、调控水稻的单株籽粒重；

B、调控水稻的分蘖数；

C、调控水稻的株高。

7.培育转基因水稻的方法，包括向受体水稻中导入权利要求3所述的核酸分子，得到对缺氮的耐受性高于所述受体水稻和/或生长高于所述受体水稻的转基因水稻；

所述生长高于所述受体水稻的转基因水稻具有下述1）-3）中任一性状的转基因水稻：

1）单株籽粒重大于所述受体水稻；2）分蘖数大于所述受体水稻；3）株高大于所述受体水稻。

8.扩增权利要求2或3所述的核酸分子全长的引物对。

说明书

来源于硅藻的与植物氮利用和生长相关的蛋白质及其编码

基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及来源于硅藻的与植物氮利用和生长相关的蛋白质及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 长期以来，水稻育种多以高产、耐肥抗倒作为主要育种目标，在追求高产量的同时，导致氮肥施用量的大幅度增加。我国以占世界10%的耕地消耗了世界30%的氮肥。其中，水稻又是消耗氮肥量最多的，占全国总施氮量的24%左右。按中国水稻常年种植面积3000万公顷计算，每年至少浪费氮肥180万吨，这不仅提高了农民水稻种植的投资成本，导致增产不增收，而且还严重地污染了环境。据统计，长江、黄河和珠江每年输出的溶解态无机氮达到97.5万吨，其中90%来自农业，化肥氮占了50%。这对土壤、水源、自然环境所造成的污染，已经到了极其严峻的地步。如能克隆到在低氮条件下能够促进水稻生长的基因，将为解决水稻生产上氮肥过量施用造成水体富营养化、严重污染环境、浪费社会资源等问题奠定物质基础。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一个与植物氮利用和/或生长相关的蛋白质及其编码基因与应用。

[0004] 本发明所提供的蛋白质，名称为AMT，来源于筒柱藻(Cylindrothecafusiformis)，是如下a）或b）的蛋白质：

[0005] a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

[0006] b）将SEQ ID No.2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物氮利用和/或生长相关的由a）衍生的蛋白质。

[0007] 其中，SEQ ID No.2由513个氨基酸残基组成。

[0008] 为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0009] 表1标签的序列

[0010]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0011] 上述（b）中的AMT可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的AMT的编码基因可通过将SEQ ID No.1的第7-1548位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0012] 编码AMT的核酸分子也属于本发明的保护范围。

[0013] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0014] 所述核酸分子具体可为如下1）-5）中任一所示的基因：

[0015] 1）编码AMT的DNA分子；

[0016] 2）其编码序列是SEQ ID No.1的第7-1548位位核苷酸的DNA分子；

[0017] 3）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码AMT的DNA分子；

[0018] 4）与1）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码AMT的DNA分子；

[0019] 5）与1）至4）中任一所述DNA分子反向互补的DNA分子。

[0020] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

[0021] 其中，SEQ ID No.1由1557个核苷酸组成，其编码序列是第7-1548位，编码SEQID No.2所示的蛋白质。

[0022] 下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

[0023] 1）含有编码AMT的核酸分子的表达盒；

[0024] 2）含有编码AMT的核酸分子的重组载体；

[0025] 3）含有编码AMT的核酸分子的重组微生物；

[0026] 4）含有编码AMT的核酸分子的转基因细胞系。

[0027] 上述生物材料中，1）所述的含有编码AMT的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达AMT的DNA，该DNA不但可包括启动AMT基因转录的启动子，还可包括终止AMT转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。2）所述的含有编码AMT的核酸分子的重组载体具体可为在载体pUT3301的多克隆位点插入AMT编码基因得到的表达AMT的重组表达载体。3）所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

[0028] 本发明还保护编码AMT的核酸分子、编码AMT的核酸分子或上述任一种生物材料在调控植物氮利用和/或生长中的应用。

[0029] 上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

[0030] 上述应用中，所述调控植物生长为A至C中的至少一种：

[0031] A、调控水稻的单株籽粒重；

[0032] B、调控水稻的分蘖数；

[0033] C、调控水稻的株高。

[0034] 上述应用中，所述调控植物生长为在缺氮条件下调控植物生长。所述缺氮是指使受体水稻出现缺氮症状的氮素营养条件。

[0035] 本发明还提供了利用AMT基因培育转基因水稻的方法。

[0036] 本发明所提供的培育转基因水稻的方法，包括向受体水稻中导入AMT基因，得到对缺氮的耐受性高于所述受体水稻和/或生长高于所述受体水稻的转基因水稻；

[0037] 所述生长高于所述受体水稻的转基因水稻具有下述1）-3）中任一性状的转基因水稻：1）单株籽粒重大于所述受体水稻；2）分蘖数大于所述受体水稻；3）株高大于所述受体水稻。

[0038] 上述培育转基因水稻的方法中，所述转基因水稻和所述受体水稻从播种至4叶1心期之前在正常条件下生长，从4叶1心期至成熟的整个时期均在缺氮条件下生长。

[0039] 所述缺氮是指使受体水稻出现缺氮症状的氮素营养条件。

[0040] 其中所述AMT基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

[0041] 1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述AMT基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

[0042] 2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

[0043] 3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

[0044] 4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

[0045] 5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV，MCMV和AMV）。

[0046] 所述AMT基因可通过AMT基因表达盒或含有所述AMT基因表达盒的AMT基因表达载体导入目的植物。

[0047] 本发明中所述AMT基因表达盒均可含有所述AMT基因和启动所述AMT基因转录的启动子。本发明中所述AMT基因表达盒均指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.2所示的AMT的DNA，该DNA不但可包括启动所述AMT基因转录的启动子，还可包括终止所述AMT基因转录的终止子。进一步，所述AMT基因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(″LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂
985
氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I )Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等 人Genes Dev.,5:141;Mogen 等 人 (1990)PlantCell2:1261；
Munroe等人（1990)Gene91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。在本发明的实施例中，所述AMT基因表达盒中启动所述AMT基因转录的启动子为Ubiquitin启动子，终止所述AMT基因转录的终止子为NOS终止子。

[0048] 其中，Ubiquitin启动子的核苷酸序列可为SEQ ID No.3或SEQ ID No.3的第7-1992位。SEQ ID No.3由1998个核苷酸组成，第1-6位为酶识别位点，第7-1992位为Ubiquitin启动子，第1993-1998位为酶识别位点。NOS终止子（T-NOS）的核苷酸序列可为SEQID No.4或SEQ ID No.4的第7-759位。SEQ ID No.4由765个核苷酸组成，第1-6位为酶识别位点，第7-759位为T-NOS，第760-765位为酶识别位点。

[0049] 可用现有的植物表达载体构建含有所述AMT基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

[0050] 在本发明的实施例中，所述AMT基因通过含有所述AMT基因表达盒的AMT基因表达载体导入目的植物。所述AMT基因表达载体是在载体pCAMBIA3301的多克隆位点插入AMT编码基因表达盒得到的表达AMT的重组表达载体pAMT3301。

[0051] 所述AMT基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

[0052] 所述方法还包括从导入SEQ ID No.2所示的AMT的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因植物的步骤。

[0053] 所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

[0054] 实验证明，在缺氮的条件下，转AMT基因水稻的株高、分蘖数和单株籽粒重显著高于受体水稻。说明AMT基因能够显著提高转基因水稻对氮的利用效率，该基因将在植物氮肥吸收领域及抗低氮植物品种的繁育工作中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

[0055] 图1为pU3301的HindⅢ和BamHI双酶切电泳图谱。

[0056] 1为λDNA/EcoRI+HindIII Marker；2为pU3301的HindⅢ和BamHI双酶切产物；箭头示Ubiquitin启动子片段。

[0057] 图2为pUT3301的BamHI和EcoRI双酶切电泳图谱。

[0058] 1为Quick-load1KDλDNA ladder；2为pUT3301的BamHI和EcoRI双酶切产物；箭头示T-NOS片段。

[0059] 图3为AMT基因的PCR扩增产物电泳图谱。

[0060] 1为Quick-load1KDλDNA ladder，2为没加模板的对照，3为AMT基因的PCR扩增产物。箭头示AMT基因的PCR产物。

[0061] 图4为pMD19-AMT的BamHI单酶切电泳图谱。

[0062] 1：λDNALadder；2：pMD19-AMT的BamHI单酶切结果。箭头示AMT基因片段。

[0063] 图5为pAMT3301的酶切电泳图谱。

[0064] 1为λDNA分子量标准；2：为SacI单酶切；3为BamHI单酶切。

[0065] 图6为pAMT3301的T-DNA部分结构示意图。

[0066] 图7为转pAMT3301的Basta抗性水稻植株的PCR检测电泳图谱。

[0067] 1：λDNAMarker；2至7：转pAMT3301的Basta抗性水稻植株PCR扩增；8：阴性对照；9：阳性对照，10：受体水稻（未转基因）PCR扩增。

[0068] 图8为转pAMT3301的AMT阳性转基因植株的GUS检测。

[0069] a,c,e:转pAMT3301的AMT阳性转基因植株；b,d,f：日本晴。

[0070] 图9为T1代转pAMT3301水稻的RT-PCR检测。

[0071] 1:λDNA/EcoRI+HindIII Marker;2:T1代 转pAMT3301 水 稻S21-2;3:T1代 转pAMT3301水稻S25-1;4:T1代转pAMT3301水稻S49-1;5:受体水稻（未转基因）。

[0072] 图10为T1代AMT基因阳性转基因日本晴水稻大田Basta抗性筛选图片。

具体实施方式

[0073] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0074] 下述实施例中的pUT3301按照如下方法构建：

[0075] 1、构建pU3301

[0076] 用HindⅢ和BamHI酶切SEQ ID No.3的Ubiquitin启动子片段插入pCAMBIA3301（北京拜尔迪生物技术有限公司）的HindⅢ和BamHI位点得到重组载体pU3301。SEQID No.3由1998个核苷酸组成，第1-6位为酶识别位点，第7-1992位为Ubiquitin启动子，第1993-1998位为酶识别位点。

[0077] pU3301经HindⅢ和BamHI双酶切得到约2000bp的Ubiquitin启动子片段（图1），说明pU3301是Ubiquitin启动子和Ω增强子片段插入pCAMBIA3301的HindⅢ和BamHI位点得到的重组载体。

[0078] 2、构建pUT3301

[0079] 用BamHI和EcoRI酶切SEQ ID No.4的T-NOS片段，将T-NOS片段插入pU3301的BamHI和EcoRI位点得到重组载体pUT3301。SEQ ID No.4由765个核苷酸组成，第1-6位为酶识别位点，第7-759位为T-NOS，第760-765位为酶识别位点。

[0080] pUT3301经BamHI和EcoRI双酶切得到765bp的T-NOS片段（图2），说明pUT3301是T-NOS片段插入pU3301的BamHI和EcoRI位点得到的重组载体。

[0081] 实施例1、AMT基因的克隆及功能验证

[0082] 一、AMT基因的克隆

[0083] 1.提取硅藻的总RNA

[0084] 使用Invitrogen公司的TRIZOLR Reagent试剂盒，参照试剂盒说明书提取筒柱藻(Cylindrothecafusiformis)的总RNA，具体方法包括以下步骤：

[0085] 1）取50-100mg筒柱藻(Cylindrothecafusiformis)，置于液氮中研磨成粉末，转入1.5mL离心管中。

[0086] 2）加入1mL TRIZOL Reagent充分混匀，室温放置5min。

[0087] 3）加200μl氯仿，振荡15s，室温放置2-3min，4℃、12000g离心10min。

[0088] 4）取上清，加入500μl异丙醇，室温放置10min，4℃、12000g离心5min，在离心管底部可见白色片状的RNA沉淀。

[0089] 5）弃上清，小心加入1mL70％乙醇，不要破坏RNA片状沉淀，5s后用加样器将液体全部吸出。

[0090] 6)室温放置5-10min使乙醇挥发(不要让其完全干，否则影响溶解性)，加入20μlDEPC水溶解沉淀，得到硅藻总RNA。

[0091] 2.反转录合成cDNA

[0092] 以步骤1获得的硅藻总RNA为模板，用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒，参照试剂盒说明书反转录成其cDNA，具体步骤如下：

[0093] 1）取筒柱藻(Cylindrothecafusiformis)总RNA10μl，加入1μl Gene Racer Oligo dT Primer，1μl dNTPs，1μl无菌蒸馏水。

[0094] 2）65℃温浴5min以去掉RNA二级结构，冰浴5min，短暂离心。

[0095] 3）依 次 加 入4μl5× 第 一 链 缓 冲 液，1μl0.1M DTT，1μl RNaseOutTM，TM1μlSuperScript III RT缓冲液至总体积为20μl，用移液器混匀。

[0096] 4）短暂离心后，50℃温浴50min。

[0097] 5）70℃温浴15min，冰上放置2min停止反应，短暂离心。

[0098] 6）加入1μl RnaseH，37℃温浴20min，短暂离心，即获得硅藻的cDNA，可立即用于PCR扩增或-20℃保存。

[0099] 3.目的基因的PCR扩增

[0100] 以步骤2获得的cDNA为模板，PA5：5’-GGATCCATGGCTGAGTTTGATAAC-3’和PA3：5’-GGATCCTTACTAGGCGGTGTCCTC-3’（引物PA5和PA3根据AMT1设计）为引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，65℃90s，72℃2min，30个循环后，72℃延伸10min。
反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，在1557bp处有一明显的扩增条带。

[0101] 凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，用载体pMD19-Tsimple试剂盒进行目的片段的克隆测序。将测序结果表明含有SEQ ID No.1的DNA分子（PCR产物）的重组载体命名为pMD19-AMT。AMT的cDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码序列是第7-1548位核苷酸，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质AMT。

[0102] pMD19-AMT的BamHI单酶切电泳图谱如图4所示，表明pMD19-AMT经BamHI单酶切得到1557bp的AMT基因片段和2692bp的载体片段。

[0103] 二构建AMT基因的植物表达载体

[0104] pMD19-AMT用BamHI单酶切，回收1557bp的AMT基因片段，pUT3301同样用BamHI单酶切，回收载体片段与AMT基因片段连接。用BamHI单酶切来验证AMT基因是否连入，用SacI验证基因插入的方向，如果切出1360bp的条带则说明AMT基因为正向插入。将AMT基因正向插入的重组载体命名为pAMT3301。pAMT3301的酶切验证结果如图5所示，pAMT3301经BamHI单酶切，得到1557bp的片段，经SacI单酶切得到1360bp的片段。pAMT3301的T-DNA部分如图6所示，AMT基因表达盒中启动AMT基因转录的启动子为Ubiquitin启动子，终止所述AMT基因转录的终止子为NOS终止子。

[0105] 三、水稻的遗传转化

[0106] 1、植物表达载体pAMT3301的转化根癌农杆菌AGLI

[0107] 采用电击转化法，在电场强度为18KV/cm，电容25F，电阻200Ω的条件下将pAMT3301植物表达载体导入根癌农杆菌AGLI（普如汀生物技术（北京）有限公司）感受态细胞中，将菌液涂布在含有卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）的YEB固体培养基上，28℃温度下暗培养2-3d，挑取单菌落进行PCR检测。得到含有pAMT3301的重组农杆菌AGLI/pAMT3301。同时按照上述方法制备含有pUT3301的重组农杆菌AGLI/pUT3301。

[0108] 2、水稻愈伤组织的诱导

[0109] 成熟的水稻日本晴种子去壳，于70%乙醇中浸泡1min，然后在1%次氯酸钠中消毒20min，之后再用1%次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗4-5次，最后用无菌滤纸吸去籽粒表面的水分，干燥后接种于诱导培养基上（MS+2，4-D4mg/L，pH5.8），28℃暗培养30d。取颗粒均匀，活力旺盛的遇上组织转入继代培养基（MS+2，4-D2mg/L，pH5.8），暗培养一周。

[0110] 3、重组农杆菌的培养

[0111] 将重组农杆菌AGLI/pAMT3301菌液或重组农杆菌AGLI/pUT3301均与涂布在YEB固体培养基（Kan50mg/L+Rif50mg/L）中，28℃暗培养2d。将长出的重组农杆菌刮入到悬浮培养基中（AAM+AS100μmol/L，pH5.2），28℃震荡培养2-3h，调节菌液浓度为0.12-0.15之间某一OD600值，以备转化之用。

[0112] 4、水稻愈伤组织的侵染与共培养

[0113] 将继代后的愈伤组织接入100ml三角瓶中，加入调制好的重组农杆菌菌液，浸泡20min，期间不断摇晃三角瓶。侵染后倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上，吸干表面菌液，随后接入到铺有无菌滤纸的共培养培养基上（N6+6BA2mg/L+AS100μmol/L，pH5.8），26℃暗培养三天。

[0114] 共培养后的愈伤组织先用无菌水冲洗3-5次，再浸于含头孢霉素（250mg/L）的无菌水中浸泡30min，然后将愈伤组织用无菌滤纸吸干，一定要使愈伤组织完全干燥。将干燥了的愈伤组织接种于筛选培养基S1上（N6+6BA2mg/L+Cef200mg/L+Basta50mg/L，pH5.8），28℃暗培养两周。挑取S1上存活的长势良好的愈伤组织置于S2培养基（N6+6BA2mg/L+Cef100mg/L+Basta50mg/L，pH5.8），继续暗培养，至长出新生抗性愈伤，约两周左右。

[0115] 5、预分化与分化

[0116] 将S2上长出的新生抗性愈伤组织置于预分化培养基（N6+6BA2mg/L+NAA1mg/L+ABA5mg/L+Cef50mg/L，pH5.8），28℃暗培养一周，随后接种于分化培养基上（N6+6BA2mg/L+NAA1mg/L，pH5.8），先暗培养一天，然后光下培养（光照12h/d），两周继代一次，直至长出抗性苗。

[0117] 6、转基因水稻苗的获得

[0118] 将分化培养过程中长出的抗性苗置于生根培养基（1/2MS0+Basta50mg/L，pH5.8），28℃光下培养（光照12h/d），待叶片长大后进行目的基因的PCR检测和GUS检测。

[0119] 四、转基AMT基因水稻的检测

[0120] 1、转基因水稻的PCR检测

[0121] 共获得52株转pAMT3301的Basta抗性植株，为验证是否已经将目标基因整合到受体材料的基因组中，提取了转基因水稻叶片的基因组DNA。利用PCR检测对其进行初步检测，结果显示共有17株转基因水稻呈PCR阳性（图7），得到1312bp的AMT基因片段，该17株转基因水稻为AMT基因阳性植株，转化率达32.7%。在进行AMT基因引物设计时，为了便于引物设计和PCR检测，在AMT基因内部设计了两条验证引物（pAM5：AGGCTATCAACACCTTCTC，pAM3：GCACTGGTCATGTCGTAGG），引物之间的序列长度为1312bp。

[0122] 2、转基因水稻的GUS检测

[0123] 由于植物表达载体pAMT3301的T-DNA上带有报告基因GUS，当T-DAN整合到植物染色体的合适位点上并能正确表达时GUS基因编码的β-葡糖酸苷酶（β-Glucuronidase）可将底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸（5-bromo-4-chlono-3-indoly-β-D-glucuronide，X-Gluc）分解产生的无色的吲哚衍生物，后者发生氧化二聚体作用产生蓝色沉淀，这种氧化反应在铁氰化钾/亚铁氰化钾的作用下可大大被促进，通过观察植物材料是否有蓝色出现，来确定转化的成功与否。具体步骤如下：

[0124] 1）将待测水稻叶片切成小片，置于1.5mL离心管中，加入适量GUS染色液（没过叶片即可），37℃避光培养过夜。

[0125] 2)取出GUS染色液，加入固定液FAA（甲醛、95%酒精、冰醋酸按10:85:4体积配制），固定15min后吸出固定液。

[0126] 3)无水乙醇脱色，至叶片绿色褪去，呈白的。

[0127] 4)肉眼观察，白色背景下呈蓝色的部分即为GUS表达位点。

[0128] 对所得到的17株AMT基因阳性植株进行GUS检测，转基因植株叶片均有蓝色斑点生成，非转基因植株日本晴叶片无任何颜色，两者有明显区别(图8)。

[0129] 3、转基因水稻的RT-PCR检测

[0130] 收获17株AMT基因阳性植株的种子，进行种植，取T1代转pAMT3301植株的水稻叶片在液氮中研磨成粉末，取约100mg组织粉末到放到预冷的1.5ml离心管中，加入1ml Trizol试剂，振荡混匀，加入200ul氯仿，振荡混匀。12000rmp，4°C，离心15min。小心吸取上清(约600ul)，放到另一无RNA酶的1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rmp，4°C，离心10min。弃去上清液，用75%的乙醇清洗RNA一次。吸除残余乙醇，晾至无乙醇味时，加入适量无RNase的水溶解RNA备用。利用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其cDNA，以PAR5、PAR3（PAR5：
TCATGTTGGACGCTTGTCGTG，PAR3：GTGAGATGGCATACTTGCAGC）为引物，进行RT-PCR扩增检测。
RT-PCR反应条件为：94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环后72℃延伸10min。可扩增出500bp的条带，条带大小与预期一致，这说明AMT基因已经整合到水稻的基因组中，并转录表达（图9）。结果共得到14个AMT基因已经整合到水稻的基因组的T1代转pAMT3301株系,株系编号分别为S21-1，S21-2，S21-3，S21-4，S21-5，S21-6，S21-7，S25-1，S49-1，S2，S3，S4，S5，S6.

[0131] 4、T1代AMT转基因水稻大田Basta抗性筛选。

[0132] 对步骤3得到的T1代AMT基因整合到水稻的基因组的14个转pAMT3301株系进行大田中的Basta抗性筛选。在水稻苗龄为三叶一心期喷500ppm Basta，一周后再喷一次500ppm Basta。结果表明获得的T1代AMT基因整合到水稻的基因组的14个转pAMT3301株系对Basta具有很好的抗性（图10）。收获对Basta具有抗性的T1代AMT基因整合到水稻的基因组的8个转pAMT3301株系S21-1，S21-2，S21-3，S21-4，S21-5，S21-6，S21-7，S25-1的种子（T2代转pAMT3301株系）进行下述步骤五的功能验证。

[0133] 另外，按照上述方法，将pUT3301导入日本晴，获得T2代转pUT3301日本晴水稻的种子（T2代转pUT3301株系），下述步骤五的功能验证。

[0134] 五、AMT基因的功能验证

[0135] 对T2转基因水稻进行缺氮实验，验证AMT基因的功能。选择一块生地，去掉表层30cm的耕作层的熟土，然后加入沙子，沙子的厚度为30cm。深耕40cm左右，将下层生土与沙子混合均匀后，作为试验田。试验田共设两个地块，两个地块相距10米。

[0136] 将受体水稻日本晴、8个T2代转pAMT3301株系（S21-1-3、S21-2-2、S21-3-4、S21-4-6、S21-5-3、S21-6-1、S21-7-5、S25-1-2）、1个T2代转pUT3301株系均在营养充足的大田中在正常条件下进行育秧，为保证所有的T2代转基因水稻苗都是转基因苗，在三叶一心期喷500ppm Basta，一周后再喷一次500ppm Basta进行筛选，获得Basta抗性植株植，至4叶1心期移栽入试验田。

[0137] 试验采用随机区组设计，共设三个重复区，每个重复区设12个小区，受体水稻共设2个小区，T2代转pUT3301株系共设2个小区，8个T2代转pAMT3301水稻株系各1个小区，每4个T2代转pAMT3301水稻株系小区与1个受体水稻小区和1个T2代转pUT3301株系小区相邻。每个小区内种植3行，每行10株。将处于4叶1心期的水稻幼苗分别移入不施氮肥的试验田和正常施氮肥的试验田。不施氮肥的试验田，至水稻成熟期间，除不施氮肥外，其它栽培管理条件均正常（磷肥、钾肥均正常施用，水分管理正常）。正常施氮肥的试验田，至水稻成熟期间，氮肥、磷肥、钾肥均正常施用，水分管理正常，其它栽培管理条件也正常。水稻成熟后，调查其株高、分蘖数、单株籽粒重，对获得的数据进行T检验分析。

[0138] 结果表明，正常施氮肥的试验田中，转pAMT3301水稻、转pUT3301水稻和受体水稻的平均株高、平均分蘖数和平均单株籽粒重均无显著差异（表2）。从4叶1心期至成熟，转基因水稻和受体水稻生长正常，均未出现缺氮症状。

[0139] 表2.正常施氮肥的试验田中水稻的株高、分蘖数和单株籽粒重

[0140]

[0141] 不施氮肥的试验田中，从4叶1心期至成熟，转基因水稻未表现出缺氮症状，叶片浓绿，分蘖正常。非转基因受体水稻表现出明显的缺氮症，在分蘖期叶片开始变黄，从叶片的先端开始黄化，分蘖数减少，抽穗期（花期）稻穗较短，籽粒小，且整个水稻生长期缩短，提前成熟。不施氮肥的试验田中，转pAMT3301水稻的株高、分蘖数和单株籽粒重与对照日本晴方差分析均极显著（表3），转pAMT3301水稻的株高、分蘖数和单株籽粒重显著高于对照日本晴。转pUT3301水稻和受体水稻的株高、分蘖数和单株籽粒重无显著差异。说明AMT基因能够显著提高转基因水稻对氮的利用效率，该基因将在植物氮肥吸收领域及抗低氮植物品种的繁育工作中发挥重要作用，应用前景广阔。

[0142] 表3、不施氮肥的试验田中水稻的株高、分蘖数和单株籽粒重

[0143]

[0144] 表1和表2中，S21-1-3、S21-2-2、S21-3-4、S21-4-6、S21-5-3、S21-6-1、S21-7-5、S25-1-2分别来源于步骤四的对Basta具有抗性的T1代AMT基因整合到水稻的基因组的转pAMT3301株系S21-1，S21-2，S21-3，S21-4，S21-5，S21-6，S21-7，S25-1。